Antibioticos

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Antibioticos

  1. 1. Medición de antibióticos en fluidos corporales. JUANDO BACTER.
  2. 2. Introducción La designación de antibióticos actualmente se realiza teniendo en cuenta sus propiedades particulares de distribución. Penetración de la barrera Vida media mas larga hemato-encefálica Con la disponibilidad de las pruebas rápidas la medición en sangre y otros fluidos es factible, conveniente y ampliamente practicables. Aminoglucósidos acceso a Absorción vía oral: NSA Unión a proteínas plasmáticas: baja (10%-50%)  Ototoxicidad  NefrotoxicidadBlack et al. La Ototoxicidad se relaciona tanto con niveles picos como valle, valor de p <0.05
  3. 3. Diferentes estudios demuestran quela eficacia se correlaciona con el nivel pico de los antibióticos en suero. La toxicidad se ha correlacionado tanto con los niveles pico como el valle de los niveles en suero. Es difícil probar la que toxicidad ocurre a un nivel particular en sangre.Toxicidad/relaciónTerapéutica de losAminoglucósidos masUtilizados.
  4. 4. Como elegir un prueba La FDA publica los métodos oficiales para laspreparaciones farmacéuticas. No existe una guía para la determinación clínica de antibióticos en sangre ytejidos. Como resultado, hay un grupo heterogéneo de ensayos y condiciones para que cada laboratorio elija.• The American Society for Clinical Pathology (chicago IL) tiene controles de calidad que son enviados periódicamente.• La técnica de difusión en agar es sencilla, el único parámetro que necesita un rígido control es la preparación del estándar de antibiótico.
  5. 5. Ventajas y desventajas de las distintas pruebas para cuantificar antibióticos en fluidos corporales.Elección del método• Tipo de laboratorio• Numero de muestras procesadas• Equipos disponibles• Facilidad del laboratorio• >10 muestras por día : automatizado
  6. 6. Manipulación de las muestras Obtención de procesar lo antes posible Cada antibiótico pierde las muestras su potencia de forma diferente. Almacenamiento AG>estables que < 4°C mismo día penicilinas -20°C, 4 días -70°CTejidos 2-3 horas -20°C >24 h -70°C
  7. 7. Fluidos diferentes a sangreNo están estandarizados.• Diferentes tipos y cantidades de proteínas• Valores de pH diferentes• Componentes químicos• Componentes celulares No hay un método para analizar antibióticos en todos los fluidos.
  8. 8. Ensayos microbiológicosSe basa en la determinación del nivel de unantibiótico, por una respuesta microbiológica definida a una serie de concentraciones de antibióticos por una cepa de un microorganismo analizado.
  9. 9. Método en agar3 categorías generales.Uni, bi y tridimensional.• Unidimensional: usa un tubo capilar, se vierte el agar y se deja secar. La suspensión del antibiótico se pipetea dentro de la superficie del agar endurecido, y se forman zonas de inhibición en una dimensión. Ideal para bacterias aerobias. Muy usado en Japón, poco conocido en los laboratorios clínicos del mundo.o Desventajas: no puede automatizarse, consume mucho tiempo, compleja preparación.Es usado en población pediátrica donde lamuestra obtenida es muy poca. Se usapoco, se usa mas bi o tridimensional.
  10. 10. Bidimensional: el antibiótico se difunde directamente contra lapared de la bacteria analizada.• Se considera bidireccional porque la cantidad de antibiótico que se difunde desde la fuente es igual en todo el agar.Tridimensional: el antibiótico viaja directamente bajo el botón de la placa de petri así como a largo de la superficie del agarLa mayor desventaja de los ensayos microbiológicos es que genera una pendiente empinada, especialmente para los ensayos con antibióticos Aminoglucósidos.
  11. 11. Elementos que influyen en los ensayos microbiológicos Deben contralarse las condiciones que afectan la acción de los antibióticos y el crecimiento de los microorganismos.• Diseño: debe asegurarse que la producción de los halos de inhibición alrededor del disco es directamente proporcional a la cantidad de antibiótico presente en esta fuente. Debería tenerse certeza que la respuesta es lineal dentro de los rangos normales encontrados en muestras clínicas.• Medio: existen 11 medios diferentes, lo cual no es un factor independiente, pero se relaciona con el método de ensayo y el organismo analizado. Un medio que presenta bueno resultados para un organismo, puedo no ser el optimo para otro microorganismo.• Estándar de antibióticos: es el factor mas critico en los ensayos. Cada antibiótico tiene diferente actividad a diferentes valores de pH. Los antibióticos son disueltos en los buffer apropiados a altas concentraciones, se almacenan en alícuotas de 1 ml a (-20°C) no por mas de 3 meses. o Aminoglucósidos: estables o Penicilinas: lábiles
  12. 12. • La dilución del buffer se hace en el fluido apropiado para su uso.• Los antibióticos deben ser pesados en balanza analítica y calcular la potencia en mg del polvo.• Es importante también que no halla una segunda sustancia antibiótica en el estándar de antibióticos, porque los materiales farmacéuticos pueden contener conservantes que no son recomendados, se usa solo en emergencias.• Para la determinación de niveles de antibióticos en sangre, debe ser usada sangre o suero. Otros fluidos o Suero equino o Suero bovino o Suero humano normal o Suero humano inactivado a 56°C por 30 min o Suero bovino albumina SBA o Suero fetal de ternero.
