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Descripcion del proceso de cromatografia de gases acoplado a masas para identificar 41 compuestos carbonilicos presentes en la cerveza

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  1. 1. 1 Determinación de compuestos carbonilicos en la cerveza • Damian Alberto Lampert • Nicolás Ariel Zona • Rodrigo Fontan • Manuel Vega Di Nezio
  2. 2. 2 AbstractAbstract
  3. 3. 3 Abstract (I)Abstract (I) una Microextraccion en fase sólida seguida por cromatografía de gases y espectrometría de Masas, con el fin de determinar 41 compuestos carbonilicos que están presentes en la cerveza ya estacionada. Vega Di Nezio-Zona-Lampert-Fontan. TAI 2013 Se realizó:
  4. 4. 4 Se optimizo el método de derivatizacion en solución mediante: • La selección de la fibra • La selección de la temperatura, el tiempo de pre-incubacion y de extraccion • La adicion de cloruro sodico • La concentración de o-(2,3,4,5,6-pentafluorbenzil) hidroxilamina (PFBHA) Vega Di Nezio-Zona-Lampert-Fontan. TAI 2013 Abstract (II)Abstract (II)
  5. 5. 5 Abstract (III)Abstract (III) Se determinó que: • Ciertos compuestos como el (E)-Nonanal fueron mejor extraídos mediante una derivatizacion en fibra. • Otros compuestos como hidroxiacetona o 5- hidroximetilfurfural resultaron ser detectados mas fácilmente por el método de derivatizacion en solución. Vega Di Nezio-Zona-Lampert-Fontan. TAI 2013
  6. 6. 6 IntroducciónIntroducción
  7. 7. 7 Compuestos Carbonilicos Compuesto Aldehído Cetona Ácido carboxílico Éster Amida Vega Di Nezio-Zona-Lampert-Fontan. TAI 2013
  8. 8. 8 A concentraciones Bajas brindan sabor a las bebidas alcohólicas. Vega Di Nezio-Zona-Lampert-Fontan. TAI 2013
  9. 9. 9 Métodos Vega Di Nezio-Zona-Lampert-Fontan. TAI 2013
  10. 10. 10Vega Di Nezio-Zona-Lampert-Fontan. TAI 2013 3 Estrategias se pueden seguir
  11. 11. 11 ExperimentalExperimental
  12. 12. 12 Instrumentación • GC-MS (ThermoScientific) • Columna Rtx-5SilMS (60m x0,25 µm I.D) con film de 1 µm. Rango de temperatura: -60 a 330/350 ° C Polidimetilsiloxano-divinilbenceno Vega Di Nezio-Zona-Lampert-Fontan. TAI 2013
  13. 13. 13 Inyector @ 250°C. Inyección Splitless (Desorción 2 minutos) Gradiente de temperatura: • 2 minutos @ 60°C • 60-165°C a 50°C/min • 165-200°C a 2°C/min • 200-260°C a 4°C/min • 260-290°C a 5°C/min • 6 minutos @ 290°C Carrier: Helio 1,5mL/min
  14. 14. 14 Detector Dual Stage Quadrupole @ 250°C Fuente de ionización: EI @ 70eV Modo de detección TIC, barrido de m/z desde 35 hasta 400. Software Xcalibur.
  15. 15. 15 Derivatización en fibra y HS SPME La fibra PDMS-DVB se cargó con PFBHA durante 10 minutos @ 45°C Y 250rpm Vial con 10 mL de cerveza y 3,5g de NaCl se incubó durante 30 minutos @ 45°C y 250 rpm. Vega Di Nezio-Zona-Lampert-Fontan. TAI 2013
  16. 16. 16 Optimización del procedimiento utilizando derivatización en solución seguida de HS SPME Head Space 10mL Cerveza + 50µl de solución 100mg/L de p fluorobenzaldehído (Patrón interno) + PFBHA. Se optimizaron los parámetros detallados en el abstract Vega Di Nezio-Zona-Lampert-Fontan. TAI 2013
  17. 17. 17 VariablesVariables experimentalesexperimentales Vega Di Nezio-Zona-Lampert-Fontan. TAI 2013
  18. 18. 18 Revestimiento de la fibra SPME La fibras evaluadas en este trabajo fueron: • Polidimetilsiloxano (PDMS) 100 um • Polidimetilsiloxano divinilbenceno (PDMS-DVB) 65 um • Carboxen-polidimetilsiloxano (CAR-PDMS) 70 um • Carbowax-divinilbenceno (CW-DVB) 70 um • Dinivilbenceno-carboxen-polidimetilsiloxano (DVB-CAR-PDMS) 50/30 um Vega Di Nezio-Zona-Lampert-Fontan. TAI 2013
  19. 19. 19 Concentración de PFBHAConcentración de PFBHA Se analizaron distintas cantidades de una solución de 20 g/L con el fin de obtener la mejor eficiencia en la resolución de los picos. • 20 uL • 50 uL • 100 uL • 250 uL • 500 uL • 1000 uL Vega Di Nezio-Zona-Lampert-Fontan. TAI 2013 Parámetros fijos: 20 min. de pre- incubación y 30 min. de extracción a 50 ºC
  20. 20. 20 Temperatura de extracciónTemperatura de extracción Para estudiar el efecto de la temperatura en la extracción de los compuestos carbonilicos derivatizados se probaron siete temperaturas diferentes. • 30 ºC • 40 ºC • 45 ºC • 50 ºC • 55 ºC • 60 ºC • 70 ºC Vega Di Nezio-Zona-Lampert-Fontan. TAI 2013 Parámetros fijos: 20 min. de pre- incubación y 30 min. de extracción.
