Detekce poškození DNA pomocí PCR

1. OSTRAVSKÁ UNIVERZITA V OSTRAVĚ FAKULTA PŘÍRODOVĚDECKÁ KATEDRA BIOLOGIE A EKOLOGIE Detekce poškození DNA pomocí PCR BAKALÁŘSKÁ PRÁCE 2009 Autor práce: Eva Klemensová Vedoucí práce: RNDr. Petr Pečinka, CSc.

2. Obsah <ul><li>Cíle </li></ul><ul><li>Úvod </li></ul><ul><ul><li>Křížová struktura DNA </li></ul></ul><ul><ul><li>PCR </li></ul></ul><ul><ul><li>Přirozená metylace DNA </li></ul></ul><ul><ul><li>Alkylační činidla </li></ul></ul><ul><ul><li>Oxidační činidla </li></ul></ul><ul><li>Metody </li></ul><ul><li>Výsledky </li></ul><ul><li>Diskuse </li></ul><ul><li>Závěr </li></ul><ul><li>Literatura </li></ul>

3. Cíle <ul><li>izolace plasmidové DNA s vhodnými sekvencemi pro metylaci jednořetězcových nebo dvouřetězcových úseků DNA </li></ul><ul><li>ověření možnosti použití polymerázové řetězové reakce pro detekci DNA poškozené metylačními činidly </li></ul><ul><li>pokusit se optimalizovat podmínky pro detekci poškozené DNA </li></ul>

4. Úvod <ul><li>pPGM1 a pPGM2 vytvořeny vložením palindromatické nukleotidové sekvence do pBluescript II SK (-) do místa vzniklého štěpením HindIII </li></ul><ul><li>pBluescript II SK (-) slouží jako kontrola pro srovnání </li></ul><ul><li>palindromatická sekvence má schopnost tvořit křížovou strukturu u pPGM2, u pPGM1 méně ochotně </li></ul><ul><li>Křížová struktura DNA </li></ul><ul><li>jednořetězcový úsek – vlásenku (hairpin loop), kde se naváže metylová skupina MMS </li></ul><ul><li>při polymerázové řetězové reakci dochází v místě metylace k blokaci syntézy DNA </li></ul><ul><li>Polymerázová řetězová reakce (PCR) </li></ul><ul><li>zmnožení DNA nebo jen její části </li></ul><ul><li>cyklická denaturace původních a syntéza nových řetězců vybraných úseků dvouřetězcové DNA prostřednictvím termostabilní DNA-polymerázy z termostabilních mikroorganismů např. Taq DNA-polymeráza </li></ul><ul><li>vymezení žádaného úseku dvěma primery (stejná Tm) </li></ul><ul><li>přístroj termocykler </li></ul><ul><li>exponenciálně roste (2 n , n = počet cyklů) počet kopií vybraného úseku </li></ul>AG A CATG C CTAGGCATGTCT Amp r pPGM2 AG G CATG T CTAGGCATGTCT Amp r pPGM1 - Amp r pBluescript II SK- vložená s ekvence rezistence plasmid

5. Alkylační činidla <ul><li>metylmetansulfonát, etylmetansulfonát, </li></ul><ul><li>N-metyl-N-nitrosomočovina </li></ul><ul><li>Metylmetansulfonát (MMS) </li></ul><ul><li>činidlo poškozující DNA, mutagen, karcinogen </li></ul><ul><li>vznik N7-metylguaninu a N3-metyladeninu </li></ul><ul><li>blokace syntézy DNA při PCR </li></ul><ul><li>větší reaktivita s jednořetězcovou DNA </li></ul>Přirozená metylace DNA <ul><ul><li>bakterie - označení vlastní DNA a k rozpoznání cizorodé DNA (C5- metylcytosin), regulace replikace a postreplikační opravy (N6-metyladenin) </li></ul></ul><ul><ul><li>obratlovci - regulace genové exprese (C5-metylcytosin v CG dubletech) </li></ul></ul><ul><ul><li>rostliny - triplety CNG </li></ul></ul>

6. Oxidační činidla <ul><li>manganistan draselný, hydroxylové radikály </li></ul><ul><li>dvouřetězcová DNA oxidovaná velmi pomalu, jednořetězcová DNA snadněji </li></ul><ul><li>především reakce s thyminem, výsledný produkt má na C5 a C6 navázány hydroxylové skupiny </li></ul><ul><li>fagocytující buňky obsahují OH ۠ , má mikrobicidní účinek </li></ul>

