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Helicobacteri pylori work

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Helicobacteri pylori work

  1. 1. Infección por Helicobacter pylori en pacientes sintomáticos con patología gastroduodenal benigna. Análisis de 5.664 pacientes Helicobacter pylori infection in symptomatic patients with benign gastroduodenal diseases. Analysis of 5.664 cases JUAN PABLO ORTEGA1, ALBERTO ESPINO2, ALFONSO CALVO B.3, PATRICIA VERDUGO3, MARTHA PRUYAS4, EVA NILSEN4, LUIS VILLARROEL5, OSLANDO PADILLA5, ARNOLDO RIQUELME2, ANTONIO ROLLÁN6 1Servicio de Medicina, Hospital Dr. Sótero del Río. 2Departamento de Gastroenterología, Facultad de Medicina, Pontificia Universidad Católica de Chile. 3 Unidad de Endoscopia, Centro de Referencia de Salud San Rafael, La Florida, Servicio de Salud Metropolitano Sur Oriente. 4Departamento de Anatomía Patológica, Hospital Dr. Sótero del Río. 5Departamento de Salud Pública y Centro de Investigaciones Médicas. Pontificia Universidad Católica de Chile. 6Departamento de Enfermedades Digestivas y Latin American Endoscopic Training Center. Universidad del Desarrollo. Clinica Alemana de Santiago, Chile. Dirección para correspondencia Infection with Helicobacter pylori (H. pylori) is highly prevalent in Chile, but there are no systematic studies in patients with upper gastrointestinal symptoms. Aim: To determine the prevalence of H. pylori infection, according to age, gender and endoscopic pathology in a large sample of patients. Methods: We studied 7,893 symptomatic patients submitted to upper gastrointestinal endoscopy between July 1996 and December 2003 in the context of a screening program of gastric cancer in a high risk population. H. pylori infection was determined by rapid urease test (RUT) in antral mucosa. We excluded 158 patients with gastric cancer (2%) and 2,071 patients without RUT. Results: We included 5,664 patients, mean age 50.7 ± 13.9 years, women 72.1%. Endoscopic diagnoses were normal in 59.3%, erosive esophagitis in 20%, gastric ulcer (GU) in 8.1%, duodenal ulcer (DU) in 6.4%, and erosive gastropathy in 6.2%. RUT was positive in 78% of patients. After adjusting for age and sex and with respect to patients with normal endoscopy, frequency of H. pylori infection was 86.6% in DU (OR 2.1, 95% CI 1.5-2.8, p < 0.001); 81.4% in GU (OR 1.8, 95% CI 1.4-2.4; p < 0.001 ); 79.9% in erosive gastropathy (OR 1.4, 95% CI 1.03-1.8; p = 0.03) and 77.4% in erosive esophagitis (OR 1.1, 95% CI: 0.9-1.3; p = NS). The probability of H. pylori infection decreased significantly with age, more markedly in men with normal endoscopy. Conclusions: Prevalence of H. pylori infection is very high in symptomatic Chilean patients and even higher in those with gastroduodenal ulcer or erosions, while in patients with erosive esophagitis is similar to those with normal endoscopy. The frequency of infection decreases with age, probably as a consequence of rising frequency of gastric mucosal atrophy. (Key words: Helicobacter pylori, Epidemiology, Peptic ulcer, Gastroscopy.)
  2. 2. Hace más de 20 años que Marshall y Warren cultivaron en mucosa gástrica humana una bacteria Gram negativa, conocida actualmente como Helicobacter pylori (H. pylori) y demostraron su rol etiopatogénico en la úlcera péptica gastroduodenal1,2. Su trabajo generó una revolución en la comprensión y tratamiento de patologías digestivas tan importantes como úlcera péptica y cáncer gástrico (CG), por lo que fueron premiados con el Premio Nobel de Fisiología y Medicina 2005. La infección por H. Pylori afecta aproximadamente a 50% de la población mundial3. Se adquiere mayoritariamente en la infancia y presenta una baja frecuencia relativa (20-40%) en países desarrollados y una alta frecuencia (hasta 90%) en países en desarrollo. En Chile, en población adulta asintomática alcanza 73% (IC 95% 70- 76%)4. Se asocia a una gastritis de intensidad variable, generalmente asintomática. Casi toda la información publicada sobre esta infección proviene de países desarrollados y es posible que muchos de los conceptos y conductas derivados de este conocimiento, no puedan simplemente extrapolarse a los países en vías de desarrollo. Hasta 15% de los sujetos infectados desarrollarán una úlcera péptica en el curso de su vida, encontrándose la bacteria en más de 90% de las úlceras duodenales y en 70% de las úlceras gástricas5-7. La erradicación de la infección se asocia a la curación de la úlcera en la mayoría de los casos y disminuye su recurrencia8. Por otro lado, una pequeña proporción de los infectados desarrollará un CG, generalmente precedido por una gastritis crónica atrófica. La infección por H. pylori se ha relacionado con otras patologías digestivas de alta frecuencia, como el reflujo gastroesofágico (RGE) y la dispepsia funcional (DF). La información disponible es contradictoria, pero sugiere que existe una correlación inversa entre la frecuencia de RGE y la de H. pylori, más evidente en países con alta prevalencia de infección9-11. Respecto a la DF, una de las causas más frecuentes de consulta ambulatoria por síntomas digestivos, el rol etiológico del H. pylori es incierto. La mayoría de los estudios publicados provienen de países con baja frecuencia de infección y no muestran diferencias significativas entre dispépticos y controles11-13, aunque la última revisión sistemática de la Cochrane sugiere que la erradicación de H. pylori se asocia a una pequeña, pero significativa mejor respuesta sintomática respecto a placebo14. Una vez más, existe escasa información de áreas geográficas con alta frecuencia de infección15. El objetivo principal del presente estudio fue determinar la prevalencia de infección por H. pylori en pacientes con síntomas digestivos con indicación clínica de endoscopia digestiva alta y correlacionar la frecuencia de la infección con las patologías más frecuentemente diagnosticadas. Pacientes y Método Se realizó un estudio prospectivo de pacientes que consultaron por dolor o molestia abdominal alta mayor a dos semanas de evolución, que fueron derivados al Centro de Referencia de Salud de La Florida, comuna urbana de Santiago de Chile con una alta mortalidad por cáncer gástrico4 y que fueron sometidos a endoscopia digestiva alta y búsqueda de H. pylori, en el contexto de un programa de pesquisa precoz de cáncer gástrico16. Se emplearon endoscopios de fibra óptica Olympus, modelos GIF E y P3, con técnica estándar, luego de consentimiento informado. Todos los procedimientos fueron realizados por el mismo endoscopista (AC), bajo sedación moderada con midazolam i.v. La determinación de H. pylori se realizó mediante test de ureasa rápido (CLOtest®, Kimberly-Clark)17 en una biopsia obtenida del antro proximal.