  21. 21. 21 Pre-incubaciónPre-incubación Cuatro periodos de tiempo distintos fueron examinados bajo continuo agite a 500 rpm para equilibrar la muestra. • 5 min. • 10 min. • 20 min. • 30 min. Vega Di Nezio-Zona-Lampert-Fontan. TAI 2013 Parámetros: 30 min. de extracción a temperatura definida.
  22. 22. 22 Tiempo de extracciónTiempo de extracción Con el fin de encontrar el tiempo optimo, se expuso la fibra en el HS de la muestra por diferentes periodos de tiempo. • 10 min. • 20 min. • 30 min. • 40 min. • 50 min. • 60 min. Vega Di Nezio-Zona-Lampert-Fontan. TAI 2013 Parámetros fijos: No definidos.
  23. 23. 23 Adición de salAdición de sal El efecto de la fuerza iónica en la eficiencia de la extracción fue examinada a través de la adición de diferentes cantidades de cloruro de sodio en el vial. • 0 g • 1 g • 2 g • 3 g • 3,5 g Vega Di Nezio-Zona-Lampert-Fontan. TAI 2013 Parámetros fijos: Parámetros definidos.
  24. 24. 24 Discusión yDiscusión y resultadosresultados Vega Di Nezio-Zona-Lampert-Fontan. TAI 2013
  25. 25. 25 41 compuestos carbonilicos volátiles y no volátiles de estructura variable fueron seleccionados con el fin de explorar las características de la derivatizacion en fibra simple y la derivatizacion en solución. Vega Di Nezio-Zona-Lampert-Fontan. TAI 2013
  26. 26. 26Vega Di Nezio-Zona-Lampert-Fontan. TAI 2013
  27. 27. 27 La técnica de derivatizacion en solución fue estudiada mediante la evaluación de los efectos de los siguientes parámetros en la eficiencia de la extracción. • Revestimiento de la fibra • Concentración de PFBHA • Temperatura de extracción • Tiempo de preincubación • Tiempo de extracción • Fuerza iónica También una calibración y validación del método fue llevadas a cabo, con lo cual se evaluaron la linealidad y la repetitividad de la técnica. Vega Di Nezio-Zona-Lampert-Fontan. TAI 2013
  28. 28. 28 Revestimiento de la fibra Fue evidente que la fibra PDMS-DVB otorga la mejor extraccion para estudiar los compuestos anteriormente mencionados PDMS-DVB PDMS DVB-CAR-PDMS CAR-PDMS CW-DVB Vega Di Nezio-Zona-Lampert-Fontan. TAI 2013
  29. 29. 29Vega Di Nezio-Zona-Lampert-Fontan. TAI 2013 Concentración de PFBHAConcentración de PFBHA
  30. 30. 30 Aldehídos alifáticos saturados (SLA) y aldehídos ramificados Cetonas y compuestos acetilados Concentraciones PFBHA Concentraciones PFBHA 0,75 g/L de PFHBA Vega Di Nezio-Zona-Lampert-Fontan. TAI 2013
  31. 31. 31 Temperatura de extracciónTemperatura de extracción Vega Di Nezio-Zona-Lampert-Fontan. TAI 2013
  32. 32. 32 Compuestos volátiles (cadena corta) Demás compuestos Tº Tº Para evitar la reacciones no deseadas y obtener la mayor extraccion de todos los compuestos, la temperatura seleccionada fue 60 ºC Vega Di Nezio-Zona-Lampert-Fontan. TAI 2013
  33. 33. 33 Pre-incubaciónPre-incubación Para permitir a los compuestos carbonilicos reaccionar con el PFBHA y realizar los análisis posteriores, el tiempo optimo de pre-incubacion fue de : 10 min. Vega Di Nezio-Zona-Lampert-Fontan. TAI 2013
  34. 34. 34 Tiempo de extracciónTiempo de extracción Vega Di Nezio-Zona-Lampert-Fontan. TAI 2013
  35. 35. 35 Adición de salAdición de sal Vega Di Nezio-Zona-Lampert-Fontan. TAI 2013
  36. 36. 36 SOLO en Hidroxicarbonilos aumenta la eficiencia de extracción si se aumenta la cantidad de cloruro sodico debido a la disminución en la actividad de agua y la consiguiente incapacidad de formar puentes H entre el hidroxilo y el derivatizante. Como consecuencia, la mejor extraccion se realizo SIN el agregado de Cloruro de sodio 0 g NaCl Vega Di Nezio-Zona-Lampert-Fontan. TAI 2013