7. <ul><li>Příprava buněk pro izolaci plasmidové DNA </li></ul><ul><li>Alkalická lyze buněk </li></ul><ul><li>odstranění chromozomální DNA a proteinů vysrážením, centrifugace, slití přes gázu </li></ul><ul><li>Nanesení roztoku plasmidové DNA na kolonu QIAGEN </li></ul><ul><li>zachycení záporně nabitých nukleových kyselin na kladně nabitých koncích DEAE (pH 7) v koloně </li></ul><ul><li>Modifikace s plasmidové DNA s MMS </li></ul><ul><li>všechny koncentrace byly zastoupeny paralelně a inkubovány při teplotě 37 °C : </li></ul><ul><ul><ul><li>jedna koncentrační řada po dobu 5 minut </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>druhá po dobu 30 minut </li></ul></ul></ul><ul><li>Přečištění plasmidové DNA </li></ul>Metody

8. PCR modifikované plasmidové DNA <ul><li>Nastavení teplot v termocykleru: </li></ul><ul><ul><li>počáteční denaturační fáze 5 min při 94 °C </li></ul></ul><ul><ul><li>další denaturační fáze 30 s při 94 °C </li></ul></ul><ul><ul><li>hybridizační fáze 30 s při 60 °C </li></ul></ul><ul><ul><li>syntetická 60 s při 72 °C </li></ul></ul><ul><li>Agarózová gelová elektroforéza </li></ul>Obsah PCR zkumavky: 1 μ l plasmidová DNA (0,3 μ g/ml pPGM1; 0,4 μ g/ml pPGM2; 0,8 μ g/ml pBSK-) 6,5 μ l destilovaná voda 1 μ l 10x koncentrovaného pufru pro Taq DNA-polymerázu 0,5 μ l Taq DNA-polymeráza (5000 U/ml) 0,25 μ l buď primer T7 nebo B500for + 0,25 μ l buď primer SK nebo B900rev (100 μM) 0,125 μ l dATP; 0,125 μ l dGTP; 0,125 μ l dCTP; 0,125 μ l dTTP (10 mM)

9. Výsledky

10. Dráha: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Konc. MMS (mM): 0 1,2 11,8 119,2 0,6 5,9 59,3 621,3 0,6 5,9 59,3 621,3 1,2 11,8 119,2 Inkubace 5 min Inkubace 30 min Modifikace pPGM2 s MMS po 10 cyklech PCR Elektroforéza proběhla při 80 V, 1 hod, na 1% gelu. Dráha 1 : plasmid bez MMS jako kontrola, dráhy 2-8 : stoupající koncentrace (0,005-5% neboli 0,6-621,3 mM) MMS po inkubaci 5 minut, dráhy 9-15 : stejné stoupající koncentrace MMS po inkubaci 30 minut.

11. Dráha: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Konc. MMS (mM): 0 1,2 11,8 119,2 0,6 5,9 59,3 621,3 0,6 5,9 59,3 621,3 1,2 11,8 119,2 Inkubace 5 min Inkubace 30 min Modifikace pPGM2 s MMS po 15 cyklech PCR Elektroforéza proběhla při 80 V, 1 hod, na 1% gelu. Dráha 1 : plasmid bez MMS jako kontrola, dráhy 2-8 : stoupající koncentrace (0,005-5% neboli 0,6-621,3 mM) MMS po inkubaci 5 minut, dráhy 9-15 : stejné stoupající koncentrace MMS (0,005-5% neboli 0,6-621,3 mM) po inkubaci 30 minut.

12. Dráha: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Konc. MMS (M): 0 0,12 1,31 2,95 0,12 1,31 2,95 0,06 0,62 2,08 0,06 0,62 2,08 0 Inkubace 5 min Inkubace 30 min Modifikace pPGM2 s MMS po 10 cyklech PCR Elektroforéza proběhla při 80 V, 1 hod, na 1% gelu. Dráhy 1,14 : plasmid bez MMS jako kontrola, dráhy 2-7 : stoupající koncentrace MMS (0,5-20 % neboli 0,06-2,95 M) po inkubaci 5 minut, dráhy 8-13 : stejné stoupající koncentrace MMS (0,5-20 % neboli 0,06-2,95 M) po inkubaci 30 minut.

13. Dráha: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Konc. MMS (M): 0 0,12 1,31 2,95 0,12 1,31 2,95 0,06 0,62 2,08 0,06 0,62 2,08 0 Inkubace 5 min Inkubace 30 min Modifikace pPGM2 s MMS po 15 cyklech PCR Elektroforéza proběhla při 80 V, 1 hod, na 1% gelu. Dráhy 1,14 : plasmid bez MMS jako kontrola, dráhy 2-7 : stoupající koncentrace MMS (0,5-20 % neboli 0,06-2,95 M) po inkubaci 5 minut, dráhy 8-13 : stejné stoupající koncentrace MMS (0,5-20 % neboli 0,06-2,95 M) po inkubaci 30 minut.