  3. 3. Se incluyeron pacientes estudiados entre julio de 1996 y noviembre de 2003. Se excluyeron los que habían usado recientemente antibióticos (< 1 mes), antagonistas de receptores H2 o inhibidores de la bomba de protones (< 2 semanas) y aquellos en los que no se realizó test de ureasa, por falta de disponibilidad del test al momento de la endoscopia. También se excluyeron los pacientes con CG, objeto de un reporte previo16. Sólo se consideró la endoscopia inicial de cada paciente. De acuerdo a los hallazgos endoscópicos los pacientes fueron clasificados en las siguientes categorías: 1) Normal; 2) Esofagitis erosiva; 3) Gastropatía erosiva; 4) Úlcera gástrica; 5) Úlcera duodenal. Los pacientes con más de una lesión fueron categorizados de acuerdo a la de mayor gravedad (U. gástrica > U. duodenal > Esofagitis erosiva > Gastropatía erosiva). Alteraciones inespecíficas de la mucosa gástrica como congestión, eritema, o disminución aparente de los pliegues, generalmente diagnosticados como "gastritis", o aquellos con alteraciones inespecíficas de la mucosa esofágica, diagnosticada a menudo como "esofagitis no erosiva", fueron consideradas normales. Análisis estadístico: Se utilizó test chi-cuadrado para comparar la presencia de H. pylori entre distintos grupos. Para cuantificar el riesgo de H. pylori en las distintas patologías se calcularon Odds Ratio (OR) crudos con intervalo de confanza de 95%. Para determinar variables asociadas en forma conjunta con el resultado del test de ureasa se ajustaron modelos de regresión logística binaria. Estos modelos permitieron obtener OR del riesgo de infección por H. pylori para las distintas patologías ajustados por edad y sexo. Para mostrar la relación entre la edad y la prevalencia de H. pylori se representó el logit de la probabilidad [logit (p) = ln (p/(1-p))] según diagnóstico y sexo, que tiene la ventaja de ser monótona creciente en p y lineal en los regresores. Se utilizó el programa SPSS 15.0 para Windows, considerándose significativo valor p < 0,05. Resultados Durante el período de estudio, se realizaron 9.616 endoscopias en 7.893 pacientes. Se excluyeron 2.229 por los criterios previamente descritos, de los cuales 158 (2%) correspondieron a pacientes con CG. Un total de 5.664 pacientes fueron finalmente incluidos. La Tabla 1 muestra las características demográficas de la muestra. La edad promedio fiue de 50,7 años, con rango entre 14 y 90 años. El 72,1% fiueron mujeres. El test de ureasa fiue positivo en 78% de los casos, sin difierencias significativa por sexo (78,5% y 77,8% en hombres y mujeres, respetivamente; p = NS).
  4. 4. La Tabla 2 muestra la frecuencia de los diagnósticos endoscópicos. La endoscopia fue normal en 59,3% de los pacientes. La esofagitis erosiva estuvo presente en 20%, constituyéndose en la patología más frecuente de la muestra. La úlcera gástrica fue más frecuente en pacientes de mayor edad (74,4% de los casos en mayores de 50 años), mientras la úlcera duodenal se distribuyó a lo largo de todo el espectro etario (25,5% en menores de 40 años y 34,3% en mayores de 60). La Tabla 3 muestra que la distribución de los hallazgos endoscópicos fue significativamente distinta al comparar ambos sexos (p < 0,0001). Una endoscopia normal fue más frecuente en mujeres, mientras todos los hallazgos patológicos, excepto la gastropatía erosiva, fueron más frecuente en hombres.