  37. 37. 37 Calibración y Validación Compuesto Rango (µg/L) R RSD (%) Propanal 4-512 0,994 4,88 Decanal 0,07-256 0,909 4,18 2-butanona 1,6-204,8 0,996 3,85 2-acetilpirrol 18-128 0,989 12,84 Hidroxiacetona 40-5120 0,998 3,25 De un total de 41 compuestos carbonílicos analizados se presentan 5. Aquí, decanal y 2-acetilpirrol presentan curvas que no ajustan demasiado bien a la linealidad. En el caso del 2- acetilpirrol se lo atribuye a un pico desconocido que lo solapa parcialmente. El rango de concentraciones en el cual se mantiene la linealidad es muy amplio, siendo éste acorde y útil para las concentraciones estándar que se encuentran en la cerveza. RSD: relative standard deviation Vega Di Nezio-Zona-Lampert-Fontan. TAI 2013
  38. 38. 38 Comparación técnicas de derivatización (I) Compuesto En solución En fibra LOD(µg/L) LOQ(µg/L) LOD(µg/L) LOQ(µg/L) Propanal 1,2 4,1 1,7 5,7 Decanal 0,021 0,071 0,005 0,017 2-butanona 0,024 0,08 ND ND 2-acetilpirrol 5,5 18,2 1178 3927 Hidroxiacetona 4,2 14,0 220 733 2-nonanona 0,255 0,849 0,046 0,152 Furfural 0,66 2,20 6,0 20,0 2,3-pentadiona 0,26 0,86 30 101 Vega Di Nezio-Zona-Lampert-Fontan. TAI 2013
  39. 39. 39 Comparación técnicas de derivatización (II) Compuesto Concentración (µg/L) En Solución En Fibra Propanal 4,56 (+/- 0,17) 5,72 (+/- 0,26) Decanal 0,82 (+/- 0,04) 1,04 (+/- 0,09) 2-butanona 12,35 (+/- 0,79) ND 2-acetilpirrol 110,1 (+/- 8,6) ND Hidroxiacetona 1600 (+/- 123) 1742 (+/- 197) 2-nonanona ND 0,067 (+/- 0,002) Furfural 492,6 (+/- 22,5) 503 (+/- 19) 2,3-pentadiona 14,4 (+/- 0,6) ND Vega Di Nezio-Zona-Lampert-Fontan. TAI 2013
  40. 40. 40 Comparación técnicas de derivatización (III) Vega Di Nezio-Zona-Lampert-Fontan. TAI 2013
  41. 41. 41 Comparación técnicas de derivatización (IV) • Mediante derivatizacion en solución se obtuvieron áreas mas grandes, por lo que el limite de detección del método es menor. • Los compuestos mas polares se extrajeron mejor con derivatizacion en solución, no así los apolares. • La derivatizacion en fibra aporto áreas mucho menores, y la ausencia de algunos picos. Vega Di Nezio-Zona-Lampert-Fontan. TAI 2013
  42. 42. 42 Comparación técnicas de derivatización (V) Derivatización en fibra • No logra detectar moléculas de cadena pequeña. • No detecta 5-HMF ni acetoína. • No detecta dicetonas. Derivatización en solución • Áreas más grandes • No logra detectar moléculas de cadena larga. • Aumenta la eficiencia de extracción de las cetonas. Vega Di Nezio-Zona-Lampert-Fontan. TAI 2013
  43. 43. 43 ConclusionesConclusiones
  44. 44. 44 Parámetros óptimos paraParámetros óptimos para derivatizacion en soluciónderivatizacion en solución • Una concentración de 0,75 g/L de PFBHA • Sin agregado de NaCL. • Pre-incubacion a 60 ºC durante 10 minutos • Extraccion a 60 ºC durante 40 minutos con una fibra PDMS-DVB Vega Di Nezio-Zona-Lampert-Fontan. TAI 2013
  45. 45. 45 Mediante la calibración y validación se demostró que el método de derivatizacion en solución era sólido. Vega Di Nezio-Zona-Lampert-Fontan. TAI 2013
  46. 46. 46 Derivatizacion en soluciónDerivatizacion en solución Esta técnica fue mas eficiente para detectar compuestos mas polares tanto carbonílicos como cetonas. La detección de 5-HMF, acroleína, hidroxiacetona, acetoina, glioxal y metilglioxal en la cerveza fue remarcable. Vega Di Nezio-Zona-Lampert-Fontan. TAI 2013
  47. 47. 47 Derivatizacion en fibra simpleDerivatizacion en fibra simple Esta técnica demostró ser mucho mas afín para compuestos apolares de cadenas largas como (E)-2- nonanal Vega Di Nezio-Zona-Lampert-Fontan. TAI 2013
  48. 48. 48 FinFin

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