14. Dráha: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Konc. MMS (M): 0 0,12 1,31 2,95 0,12 1,31 2,95 0,06 0,62 2,08 0,06 0,62 2,08 0 Inkubace 5 min Inkubace 30 min Modifikace pPGM1 s MMS po 10 cyklech PCR Elektroforéza proběhla při 80 V, 1 hod a 40 min, na 1% gelu. Dráhy 1,15 : plasmid bez MMS jako kontrola, dráhy 2-7 : stoupající koncentrace MMS (0,5-20 % neboli 0,06-2,95 M) po inkubaci 5 minut, dráha 8 : standard (100 bp), dráhy 9-14 : stejné stoupající koncentrace MMS (0,5-20 % neboli 0,06-2,95 M) po inkubaci 30 minut. 1000 bp 900 bp 800 bp 700 bp 600 bp 500 bp 400 bp 300 bp 200 bp 100 bp

15. Dráha: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Konc. MMS (M): 0 0,12 1,31 2,95 0,12 1,31 2,95 0,06 0,62 2,08 0,06 0,62 2,08 0 Inkubace 5 min Inkubace 30 min Modifikace pBluescript II SK (-) s MMS po 10 cyklech PCR Elektroforéza proběhla při 80 V, 1 hod, na 1% gelu. Dráhy 1,15 : plasmid bez MMS jako kontrola, dráhy 2-7 : stoupající koncentrace MMS (0,5-20 % neboli 0,06-2,95 M) po inkubaci 5 minut, dráha 8 : standard (100 bp+1 kb), dráhy 9-14 : stejné stoupající koncentrace MMS (0,5-20 % neboli 0,06-2,95 M) po inkubaci 30 minut. 10000 bp 8000 bp 6000 bp 5000 bp 4000 bp 3500 bp 3000 bp 2500 bp 2000 bp 1500 bp 1000 bp 900 bp 800 bp 750 bp 700 bp 600 bp 500 bp 400 bp 300 bp 250 bp 200 bp 100 bp

16. Dráha: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Konc. MMS (mM): 0,12 1,31 2,95 0,12 1,31 2,95 0 0,62 2,08 0,62 2,08 0 Inkubace 5 min Inkubace 30 min Modifikace pBluescript II SK (-) s MMS po 10 cyklech PCR Elektroforéza proběhla při 80 V, 1 hod a 40 min, na 1% gelu. Dráhy 1,13 : plasmid bez MMS jako kontrola, dráhy 2-6 : stoupající koncentrace MMS (1-20 % neboli 0,12-2,95 M) po inkubaci 5 minut, dráha 7 : standard (100 bp), dráhy 9-12 : stejné stoupající koncentrace MMS (1-20 % neboli 0,12-2,95 M) po inkubaci 30 minut. 1000 bp 900 bp 800 bp 700 bp 600 bp 500 bp 400 bp 300 bp 200 bp 100 bp

17. Dráha: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Zkouška znečištění na pBluescript II SK(-) a pPGM1 po 30 cyklech PCR Elektroforéza proběhla při 80 V, 1 hod a 40 min, na 1% gelu. Dráhy 1-4 : pBluescript II SK(-), dráha 5 : standard (100 bp), dráhy 6-9 : pPGM1. Dráhy 1 a 6 obsahují vše (plasmid, Taq DNA-polymeráza, pufr, dest.voda, primery, dNTP), dráhy 2 a 7 : vše bez primerů, 3 a 8 : vše bez plasmidu, 4 a 9 : vše bez Taq DNA-polymerázy. Neustále byla zjišťována příčina krátkých úseků, nakonec je vysvětleno, že důvodem je znečištění primerů. Ve dráhách 2 a 7, kde nejsou obsaženy primery se neobjevuje znečištění. 1000 bp 900 bp 800 bp 700 bp 600 bp 500 bp 400 bp 300 bp 200 bp 100 bp pBluesript II SK(-) pPGM1

18. Diskuse <ul><li>pPGM2 - sekvence schopná vytvořit křížovou strukturu -> možná detekce poškození DNA s MMS </li></ul><ul><ul><ul><li>metylace vlásenky -> blokace syntézy DNA při PCR -> snížení intenzity DNA se zvyšováním koncentrace MMS ve vzorcích </li></ul></ul></ul><ul><li>pPGM1 - menší schopnost tvorby křížové struktury -> nezaznamenáno poškození DNA pomocí PCR </li></ul><ul><ul><ul><li>malé rozestupy mezi koncentracemi a nízké koncentrace MMS nebo není identifikace pomocí PCR možná </li></ul></ul></ul><ul><li>působení MMS závislé na čase </li></ul><ul><ul><ul><li>inkubace 5 minut s MMS při 37 °C - intenzita nasyntetizovaných úseků DNA klesala mírněji </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>30ti minutová inkubace při 37 °C - větší pokles intenzity DNA </li></ul></ul></ul><ul><li>u primerů vymezujících kratší úseky při stejných koncentracích MMS nasyntetizováno více úseků DNA - delší úseky obsahují více míst pro metylaci </li></ul><ul><li>v příští práci: </li></ul><ul><ul><ul><li>detekce poškození DNA s MMS pomocí více různých primerů vymezujících různě dlouhé úseky DNA a srovnat mezi sebou </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>větší rozestupy mezi koncentracemi MMS a vyšší koncentrace MMS s cílem pokusu o detekci poškození DNA u pPGM1 </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>optimalizace hybridizační teploty </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>prošetření metylace u dvouřetězcových úseků </li></ul></ul></ul>