  5. 5. La Tabla 4 muestra la asociación entre infección por H. pylori y patología endoscópica, en comparación con la población con endoscopia normal. Se observa una asociación significativa entre infección por H. pylori y gastropatía erosiva, úlcera gástrica y úlcera duodenal, que es más marcada en relación con esta últ ima. En la muestra estudiada, casi 90% de los pacientes con úlcera duodenal y más de 80% de los ulcerosos gástricos portaban la bacteria. No hubo asociación, en cambio, entre infección por H. pylori y esofagitis erosiva. En la Figura 1 se muestra la frecuencia de H. pylori por grupo etario, para el grupo con endoscopia normal y para aquellos con úlcera gástrica o duodenal. A partir de la cuarta década se aprecia una tendencia a la disminución, que parece más evidente en los pacientes con endoscopia normal y más tardía en los pacientes con úlcera duodenal. La Figura 2 muestra un análisis multivariado (logit de probabilidades) del riesgo de infección por H. pylori en función de la edad, sexo y diagnóstico endoscópico. En esta muestra la probabilidad de infección disminuye signifcativamente con la edad y esta disminución es significativamente mayor en hombres, especialmente en aquellos con endoscopia normal.
  6. 6. Figura 1. infección por H. pylori en función de la edad y grupo diagnóstico. Figura 2. infección por H. pylori en función de la edad, sexo y grupo diagnóstico. Análisis multivariado (logit de Probabilidad). Discusión Este estudio comprende una gran serie de casos de pacientes sintomáticos provenientes de un área geográfica caracterizada por una alta frecuencia de infección por H. pylori y alta mortalidad por CG, condiciones que lo distinguen de la mayor parte de las publicaciones relacionadas con el tema. Las conclusiones son probablemente aplicables a poblaciones que compartan estas características, hasta ahora subrepresentadas en la literatura disponible. Es importante destacar que en Chile existe una evidente heterogeneidad respecto al riesgo de CG, siendo más frecuente en comunas y población de menor nivel socioeconómico, hacia las cuales deben enfocarse predominantemente las conclusiones de este estudio.
  7. 7. El tamaño muestral nos permitió demostrar correlaciones y diferencias imposibles de analizar en muestras de menor tamaño. La categorización de los hallazgos endoscópicos fue exigente, sin considerar como patológicos hallazgos con alto componente subjetivo ("gastritis") y dudosa representación sintomática. Desde esta perspectiva, la demostración de patología en 40% de los pacientes sugiere que la endoscopia estuvo en general bien indicada, especialmente en el caso de los hombres. La evidente sobrerepresentación de las mujeres (70% de la muestra) y la significativa menor frecuencia de hallazgos patológicos en ellas (37,1% vs 50,7% en los hombres; p < 0,001), sugieren que, en esta población, probablemente el sexo determina diferencias en los patrones de consulta médica, aunque el estudio no fue diseñado para entregar información causal al respecto, de modo que no contamos con un registro detallado de la sintomatología que motivó la indicación de endoscopia. La esofagitis erosiva constituyó la principal patología detectada, afectando a 20% de los pacientes. Si consideramos que la mayoría de los pacientes con RGE no tiene esofagitis endoscópica18, la proporción de pacientes con RGE debe ser aún mayor. La coexistencia de una alta frecuencia de RGE con una alta frecuencia de H. pylori y el que la prevalencia de esta última haya sido similar en los pacientes con y sin esofagitis sugieren que, al menos en esta población, la infección por HP no parece tener un efecto protector relevante respecto al RGE. La úlcera gastroduodenal estuvo presente en 15% de los pacientes y se asoció significativamente a la presencia de H. pylori. El que esta asociación sea significativa aun en una población con tan alta frecuencia basal de infección, apoya el rol etiológico de H. pylori en la úlcera péptica. A diferencia de la tendencia que se observa en países desarrollados, en los que la proporción de úlceras no asociadas a H. pylori va en aumento19, la infección fue casi universal en los pacientes ulcerosos y sugiere que la erradicación empírica de H. pylori en pacientes con úlcera gastroduodenal es probablemente costo-efectiva en esta población. La significativa asociación entre infección por H. pylori y gastropatía erosiva es esperable dado que, junto con los antiinflamatorios no esteroidales, es considerada el principal factor etiológico para esta patología. A diferencia de la esofagitis y la úlcera, no existe un correlato claro entre la alteración anatómica y las manifestaciones clínicas. Es imposible saber en cuantos de estos pacientes (la mayor parte probablemente con síntomas inespecíficos y por lo tanto calificables de "dispépticos") los síntomas estaban relacionados con las erosiones gástricas. Sólo la erradicación de la infección y un posterior seguimiento clínico y endoscópico pudiera contestar esta pregunta. La erradicación de H. pylori ha sido sugerida como la terapia de elección para los pacientes dispépticos en la mayor parte de las guías clínicas de países desarrollados20, aun cuando la mayor parte de los pacientes persistirá sintomático luego del tratamiento14. En nuestro entorno de infección casi universal la indicación de erradicación de H. pylori a todos los pacientes dispépticos tiene múltiples implicancias potenciales, que demandan estudios de costo- efectividad aún no disponibles. En el intertanto, erradicar al menos a aquellos con gastropatía erosiva parece una conducta razonable, sobre todo considerando la reconocida asociación entre erosiones antrales y úlcera péptica21 y el hecho de que hasta 8% de los pacientes dispépticos con endoscopia normal desarrollan una úlcera durante el seguimiento22. Es plausible suponer que el grupo con erosiones antrales concentre especialmente a los ulcerosos no reconocidos, que son precisamente los que más se benefician de la erradicación de H. pylori. Esta conducta requiere ser validada con estudios específicamente diseñados. El tamaño de la muestra permitió realizar análisis de subgrupos. La frecuencia de infección por H. pylori muestra una tendencia descendente con la edad, que es mayor en hombres y en aquellos con endoscopia normal. Este hallazgo reproduce lo