  13. 13. • Factores físicos: el tamaño del disco puede afectar la eficiencia del ensayo. Si se usa el disco recomendado 740-E se debe añadir 20 µl de muestra. El máximo crecimiento de este disco es de 25 µl.• Técnica es 5 a 6 veces mas sensible que la que usa discos de papel.
  14. 14. Elección del organismo Es simple la búsqueda de un solo antibiótico, pero cuando se buscan varios debe tenerse mas precaución, se debe tener en cuenta el sinergismo y antagonismo. La forma optima seria separar los compuestos químicos por electroforesis o cromatografía.• Los organismos mas comúnmente usados para la medición de antibióticos en sangre son: Bacillus sp. S.aureus Sarcina lutea. Streptococcus sp. Providencia sp. Clostridium sp. Klebsiella sp. Hongos y bacterias Bacterias bioluminiscentes
  15. 15. Ensayo unidimensional.• Bacterias aeróbicas, poco crecimiento para el ensayo.Medio: agar nutritivo 1% de peptona, pH 7.8 (varia dependiendo del antibiótico) 19 ml se dispensa para almacenamiento.Procedimiento: se incuba toda la noche en tripticasa soya, se diluye 1:100 y se agita bien. Antes de usar se calienta a 48°C.Se añade 1ml de la suspensión bacteriana a 19 ml del agar, agitar bien. Pipetear el agar dentro de tubo cónico de 3mm, se deja secar (cada estándar se deposita en un tubo diferente).Se repite 3 veces cada estándar igual que el suero del paciente. El crecimiento debe ser de 1.5 mm por encima de las capas del agar. Se incuban los tubos a 37°C toda la noche.Interpretación: se mide la distancia donde el punto de crecimiento del paciente y el agar se encuentran (meñisco) en mm. Los resultados se calculan en las graficas de dosis-respuesta. En el eje Y se traza la concentración del antibiótico y en el X la distancia de inhibición.
  16. 16. Ensayo tridimensional.Se ajusta el medio Difco al pH 7.9. puede ser almacenado en 25 ml de crecimiento por 1 mes. Antes del ensayo, se descongelan alícuotas de 0.4 ml a 50°C, se añade crecimiento de Klebsiella en agar tripticasa soya. Se mezcla la solución y se sirve en 2 placas de petri plásticas.Procedimiento: se pipetea 0.002 ml (2µl) de suero del paciente con pipetas estériles desechables, sobre discos 740-E.
  17. 17. Calculo de los resultados: se usan cálculos de curvas de dosis respuesta (diámetro vsconcentración), sin embargo, si el rango de concentración es 4 veces mayor, se grafica laconcentración del antibiótico vs el cuadrado del diámetro. Resultado de los métodos microbiológicos: 4 horas o menos.
  18. 18. Método en caldo • Método turbidimetria.Turbidimetria se refiere a cualquier técnica que dependa de los cambios de crecimiento de la bacteria en el medio liquido como medida de crecimiento en solución antibiótica.El cambio en el numero de bacterias es medidodirectamente por fotometría o por la producción de cambios en el pH o la relación de CO2.
  19. 19. Formula de crecimiento por unidad vs porcentaje de transmisión de la densidad óptica de la suspensión bacteriana. Log (I0/I): OD: (N) [Eab)/2.3]I0: cantidad de luz que sale de la suspensiónOD: densidad ópticaN: masa bacterianaE: coeficiente de extinción de las partículasa: área de efectividad óptica de la partículab: densidad de la suspensión
  20. 20. Abbott MS-2 Dispositivo que monitorea continuamente el crecimiento bacteriano en unidades de densidad óptica. Usado paradeterminar niveles de antibióticos en sangre bajo condiciones clínicas usando el análisis de curva de crecimiento. Fase logarítmica, sembrado bajo los compartimientos donde c/u tiene un disco. Diodos de luz roja 3 h, DO se grafica. El medio se inocula dentro de las cubetas.
