Beer

1
Determinación de compuestos
carbonilicos en la cerveza
• Damian Alberto Lampert
• Nicolás Ariel Zona
• Rodrigo Fontan
• Manuel Vega Di Nezio

3
Abstract (I)Abstract (I)
una Microextraccion en fase sólida seguida por
cromatografía de gases y espectrometría de Masas,
con el fin de determinar 41 compuestos carbonilicos
que están presentes en la cerveza ya estacionada.
Vega Di Nezio-Zona-Lampert-Fontan. TAI 2013
Se realizó:

4
Se optimizo el método de derivatizacion en solución
mediante:
• La selección de la fibra
• La selección de la temperatura, el tiempo de
pre-incubacion y de extraccion
• La adicion de cloruro sodico
• La concentración de o-(2,3,4,5,6-pentafluorbenzil)
hidroxilamina (PFBHA)
Abstract (II)Abstract (II)

5
Abstract (III)Abstract (III)
Se determinó que:
• Ciertos compuestos como el (E)-Nonanal fueron mejor
extraídos mediante una derivatizacion en fibra.
• Otros compuestos como hidroxiacetona o 5-
hidroximetilfurfural resultaron ser detectados mas
fácilmente por el método de derivatizacion en solución.

7
Compuestos Carbonilicos
Compuesto
Aldehído
Cetona
Ácido carboxílico
Éster
Amida

8
A concentraciones Bajas
brindan sabor a las bebidas
alcohólicas.

9
Métodos

10Vega Di Nezio-Zona-Lampert-Fontan. TAI 2013
3 Estrategias se
pueden seguir

12
Instrumentación
• GC-MS (ThermoScientific)
• Columna Rtx-5SilMS (60m x0,25 µm I.D) con film de 1 µm.
Rango de temperatura: -60 a 330/350 ° C
Polidimetilsiloxano-divinilbenceno

13
Inyector @ 250°C. Inyección Splitless (Desorción 2
minutos)
Gradiente de temperatura:
• 2 minutos @ 60°C
• 60-165°C a 50°C/min
• 165-200°C a 2°C/min
• 200-260°C a 4°C/min
• 260-290°C a 5°C/min
• 6 minutos @ 290°C
Carrier: Helio 1,5mL/min

14
Detector
Dual Stage Quadrupole @ 250°C
Fuente de ionización: EI @ 70eV
Modo de detección TIC, barrido
de m/z desde 35 hasta 400.
Software Xcalibur.

15
Derivatización en fibra y HS SPME
La fibra PDMS-DVB se cargó
con PFBHA durante 10
minutos @ 45°C Y 250rpm
Vial con 10 mL de cerveza y
3,5g de NaCl se incubó durante
30 minutos @ 45°C y 250 rpm.

16
Optimización del procedimiento utilizando
derivatización en solución seguida de HS SPME
Head
Space
10mL Cerveza + 50µl de solución
100mg/L de p
fluorobenzaldehído (Patrón
interno) + PFBHA.
Se optimizaron los
parámetros detallados
en el abstract

17
VariablesVariables
experimentalesexperimentales

18
Revestimiento de la fibra SPME
La fibras evaluadas en este trabajo fueron:
• Polidimetilsiloxano (PDMS) 100 um
• Polidimetilsiloxano divinilbenceno (PDMS-DVB) 65 um
• Carboxen-polidimetilsiloxano (CAR-PDMS) 70 um
• Carbowax-divinilbenceno (CW-DVB) 70 um
• Dinivilbenceno-carboxen-polidimetilsiloxano
(DVB-CAR-PDMS) 50/30 um

19
Concentración de PFBHAConcentración de PFBHA
Se analizaron distintas cantidades de una solución de 20 g/L
con el fin de obtener la mejor eficiencia en la resolución de
los picos.
• 20 uL • 50 uL
• 100 uL • 250 uL
• 500 uL • 1000 uL
Parámetros fijos: 20 min. de pre-
incubación y 30 min. de extracción
a 50 ºC

20
Temperatura de extracciónTemperatura de extracción
Para estudiar el efecto de la temperatura en la extracción
de los compuestos carbonilicos derivatizados se probaron
siete temperaturas diferentes.
• 30 ºC • 40 ºC
• 45 ºC • 50 ºC
• 55 ºC • 60 ºC
• 70 ºC
Parámetros fijos: 20 min. de pre-
incubación y 30 min. de extracción.

21
Pre-incubaciónPre-incubación
Cuatro periodos de tiempo distintos fueron examinados bajo
continuo agite a 500 rpm para equilibrar la muestra.
• 5 min. • 10
min.
• 20 min. • 30 min.
Parámetros: 30 min. de extracción
a temperatura definida.

22
Tiempo de extracciónTiempo de extracción
Con el fin de encontrar el tiempo optimo,
se expuso la fibra en el HS de la muestra por
diferentes periodos de tiempo.
• 10 min. • 20 min.
• 30 min. • 40 min.
• 50 min. • 60 min.
Parámetros fijos: No definidos.

23
Adición de salAdición de sal
El efecto de la fuerza iónica en la eficiencia de la extracción
fue examinada a través de la adición de diferentes cantidades
de cloruro de sodio en el vial.
• 0 g • 1 g
• 2 g • 3 g
• 3,5 g
Parámetros fijos: Parámetros
definidos.

24
Discusión yDiscusión y
resultadosresultados

25
41 compuestos carbonilicos volátiles y no volátiles de
estructura variable fueron seleccionados con el fin de
explorar las características de la derivatizacion en fibra
simple y la derivatizacion en solución.