  8. 8. observado previamente en un estudio serológico de población asintomática4. Es probable que la progresiva instalación de atrofia gástrica (AG) determine un ambiente hostil para la sobrevivencia de H. pylori y probablemente sea una característica común en países con alta prevalencia de H. pylori y CG, aunque no tenemos conocimiento de que haya sido descrita previamente. Esto contrasta con lo observado en países con baja prevalencia de H. pylori, donde la frecuencia de la infección aumenta en la población de mayor edad23, lo que se ha atribuido a un efecto de cohorte determinado por la disminución progresiva en el riesgo de infección en la infancia. La Figura 1 muestra que la caída en la frecuencia de H. pylori es menor y más tardía en los pacientes con úlcera duodenal, que tienen menor riesgo de AG y CG24, lo que parece apoyar esta interpretación, aunque la ausencia de histología impide confirmar esta hipótesis. En estudio epidemiológico previo comprobamos un significativo ascenso en la frecuencia de AG (determinada por serología) a contar de los 60 años, que coincidió inversamente con la caída en la frecuencia de infección por HP25. Esta observación tiene implicancias prác ticas: para identificar la población con riesgo de CG en nuestro medio es necesario detectar especialmente el grupo con AG y H. pylori (-), ya que concentra el mayor riesgo de CG. El diagnóstico simultáneo de ambas condiciones puede realizarse en forma no invasiva mediante la determinación serológica de pepsinógeno y anticuerpos contra H. pylori en población asintomática, y mediante histología en pacientes sintomáticos con indicación de endoscopia. Probablemente en todo paciente sometido a una endoscopia alta debiera realizarse un test de ureasa para detectar y eventualmente tratar la infección por H. pylori, pero estos datos permiten sugerir que en hombres y mujeres mayores de 40 y 50 años, respectivamente (10 años antes del quiebre respectivo en la frecuencia de CG en población Chilena) debiera realizarse además biopsias gástricas para detectar AG. Nuevamente, determinar el protocolo de biopsias más costo efectivo requiere estudios específicos. En resumen, comprobamos una alta frecuencia de infección por H. pylori en pacientes sintomáticos digestivos con endoscopia normal, que es aun mayor en pacientes con úlcera gastroduodenal o gastropatía erosiva, pero no en aquellos con esofagitis por RGE, la patología benigna del tubo digestivo alto más frecuente. La infección casi universal permite sugerir la erradicación empírica (aun sin infección demostrada) como una estrategia razonable en pacientes ulcerosos en nuestra población. La disminución en la frecuencia de H. pylori demostrada en los pacientes de mayor edad confirma lo observado previamente en población asintomática4,25, sugiere que pudiera tratarse de una característica particular de poblaciones con alta frecuencia de H. pylori y CG y plantea la conveniencia de agregar la histología al estudio endoscópico en los pacientes dispépticos que concentran el riesgo de CG. Agradecimientos: Queremos agradecer la revisión del manuscrito y consejos de nuestro querido Profesor Dr. Vicente Valdivieso Dávila. Departamento Gastroenterología, Facultad de Medicina, Pontific ia Universidad Católica de Chile. Referencias 1. Marshall BJ, Warren JR. Unidentifed curved bacilli in the stomach of patients with gastritis and peptic ulceration. Lancet 1984; 1: 1311-5. [ Links ] 2. Johannes GK, Arnoud HM, Ernst JK. Pathogenesis of Helicobacter pylori Infection. Clin Microbiol Rev 2006; 19: 449-90. [ Links ]
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  11. 11. Fono/Fax:56-2-7535524 omparación de Helicobacter pylori en cavidad oral y mucosa gástrica de acuerdo a genotipo de virulencia (cagA y vacAm 1) Comparison of Helicobacter pylori in oral cavity and gastric mucosa according to virulence genotype (cagA and vacA m1) Ester Sepúlveda, Jessica Moreno, María L. Spencer, Sandra Quilodrán, Ursula Brethauer, Carlos Briceño y Apolinaria García Universidad de Concepción, Concepción, Chile. Facultad de Odontología Departamento de Patología y Diagnóstico (ES, MLS, UB). Facultad de Ciencias Biol ógicas Departamento de Microbiología (SQ, AG). Facultad de Medicina Departamento de Medicina Interna (CB). Facultad de Ciencias Biol ógicas Departamento de Ciencias Biológicas (JM). Dirección para correspondencia Objective: To compare the virulence genotype (cagA and vacA ml genes) of Helicobacter pylori obtained simultaneously from gastric mucosa and oral cavity. Material and Methods: Gastric samples of 18 patients were obtained by endoscopic biopsies. Oral samples of these patients were obtained from dental plaque and saliva swabs from the floor of the mouth and the base of the tongue. All samples were studied by conventional PCR and real-time PCR (RT-PCR). Virulence genes cagA and vacA ml were studied by