  21. 21. Ensayo de cambio de pH• Los antibióticos actúan interfiriendo el crecimiento y/o metabolismos de las bacterias.• Los cambios en la actividad metabólica de la bacteria bajo la influencia de los antibióticos puede ser usada para medir la concentración de antibióticos.• P.pio: >antibióticos en contacto con la población bacteriana > será la modificación de las vías metabólicas.• Si no esta el antibiótico presente, la bacteria crece y habrá cambio de pH por metabolización de un componente (azúcar, urea..etc.), si el antibiótico se añade se afecta el sistema del microorganismo y los cambios en el pH son mínimos.
  22. 22. Ensayo de medición de ATP.• Utiliza ATP endógeno de una cepa de Klebsiella edwardsii.• Se inocula el estándar con la cepa analizada en paralelo con el suero de los pacientes. Después de 2 horas de incubación a 37°C, se extraen los tubos con una solución de EDTA/H2S04 y la cantidad de ATP bacteriano es determinado en un espectrofotómetro. Una grafica de concentración de antibiótico vs cantidad relativa de ATP es usada para calcular la cantidad de antibiótico en sangre.
  23. 23. BioluminiscenciaEnvuelve el uso de la luminiscencia bacteriana para determinar la actividad antibiótica en suero.Procedimiento: la actividad bacteriana en el suero es inactivado por calentamiento a 56°C por 30 minutos. Se añade 0.8 ml de suero, 0.2 ml de NaCl al 10% y buffer 1.5% . El pH final es de 7.9. después de 10 minutos de pre incubación a 30°C, se añade proflavina para una concentración final de 1.5 µg/ml a un pH de 7.9 o 25 µg/ml a pH 6.0. se incuban los viales con movimientos suaves a 30°C. se lee la luminiscencia con un fotómetro/fotomultiplicador que es universalmente proporcional a la concentración del antibiótico. Proflavina se intercala en el ADN e induce el sistema de luminiscencia de bacterias mutantes en la oscuridad.
  24. 24. Concentración inhibitoria en suero, y concentración bactericida en suero.• Procedimiento: se ajusta la concentración entre 105 106 UFC/ml en cada tubo. 0.1 ml de cada dilución 1:100 y 1:1000 son inoculadas en la superficie del agar apropiado. Después de incubar toda la noche se calcula el inoculo de el numero de UFC entre 20-200 colonias. El resto del procedimiento se maneja muy parecido a la CIM/CBM.• Se añade 1ml de suero al primer tubo, se mezcla bien, se añade 1 ml del tubo 1 al 2 y se mezcla, 1 ml del tubo 2 se añade al tubo 3. esto continua hasta el ultimo tubo 12, que recibe 2 ml de caldo. Se remueve entonces 1 ml de este tubo a uno estéril para el control de esterilidad del medio. La concentración de la bacteria queda entre 105 106 UFC/ml.• Se incuba 18-24 horas a 35 °C.• La menor concentración del suero del paciente que presente una completa inhibición visible de crecimiento será el SIC.• La concentración se convierte a títulos por esta formula. Titulo: 1/dilución.• La SBC es la menor concentración del suero que mata el 99.9%.• No es muy usado por la dificultad de calibrar el inoculo, el medio de cultivo, tiempo de incubación…etc.
  25. 25. Ensayos químicos directos Ensayos radio-enzimáticos • Sirven para determinar • La adenilación y la acetilación sustancias son las bases de los ensayos químicas, sustancias activas radio-enzimáticos. y los subproductos. Ya que • La cantidad de adenilación y acetilación producida en el reacciona con grupos caldo es directamente químicos específicos de la proporcional a la cantidad de molécula antibiótica. Es útil antibiótico en la solución. en farmacéutica cuando se • La sonicación es una técnica analizan sustancias rápida y sencilla para obtener puras, pero in vivo mas del las enzimas tan eficiente como el shock osmótico. 95% no conservan su estado • Las enzimas son estables por nativo. 24 horas a 4°C y 30 días a (-• No son realizados de rutina 20°C) con BSA. el los laboratorios clínicos.
  26. 26. Análisis químico de la fluorescencia directa Procedimiento• Una molécula es fluorescente cuando puede recibir luz en una • 0.2 ml de la muestra (sangre o longitud de onda y la emite en otra no) se mezcla con 0.4 ml de longitud de onda. buffer fosfato y se extrae Ventajas y desventajas completamente con 2.5 ml deLos otras sustancias usadas para el acetato de amilo. Se ensayo pueden también producir centrifuga. Se transfiere el fluorescencia. sobrenadante a una cubeta de Son mucho mas sensibles que los Fluorometría. Se añade 0.6 ml ensayos químicos y es capaz de dar de el reactivo fluorescente. Se resultados no solo en agita por 5 min. La nanogramos, sino también en fluorescencia es color picogramos por mililitros. Puede turquesa. Se montan también distinguirse entre antibióticos activos e inactivos. estándares y controles.