27
La técnica de derivatizacion en solución fue estudiada
mediante la evaluación de los efectos de los siguientes
parámetros en la eficiencia de la extracción.
• Revestimiento de la fibra
• Concentración de PFBHA
• Temperatura de extracción
• Tiempo de preincubación
• Tiempo de extracción
• Fuerza iónica
También una calibración y validación del método fue llevadas
a cabo, con lo cual se evaluaron la linealidad y la repetitividad
de la técnica.

28
Revestimiento de la fibra
Fue evidente que la fibra PDMS-DVB otorga la mejor extraccion
para estudiar los compuestos anteriormente mencionados
PDMS-DVB
PDMS
DVB-CAR-PDMS
CAR-PDMS
CW-DVB

Concentración de PFBHAConcentración de PFBHA

30
Aldehídos alifáticos
saturados (SLA) y aldehídos
ramificados
Cetonas y compuestos
acetilados
Concentraciones PFBHA
Concentraciones PFBHA
0,75 g/L de PFHBA

31
Temperatura de extracciónTemperatura de extracción

32
Compuestos volátiles
(cadena corta)
Demás compuestos
Tº
Tº
Para evitar la reacciones no deseadas y obtener la mayor
extraccion de todos los compuestos, la temperatura
seleccionada fue
60 ºC

33
Pre-incubaciónPre-incubación
Para permitir a los compuestos carbonilicos reaccionar con
el PFBHA y realizar los análisis posteriores, el tiempo optimo
de pre-incubacion fue de :
10 min.

34
Tiempo de extracciónTiempo de extracción

35
Adición de salAdición de sal

36
SOLO en Hidroxicarbonilos aumenta la eficiencia de
extracción si se aumenta la cantidad de cloruro sodico
debido a la disminución en la actividad de agua y la
consiguiente incapacidad de formar puentes H entre el
hidroxilo y el derivatizante.
Como consecuencia, la mejor extraccion se realizo SIN
el agregado de Cloruro de sodio
0 g NaCl

37
Calibración y Validación
Compuesto Rango (µg/L) R RSD (%)
Propanal 4-512 0,994 4,88
Decanal 0,07-256 0,909 4,18
2-butanona 1,6-204,8 0,996 3,85
2-acetilpirrol 18-128 0,989 12,84
Hidroxiacetona 40-5120 0,998 3,25
De un total de 41 compuestos carbonílicos analizados se
presentan 5. Aquí, decanal y 2-acetilpirrol presentan curvas
que no ajustan demasiado bien a la linealidad. En el caso del 2-
acetilpirrol se lo atribuye a un pico desconocido que lo solapa
parcialmente.
El rango de concentraciones en el cual se mantiene la
linealidad es muy amplio, siendo éste acorde y útil para las
concentraciones estándar que se encuentran en la cerveza.
RSD: relative standard deviation

38
Comparación técnicas de
derivatización (I)
Compuesto En solución En fibra
LOD(µg/L) LOQ(µg/L) LOD(µg/L) LOQ(µg/L)
Propanal 1,2 4,1 1,7 5,7
Decanal 0,021 0,071 0,005 0,017
2-butanona 0,024 0,08 ND ND
2-acetilpirrol 5,5 18,2 1178 3927
Hidroxiacetona 4,2 14,0 220 733
2-nonanona 0,255 0,849 0,046 0,152
Furfural 0,66 2,20 6,0 20,0
2,3-pentadiona 0,26 0,86 30 101

39
derivatización (II)
Compuesto Concentración (µg/L)
En Solución En Fibra
Propanal 4,56 (+/- 0,17) 5,72 (+/- 0,26)
Decanal 0,82 (+/- 0,04) 1,04 (+/- 0,09)
2-butanona 12,35 (+/- 0,79) ND
2-acetilpirrol 110,1 (+/- 8,6) ND
Hidroxiacetona 1600 (+/- 123) 1742 (+/- 197)
2-nonanona ND 0,067 (+/- 0,002)
Furfural 492,6 (+/- 22,5) 503 (+/- 19)
2,3-pentadiona 14,4 (+/- 0,6) ND

40
derivatización (III)

41
derivatización (IV)
• Mediante derivatizacion en solución se obtuvieron áreas
mas grandes, por lo que el limite de detección del método
es menor.
• Los compuestos mas polares se extrajeron mejor con
derivatizacion en solución, no así los apolares.
• La derivatizacion en fibra aporto áreas mucho menores,
y la ausencia de algunos picos.

42
derivatización (V)
Derivatización en fibra
• No logra detectar
moléculas de cadena
pequeña.
• No detecta 5-HMF ni
acetoína.
• No detecta dicetonas.
Derivatización en solución
• Áreas más grandes
• No logra detectar
moléculas de cadena
larga.
• Aumenta la eficiencia de
extracción de las cetonas.

44
Parámetros óptimos paraParámetros óptimos para
derivatizacion en soluciónderivatizacion en solución
• Una concentración de 0,75 g/L de PFBHA
• Sin agregado de NaCL.
• Pre-incubacion a 60 ºC durante 10 minutos
• Extraccion a 60 ºC durante 40 minutos con una fibra
PDMS-DVB

45
Mediante la calibración y validación
se demostró que el método de
derivatizacion en solución era sólido.

46
Derivatizacion en soluciónDerivatizacion en solución
Esta técnica fue mas eficiente para detectar
compuestos mas polares tanto carbonílicos como
cetonas. La detección de 5-HMF, acroleína,
hidroxiacetona, acetoina, glioxal y metilglioxal en la
cerveza fue remarcable.

47
Derivatizacion en fibra simpleDerivatizacion en fibra simple
Esta técnica demostró ser mucho mas afín para
compuestos apolares de cadenas largas como (E)-2-
nonanal

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