RT- PCR. Results: According to presence and/or absence of cagA and vacAm1 genes, seven different combinations were observed. Conclusion: These results suggest that there is a variety of genetic profiles of Helicobacter pylori in the stomach and oral cavity, with a predominance of less virulent genotypes in the patients included in this study (cagA-, vacA m1-). Key words: Helicobacter pylori, virulence genes, real-time PCR. Resumen Objetivo: Comparar el genotipo de virulencia (genes cagA y vacA m1) de Helicobacter pylori, obtenido simultáneamente de mucosa gástrica y cavidad oral. Material y Métodos: Para esto se incluyeron muestras de biopsias gástricas de 18 pacientes. Las muestras orales de estos pacientes fueron obtenidas de placa bacteriana y saliva del piso de boca y base de la lengua. Las muestras fueron estudiadas con RPC convencional y RPC en tiempo real (RPC-TR). Los genes de virulencia cagA y vacA m1 fueron estudiados con RPC-TR. Resultados: De acuerdo a
  12. 12. la presencia o ausencia de los genes de virulencia cagA y vacA m1 detectados en las muestras gástricas y orales, se pudieron diferenciar siete combinaciones diferentes. Conclusión: Estos resultados sugieren que existe una variedad de genotipos de virulencia en Helicobacter pylori en el estómago y la cavidad oral, predominando en los pacientes incluidos en este estudio las cepas con genotipos asociados a menor virulencia (cagA-, vacA m1-). Palabras clave: Helicobacter pylori, genes de virulencia, RPC en tiempo real. INTRODUCCIÓN Helicobacter pylori ha sido asociado a una variedad de patologías gastro- duodenales, especialmente carcinoma gástricol. En Chile, el carcinoma gástrico es la principal causa de muerte en hombres y la tercera en mujeres2. La prevalencia de H. pylori en Chile varía de 73 a 83%, dependiendo del área geográfica3,4. Un estudio reciente5 realizado en niños entre 3 y 14 años de Santiago de Chile, demostró una prevalencia de 26%, con mayor proporción en los varones. Helicobacter pylori posee una variedad de factores de virulencia como flagelo, morfología espiralada, ad-hesinas, enzimas y lipopolisacáridos6,7. Destacan entre sus factores de virulencia las proteínas CagA y VacA, las cuales pueden ser investigadas más fácilmente a través de los genes que las codifican, que se denominan genes asociados a virulencia, específicamente en este caso, cagA y vacA8-11. Cabe destacar que los genes cagA y vacA son actualmente importantes marcadores genéticos asociados a virulencia en H. pylori12. El gen cagA codifica la síntesis de la proteína CagA. La producción de esta proteína se potencia por la presencia de pH ácido y es mediada por un sistema de secreción tipo IV La proteína CagA induce a nivel de las células epiteliales gástricas la producción de citoquinas inflamatorias, como la IL-8, y el reclutamiento de leucocitos. El efecto directo sobre las células gástricas es la reducción de la secreción de ácido13. Por otra parte, el gen vacA codifica la producción de toxina VacA, la que presenta un mosaico genético basado en variaciones de alelos en las regiones medias (alelos m1 o m2 y subtipos) y variaciones de señalización (alelos s1 o s2 y subtipos)14,15. Se ha observado que los tipos s1/m1 son más agresivos y son llamados Tox+16. La toxina VacA es secretada por aproximadamente 50% de los tipos de H. pylori, causando degeneración vacuolar de las células epiteliales gástricas y ulceración de la mucosa17. Se ha demostrado que los tipos vacA s1/m1 tienen una actividad citotóxica aumentada en comparación con los tipos s1/m2 y que los tipos s2/m2 no poseen ninguna actividad citotóxica14. Estudios realizados por nuestro grupo18,19, incluyendo muestras de biopsias gástricas de pacientes de diversas regiones de Chile, señalan la importancia de los genes cagA y vacA m1 en la patogenicidad de H. pylori, razón por la cual fueron considerados en esta investigación. Cabe destacar que los resultados de dichas investigaciones generaron el consecuente desarrollo de un kit molecular en proceso de patentamiento ("Un kit molecular de diagnóstico de cepas virulentas de Helicobacter pylori", patente en trámite, número de solicitud: 1520-08). Diferentes investigaciones demuestran la presencia de H. pylori en la cavidad oral (placa bacteriana y saliva), actuando como un reservorio para la bacteria20-25. Algunos autores han encontrado una asociación entre la presencia de H. pylori en mucosa gástrica y oral26-33. En una investigación previa realizada por nuestro grupo, se observó la co-existencia de la bacteria en ambas localizaciones mediante
  13. 13. RPC en tiempo real (RPC-TR)34. En este estudio se observó que de 54 pacientes, 39% (n = 21) presentó muestras gástricas positivas para H. pylori. Todas las muestras orales de estos 21 pacientes resultaron negativas para H. pylori mediante cultivo. Sólo una muestra de placa bacteriana fue positiva mediante RPC convencional y todas las muestras de saliva resultaron negativas. Sin embargo, las muestras orales de todos los pacientes resultaron positivas mediante RPC-TR (20/21 placa bacteriana, 21/21 saliva del piso de la boca y 20/21 saliva de la base de la lengua). Se ha estudiado la presencia de genes de virulencia de H. pylori proveniente de estómago y cavidad oral del mismo paciente35,36, pero de acuerdo a nuestro conocimiento, no existen investigaciones en la población chilena. Por lo anterior, el objetivo del presente estudio fue comparar los genotipos asociados a virulencia (cagA y vacA m1) de H. pylori obtenido simultáneamente de mucosa gástrica y cavidad oral a partir del mismo paciente. MATERIAL Y MÉTODOS Pacientes. Se