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Curva calibração bradford

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Curva Calibração Bradford

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Curva calibração bradford

  1. 1. Elaboração de curva de calibração para a quantificação de proteínas pelo método de Bradford Jessica Gamba, Débora Grinet, Adriane M. F. Milagres, Walter Carvalho Escola de Engenharia de Lorena, EEL - USP 1. Introdução e Objetivos Atividades de pesquisa e desenvolvimento na área de produção, purificação e caracterização de enzimas exigem um método rápido e sensível para a quantificação de proteínas. O método baseado na adsorção do reagente Coomassie Brilliant Blue G-250, proposto por Marion Bradford em 1976[1] , preenche estes pré-requisitos. No presente trabalho, apresentamos os resultados obtidos durante o preparo de uma curva de calibração para a quantificação de proteínas pelo método de Bradford, utilizando albumina de soro bovino como padrão. 2. Material e Métodos Para a preparação do reagente de Bradford, dissolveu-se 100mg de Coomassie Brilliant Blue G-250 em 50mL de etanol 95% e, em seguida, adicionou-se 100mL de ácido fosfórico 85%. A solução assim obtida foi avolumada para 1L com água deionizada. Após filtração em papel de filtro quantitativo (Whatman n°1), a solução foi mantida em geladeira. As soluções-padrão foram preparadas em tampão acetato de sódio 0,05M em pH 4.8, adicionado de NaCl 0,15M. O tampão foi preparado titulando-se acetato de sódio 0,05M com ácido acético 0,05M até pH final de 4,8 e, em seguida, dissolvendo-se o NaCl. Uma solução-mãe de albumina bovina foi então preparada no tampão salino e, a partir desta solução-mãe, preparou-se cinco diluições com as seguintes concentrações: 4,2µg/mL, 20,8µg/mL, 52,0µg/mL, 104,0 µg/mL e 208,0µg/mL. Em tubos de ensaio, porções de 1mL do reagente de Bradford foram misturadas a porções de 0,1mL de cada uma das diluições da solução-mãe. Em seguida, as respectivas absorbâncias a 595nm foram determinadas em espectrofotômetro, utilizando-se água em lugar de solução-padrão para o branco. 3. Resultados e Discussão A curva de calibração é apresentada na Figura 1. Conforme pode ser observado, a correlação entre absorbância a 595nm e concentração de albumina bovina se mostrou linear para concentrações de albumina variando entre 4,2 e 208μg/mL. y = 0,004x - 0,0005 R2 = 0,9967 0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 0,0 50,0 100,0 150,0 200,0 250,0 Concentração de albumina bovina (µg/mL) Absorbânciaa595nm(-) Figura 1: Curva elaborada para a quantificação de proteínas pelo método de Bradford 4. Conclusão Durante o preparo das soluções-padrão, a dissolução da albumina bovina em tampão salino se mostrou uma estratégia eficiente para eliminar a necessidade de agitação excessiva e aquecimento. Tais medidas, necessárias para solubilizar a proteína em água e ou solução- tampão, provocaram intensa formação de espuma. 5. Referências Bibliográficas [1] Bradford, M. Analytical Biochemistry. 72, 248-254, 1976. Agradecimento: Fapesp e CNPq

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