  27. 27. Ensayos inmunológicosLos altos costos de los equipos para realizar RIA a retrasado mucho estas técnicas, además, debe mantenerse grandes cantidades de stock de isótopos radioactivos, lo que impulso el uso de isótopos no radioactivos. Todas las RIAs para antibióticos emplean 2 pasos en general: 1. Envuelve 3 componentes: Ag radiomarcado (Antib), Ac alta avidez contra Ag y Ag radiomarcado (Antib px) 2. Cuando se alcanza el equilibrio se debe determinar la cantidad de anticuerpos ligados. La medición de estas uniones determina la cantidad de antibiótico.Tiene como ventaja la alta especificidad, se presentan algunas reacciones cruzadas entre antibióticos de la misma familia pero nunca entre diferentes.
  28. 28. Inmunoensayos no radioactivos.La enzima o la sustancia fluorescente se une al antígeno o anticuerpo de tal manera que la actividad del compuesto original no es afectado sensiblemente.La diferencia entre RIA y ensayos no radioactivos es la manera como se evidencia la aglutinación. Se mide la velocidad de reacción de la enzima y no mide la actividad radioactiva. v: V [S/(S + Km)]v: medida de la velocidad de reacciónS: concentración del sustratoKm: constanteMucho mas sensible que los métodos espectofotométricos. La base de estos ensayos es la preparación de un conjugado hapteno-proteína, donde el hapteno (Antib) y la proteína (enzima) funcionan naturalmente.
  29. 29. Técnica de inmunoensayo de enzimas múltiples.Fue desarrollado del método de • Ventajas radicales libres que emplea un Pequeño volumen de muestra conjugado para detectar Analiza todos los antibióticos medicamentos por espectrofotometría y No se requiere mucha habilidad resonancia de electrones. Automatizable Requiere equipo muy Resultados rápidos especializado. • Desventajas La principal reacción es la Altos costos alteración de la actividad de una enzima cuando el Analiza los medicamentos uno a conjugado medicamento- uno enzima es ligado al anticuerpo. Puede tener interferencia con Esto causa un cambio medible otros metabolitos en la cantidad de productos Puede medir metabolitos liberados. inactivos
  30. 30. Análisis cromatográficos • Utilizan la habilidad de un Cromatografía liquida de alto compuesto en un tipo de rendimiento solución para ser selectivamente removido de Método de referencia de esta solución dentro de un aplicación en clínica. ensayo absorbente y cuantitativo. De elección para análisis de • Ventajas: analiza los penicilinas y cefalosporinas. compuestos por separado, es Es usado en laboratorios rápido y sensible (0.5-1 μg/ml) modernos para medir agentes• Desventajas: personal experto, anticonvulsivantes y caro, uso de varios antiarrítmicos procedimientos de extracción.
  31. 31. Pasos básicos HPLC• Extracción del medicamento con un solvente especifico. • Separación de el medicamento en la fase sólida por HPLC. • Detección del efluente de fase sólida por fotometría. • Cuantificación de la cantidad de antibiótico presente por análisis de picos altos o picos de área de análisis.
  32. 32. Cromatografía de gases-liquido. Cromatografía de capa delgada. Fue usada para realizar • Es usado en laboratorios ensayos de antibióticos que clínicos para separar pueden ser volátiles. compuestos de alto peso Pasos: molecular en compuestos biológicamente activos.• Extraer el medicamento del suero Resonancia magnética • Conversión del espectroscópica nuclear. medicamento a su forma No están disponibles en clínica volátil. pero están bajo investigación. • Separación por GLC Cuando los núcleos giran en un • Detección por campo magnético son ionización, captura de irradiados por un segundo electrones…etc. campo magnético perpendicular, que cambia sus • Detección del alineaciones a un nuevo medicamentos por altos campo. picos o picos de área.
  33. 33. Mycobacterium tuberculosisPara que se miden niveles de medicamentos antituberculosos en los fluidos??• Prevenir reacciones toxicas que ocurren en medicamentos como cicloserina y Aminoglucósidos• Determinar si la concentración en tejidos o fluidos es adecuada para una terapia efectiva• Monitorear el cumplimiento de los pacientes• Monitorizar el metabolismo de ciertas drogas, como el fenotipo acetilador de Isoniazida.• Para investigación.• Daño renal, mala absorción, problemas hepáticos…etc.