estudiaron muestras gástricas y orales de 21 pacientes con indicación médica de endoscopia digestiva alta, de la Unidad de Gastroenterología del Hospital Regional de Concepción. Se excluyeron pacientes con tratamiento antimicrobiano para H. pylori y se obtuvo un consentimiento informado de cada paciente. Esta investigación fue aprobada por la Dirección de Investigación de la Universidad de Concepción. Obtención de muestras. Las muestras gástricas y orales fueron obtenidas de cada paciente al momento de realizar la endoscopia digestiva. Las muestras orales se obtuvieron de placa bacteriana sub-gingival, con una sonda dental, y las muestras de saliva fueron obtenidas del piso de boca y base de lengua con tórulas de algodón estériles. Las biopsias gástricas se tomaron del antro y cuerpo durante la inspección endoscópica del estómago. Aislamiento de ADN. El ADN del control positivo de H. pylori ATCC se obtuvo con el kit E.Z.N.A.® para ADN bacteriano, siguiendo las instrucciones del fabricante (OMEGA bio-tek, Norcross, GA, USA). Para las muestras orales se utilizó el kit BIO 101 Protocol Fast DNA E.Z.N.A.® (OMEGA bio-tek, Norcross, GA, USA) y para las muestras gástricas se utilizó el kit E.Z.N.A.® para ADN tisular (OMEGA bio-tek, Norcross, GA, USA), siguiendo las instrucciones del fabricante. Diseño y elección de Oligos. Se obtuvo por lo menos 15 pares de partidores y sondas mediante el sotfware Oligo 6.2, para la detección de β-actina (específica para ADN humano), para la región 16S ARNr de H. pylori y para los genes de virulencia cagA y vacA m1, eligiendo finalmente sólo un par de ellos, usando los códigos de acceso de sus secuencias mostrados en la Tabla 1. La herramienta BLASTn (Basic Local nucleotid Alignment Search Tool), disponible en NCBI (National Center Biotechnology), permitió encontrar regiones con similitud de secuencias nucleótido por nucleótido. Los criterios de la selección de los partidores fueron los que tenían las mejores condiciones termodinámicas arrojadas por el programa Oligo 6.2 para el de β-actina y que además coincidieran con alguno ya probado por otros autores, tanto para el gen 16S ARNr37, cagA38 y vacA m139. Los porcentajes de identidad fueron de 100% para los oligos elegidos, dando un mayor puntaje de probabilidad de unión. En la Tabla 1 se detallan los partidores elegidos, los productos esperados y su código NCBI.
  14. 14. RPC. Las muestras gástricas y orales fueron ratificadas con RPC convencional y RPC-TR mediante la amplificación de una región del gen 16S ADNr. Los genes de virulencia cagA y vacA m1 fueron estudiados con RPC-TR. Las muestras de 3 pacientes fueron descartadas, ya que no existía suficiente muestra gástrica, dejando un total de 18 pacientes. Para confirmar la amplificación del ADN, como control interno, se investigó la presencia del gen de la β-actina mediante RPC-TR. Como control negativo se utilizó AlDN de Lactobacillus spp., agua grado RPC como blanco y el control positivo AlDN de H. pylori ATCC 43504. Mezcla para RPC convencional. El preparado para RPC consistió en 10 ml de ADN, 2,5 ml de solución tampón (10X), 0,5 ml de dNTPs (10 mM), 1,25 ml de MgCl2 (50 mM), 0,125 ml de ADN Taq polimerasa, H2O grado RPC para un volumen total de 25 ml, y 1,25 ml de partidores sentido y antisentido, que se muestran en la Tabla 1. Los parámetros para RPC convencional consistieron en un período de pre- incubación inicial de 15 min a 95°C, un período de denaturación de 30s a 95°C, seguido de 45 ciclos de alineamiento a 55°C por 30s, un período de extensión a 72°C por 2 min y luego por 5 min, y finalmente enfriamiento a 4°C. Los productos RPC se visualizaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,8% bajo luz UV. Mezcla para RPC-TR. Detección de H. pylori 16S ARNr mediante RPC-TR con sonda de hidrólisis TaqMan. Se siguieron las instrucciones del fabricante para la mezcla de amplificación lista para usar LightCycler® TaqMan® Master, para el equipo de LightCycler 2.0 de Roche (catálogo 04735536001), que consiste en 9,1 μ! de H2O grado RPC, 0,5 μL de 10 μM de sonda TaqMan, de mezcla de partidores 16S ARNr de concentración 10 μM y 5 μl de templado de AlDN para un volumen final de 20 μL. Los parámetros de las reacciones para el equipo de RPC LightCycler 2.0 de Roche consistieron en un período inicial de activación de la enzima a 95°C por 10 min, denaturación a 95°C por 10s, seguido de 50 ciclos de amplificación y alineamiento a 55°C por 10s y elongación a 72°C por 8s. La presencia de productos de amplificación específicos para H. pylori y controles positivos de H. pylori ATCC 43504 fueron monitoreados por la detección fluorescente positiva a 530 nm de la sonda de hidrólisis FAM-TAMRA en el software del equipo y confirmado por los tamaños de producto esperado de 119 bp en gel de agarosa al 2%, 80 v por 60 min
  15. 15. en luz UV. Los controles positivos asociados al valor de Tm y amplicón, fueron previamente secuenciados en Macrogen Inc. Seoul, Korea. Detección por RPC-TR con SYBR Green de los genes de virulencia de H. pylori cagA y vac m1 y de las células totales con el gen β-actina como control interno. Se siguieron las instrucciones del fabricante de la mezc la lista para usar LightCycler® FastStart DNA MasterP LUS SYBR Green I (catálogo 03515885001), la cual consistió en 10μL de H2O libre de nucleasas, de MgCl2 25mM, 1 de la mezcla de partidores cagA, vacA m1 o β-actina respectivamente, de concentración stock 10 μM, 2μl de mezcla de SYBR Green y 5 μl de templado de ADN para un volumen final de 20 μL. Los parámetros para las reacciones de RPC LightCycler 2.0 sugeridos en el protocolo del fabricante consistieron en un período de activación de la enzima por 10 min a 95°C, denaturación a 95°C por 10s, seguido por 50 ciclos de amplificación con una temperatura de alineamiento de 55°C por 10s y elongación a 72°C por 14s, análisis de curva de melting 95°C, 69°C y 95°C. La presencia de productos de amplificación específicos para H. pylori y controles positivos para H. pylori ATCC 43504 fueron monitoreados a 530 nm para el fluoróforo SYBR Green intercalado en la elongación a 72°C mediante el software del equipo, con el respectivo análisis de la curva de melting característica de producto único y luego confirmado por su tamaño 298 bp para cagA y 290 bp para vacA m1 y 289 bp para β-actina y asociación con la curva de melting en gel de agarosa al 2%, 80v por 60 min en transiluminador UV. Los controles positivos asociados al valor de Tm y amplicón, fueron previamente secuenciados en Macrogen Inc. Seoul, Korea. RESULTADOS Como se observa en la Tabla 2, se obtuvo 7 combinaciones diferentes de genes cagA y vacA m1, las que denominamos grupos. Ocho pacientes, correspondientes a los grupos 1 y 2, presentaban el mismo perfil de virulencia en estómago y boca, en base a los dos genes en estudio. Los restantes 10 pacientes, correspondientes a los grupos 3 al 7, presentaban cepas de H. pylori con perfiles genéticos asociados a virulencia diferentes en cavidad oral y mucosa gástrica. También podemos observar en esta tabla que no se detectó en paciente alguno la presencia simultánea de H. pylori con su genotipo más virulento (cagA+, vacA m1 +), ni en cavidad oral ni en mucosa gástrica. Sin embargo, al analizar por separado ambos compartimentos, se observa que en las muestras gástricas, dos pacientes (correspondientes a los grupos 4 y 5) poseían este genotipo. Dos pacientes
  16. 16. presentaban cepas de H. pylori con el perfil cagA+, vacA m1- y cinco el perfil cagA- , vacA m1+. Por otra parte, en las muestras orales, tres pacientes presentaban el genotipo asociado a virulencia cagA+, vacA m1- (correspondientes a los grupos 1 y 3), un paciente presentaba el genotipo de H. pylori cagA-, vacA m1+ y los restantes pacientes (n = 14) presentaban cepas de H. pylori con el genotipo cagA-, vacA m1-. DISCUSIÓN Varios estudios han demostrado la presencia de H. pylori simultáneamente en cavidad oral y mucosa gástrica, mostrando diferentes prevalencias, dependiendo de la población estudiada, la selección de la muestra y técnicas de detección de la bacteria26-33,40. Mapstone41, demostró que la presencia de H. pylori en la boca de pacientes dispépticos es importante para su diseminación y considera la cavidad oral una potencial fuente de reinfección luego de la erradicación del microorganismo del estómago. Esto último, fue una de las motivaciones para realizar esta investigación. Sin embargo, es sabido que la identificación de especies bacterianas de la cavidad oral es particularmente difícil debido a que existen más de 500 especies en la placa bacteriana oral42 y más de 700 especies en la cavidad oral en general43. Por ello, es necesario contar con métodos lo más específicos y sensibles para la detección e identificación de H. pylori. La especificidad en la identificación de este microorganismo se evidencia en su cultivo bacteriológico, y se ha observado que muestras con cultivos gástricos positivos para H. pylori también presentan resultados positivos para muestras orales mediante RPC-TR34, avalando la especificidad de este método molecular para esta bacteria. Sin embargo, en cuanto a la sensibilidad, algunos autores han reportado esfuerzos insatisfactorios para cultivar H. pylori de la cavidad oral44. Esto puede deberse a un bajo número de bacteria en la boca debido a una inhibición producida por la compleja microbiota oral o debido a la forma cocoide de la bacteria, que no es detectable mediante técnicas de cultivo tradicionales45. La conversión de la forma bacilar a cocoide se acompaña de una gran disminución de las unidades formadoras de colonias por mililitro (ufc/ml)46. Se sabe que la forma cocoide es una forma viable pero no cultivable en los métodos clásicos de cultivo de este microorganismo, como el agar Columbia47,48. Recientemente el trabajo de Al-Sulami y cols.49, presenta la primera evidencia de crecimiento de H. pylori en agua potable municipal, esto gracias al desarrollo de un medio selectivo, llamado agar modificado urea Columbia (MCUA)50. Diversos autores51,52 discuten la importancia de desarrollar nuevas técnicas para la detección, aislamiento y cultivo de bajos recuentos de H. pylori en placa bacteriana oral. De acuerdo a nuestros resultados, creemos que este problema ha sido parcialmente superado, pues es posible detectar el ADN de la bacteria, aunque no se logre su aislamiento. Sugerimos, por tanto, que para las muestras orales con bajos números de H. pylori, la técnica de elección para su detección sea la RPC-TR. Si bien cabe destacar que en este trabajo se incluyeron sólo dos genes asociados a virulencia, los genes seleccionados, cagA y vacA m1, partes del cromosoma bacteriano, siguen siendo importantes marcadores genéticos asociados a virulencia en H. pylori12. Específicamente cagA se encuentra formando parte de las islas de patogenicidad cag (cagPAI)12. Las islas de patogenicidad en bacterias gramnegativas, como lo es H. pylori, suelen poseer genes para movilizarse, por lo tanto, es posible que provengan de un proceso de captación de información genética tipo conjugación y tener capacidad de transferirse. No sucede lo mismo con el gen vacA, de localización cromosomal, pero no formando parte de una isla53.