  34. 34. Mycobacterium tuberculosis• El monitoreo de los medicamentos antituberculosos es realizado en todos los casos de aislamientos MDR en el NJCIRM, por la necesidad de asegurar que la concentración máxima del medicamento exceda al MIC de la cepa MDR• Se usan 3 técnicas para detectar los niveles de medicamentos antituberculosos en materiales biológicos:1. Bioensayos2. Métodos fluorométricos y espectofotometricos3. Métodos cromatográficos
  35. 35. Las muestra de suero deben ser recolectadas en las horas picos de acción del medicamento antituberculoso.
  36. 36. También otros factores pueden interferir en la absorción y en la biodisponibilidad del medicamento:
  37. 37. Preparación de la muestra• La incorrecta preparación de la • Dependiendo del método de muestra puede resultar en la análisis, las proteínas pueden perdida de la actividad de l ser removidas por tratamiento medicamento como con 5 o 10% acido consecuencia de un tricloroacetato o sulfato de combinación con una proteína amonio. Se almacenan a 4 °C o conversión del por 2 semanas o congeladas a medicamentos a formas (-20°C) por tiempo indefinido. inactivas o a derivados lábiles. • Las muestras recolectadas • es necesario estabilizar la para análisis de Rifampicina Isoniazida a (-20°C) porque, el deben ser tratadas con acido compuesto se pierde ascórbico y almacenadas a (- rápidamente por la Activación 20°C) por hasta 3 meses. de proteínas. Estas proteínas • ETB, PIZ, PAS, ETH, PTH no son generalmente interfieren en afectados por otras proteínas los métodos fluorometricos. u oxidación.
  38. 38. Los bioensayos son sensibles, no tan caros, pero requieren experiencia, puededemorarse algunos días y son relativamente imprecisos. No pueden distinguir entre los metabolitos activos e inactivos. Isoniazida Rifampicina • La acetilación de Isoniazida es la principal y • Es un compuesto relativamente clínicamente mas importante vía metabólica de su metabolismo. El producto principal que del inestable en agua , y a un pH de 2-3 metabolismo de la Isoniazida es N-acetil- la Rifampicina es fácilmente isoniazida que es catabolizada por la N-acetil- hidrolizado a 3-formil-rifampicina y transferasa en el hígado e intestino. • Los niveles de N-acetil-transferasa en un 1-amino-4-metilpiperazina. En pH paciente influyen en la concentración de alcalino, en presencia de aire monoacetil-hidrazona y diacetil-hidrazona en la atmosférico, la Rifampicina se oxida orina, y esta es la base para determinar los fácilmente a rifampicina-quinona. ensayos del estado acetilador de pacientes.• El ensayo espectrofluorometrico puede medir • Sin embargo, la solución de isoniazida y acetilisoniazida y solo requiere un Rifampicina puede ser estabilizado volumen de 200 µl. • Se ha descrito también HPLC para medir la por la adición de ascorbato de concentración de isoniazida y acetilisoniazida en sodio (200 µg/ml) y soluciones de fluidos y tejidos. Rifampicina en dimetilsulfoxido (10 • El método El-Sayed and Islam fue usado para mg/ml) son estables por varias medir específicamente la concentración de Isoniazida y acetilisoniazida para el fenotipo semanas. acetilador.
  39. 39. Pirazinamida Etambutol • El ensayo espectrofotométrico• Cuando los pacientes están ha sido descrito para la siendo tratados con cuantificación de Etambutol en Pirazinamida , se pueden liquido cerebro espinal y orina. Las muestras son extraídas con monitorear los valores de la cloroformo y reveladas con concentración tanto de azul de bromotimol. Pirazinamida como de acido • Se ha descrito bioensayos para pirazinoico para prevenir determinar Etambutol en suero. efectos adversos, • Una variedad de cromatografía principalmente de gases y cromatografía de hiperuricemia. masa fueron descritos para medir la concentración de Etambutol en fluidos biológicos.
  40. 40. Aminoglucósidos EtionamidaEstreptomicina, Capreomicina • Se describe un método y kanamicina pueden ser HPLC que distingue entre medidos de fluidos Etionamida, protionamida y biológicos y tejidos usando los metabolitos sulfoxido. se un bioensayo descrito por observo que estos método McClatchy. son capaces de medir Estreptomicina y kanamicina concentraciones menores pueden ser medidos por de 10-50 ng/ml. inmunoensayo de polarización de fluorescencia (FPI) usando el sistema comercial Abbott TDX.

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