  17. 17. Además, trabajos previos de nuestro grupo muestran la importancia de estos genes de H. pylori en población chilena, pues se encuentran asociados a patologías gastro-duodenales18,19. Con respecto al bajo al número de pacientes incluidos, cabe señalar que no es fácil contar con muestras obtenidas simultáneamente de cavidad oral y mucosa gástrica de un mismo paciente; no obstante se reconoce esta limitación. Al analizar los resultados se observa que 14 de 18 pacientes presentaban en su cavidad oral cepas de H. pylori con el genotipo cagA-, vacAm1-, lo que sugiere que la mayoría de los pacientes son colonizados oralmente por los genotipos menos virulentos de H. pylori. A su vez, en el estómago, la mitad de los pacientes estaban colonizados por este genotipo de H. pylori. Por lo tanto, podemos pensar que efectivamente los pacientes incluidos en este estudio, en su mayoría poseían cepas con genotipos asociados a menor virulencia. Por otra parte, los resultados sugieren que en los ocho pacientes, en los cuales se detectaron los mismos genotipos de virulencia en las muestras orales y gástricas, se trate de las mismas cepas de H. pylori. Sin embargo, para asegurar esto se deberían secuenciar los genomas completos de las cepas detectadas, ya que esta es la única forma de demostrar identidad genética. En otros ocho pacientes (grupos 4 al 7) se detectaron perfiles de cepas menos virulentas en la cavidad oral respecto del estómago, en estos casos se puede pensar que se trata de cepas diferentes. Sin embargo, también es probable que las cepas de H. pylori detectadas en cavidad oral fuesen las mismas que detectamos en las muestras gástricas para estos pacientes. Esto podría ser explicado por una posible recombinación genética, ya fuese en la misma cavidad oral o en el estómago, haciéndose más virulentas. Lo anterior, puede ser avalado por un estudio reciente de Kennemann y cols.54, quienes señalan que el genoma de H. pylori evoluciona durante la infección humana y que es estable en ausencia de una infección mixta. En el presente trabajo no se investigó la existencia o no de infección mixta; sin embargo, trabajos previos sí han señalado la existencia de infección mixta en pacientes chilenos18,19. Sólo en dos pacientes (grupo 3) se observó un perfil más virulento en la cavidad oral en relación al estómago. En estos casos lo más probable es que se trate de cepas diferentes. Esto se basa en que se sabe que estos genes están en el cromosoma y no en material de ADN extra- cromosómico, como los plásmidos, donde sus genes son más fáciles de perder, por ej emplo por curación o auto-curación plasmídica (pérdida natural del plásmido). Sin embargo, dada la evolución del genoma bacteriano en el organismo humano, no es posible descartar totalmente que puedan ser las mismas cepas que en el seno del estómago perdieron su gen cagA54. Nuevamente, para dilucidar esto se deberían secuenciar los genomas completos de las cepas de H. pylori detectadas. Los resultados de la presente investigación, en su conjunto, muestran que existe una variedad de genotipos de virulencia en H. pylori, basados en los genes cagA y vacA m1 en el estómago y la cavidad oral, predominando en los pacientes incluidos en este estudio las cepas con genotipos asociados a menor virulencia (cagA-, vacA m1-). Conociendo el potencial de virulencia de la bacteria podemos deducir algo sobre el pronóstico, pues los individuos colonizados por cepas cagA, vacA m1 negativas podrían corresponder a la mayoría de la población que está colonizada por la bacteria, pero son asintómaticos durante toda su vida. En cambio, los individuos colonizados por cepas cagA, vacA m1 positivas, son los que en su mayoría llegan a ser sintomáticos12. Se sugieren futuros estudios con mayor cantidad de pacientes e incluyendo otros genes asociados a virulencia, como vacA s1 y dupA; estos últimos porque en
  18. 18. estudios previos de nuestro grupo (resultados proyecto Fondef D03i1109 aún no publicados) también han demostrado ser importantes para la población chilena

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