19. Závěr <ul><li>izolovány plasmidy pPGM1 a pPGM2, pBluescript II SK(-) pro srovnání </li></ul><ul><li>pomocí PCR bylo detekováno poškození metylmetansulfonátem u pPGM2, ne u pPGM1 </li></ul><ul><li>podmínky při detekci: </li></ul><ul><ul><ul><li>primery vymezující kratší úseky 140 bází - koncentrace 0,005-5% MMS a těmto koncentracím odpovídající molární koncentrace 0,6-621,3 mM MMS </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>pro primery vymezující delší úseky 474 bází u pPGM2 - koncentrace MMS 0,5-20 % neboli 0,06-2,95 M </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>inkubace s MMS 5 a 30 minut při 37 °C </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>10 a 15 cyklů při PCR </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>elektroforetická separace při 80 V po dobu 1 hodiny nebo 1 hodiny a 40 minut na 1 % agarózovém gelu </li></ul></ul></ul>

20. Literatura <ul><li>Molekulární biologie 1-7. Metylace, reparace, rekombinace DNA, http://www. google . cz / search ?q=7.%09POSTREPLIKA%C4%8CN%C3%8D+MODIFIKACE+DNA& ie = utf -8& oe = utf -8& aq =t& rls = org . mozilla : cs : official & client = firefox -a , 11. června 2009. </li></ul><ul><li>WIKIPEDIA The Free Encyclopedia, </li></ul><ul><li>http://en.wikipedia.org/wiki/Methyl_methanesulfonate, 12. června 2009. </li></ul><ul><li>Lundin, C., North, M., Erixon, K., Walters, K., Jenssen, D., Goldman, A.S.H. and Helleday, T., Methyl methanesulfonate (MMS) produces heat-labile DNA damage but no detectable in vivo DNA double-strand breaks, Nucleic Acids Research, 33, 2005 3799-3811. </li></ul><ul><li>WIKIPEDIA The Free Encyclopedia, </li></ul><ul><li>http://en.wikipedia.org/wiki/Ethyl_methanesulfonate, 26. dubna 2009. </li></ul><ul><li>Rhaese, H.J., Boetker, N.K., The Molecular Basis of Mutagenesis by Methyl and Ethylsulfonates, Eur. J. Biochem., 1973, 32, 166-172. </li></ul><ul><li>Wurdeman, R.L., Douskey, M.C. and Gold, B., DNA methylation by N-methyl-N-nitrosourea: methylation pattern changes in single- and double-stranded DNA, and in RNA with mismatched or bulged guanines, Nucleic Acids Research, 1993, 21 4975-4980. </li></ul><ul><li>Bui, C.T., Rees, K., Cotton R.G., Permanganate oxidation reactions of DNA: perspective in biological studies, Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids, 22 (9), 2003, 1835-1855. </li></ul><ul><li>Pečinka, P., Použití chemických sond při studiu lokálních struktur DNA in vitro a in </li></ul><ul><li>situ, kandidátská disertační práce, Brno, 1993. </li></ul><ul><li>Friedberg, E.C., Walker, G.C., Siede, W., DNA Repair and Mutagenesis . ASM Press, 1995. ISBN 1-55581-088-8. </li></ul><ul><li>Pečinka, P., Laboratorní cvičení z molekulární biologie, Ostrava, 2007. ISBN 978-80-7368-414-3. </li></ul><ul><li>Paleček, E., Local Supercoil-Stabilized DNA Structures, Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, 26, 1991, 151-226. </li></ul><ul><li>Kogo, H., Inagaki, H., Ohye, T., Kato, T., Emanuel, B.S., and Kurahashi, H., Cruciform extrusion propensity of human translocation-mediating palindromic AT-rich repeats. Nucleic Acids Research. 35, 2007, 1198-1208. </li></ul><ul><li>Structure of nucleic acids, http:// images . google . cz / imgres ? imgurl =http://web. virginia . edu / Heidi /chapter12/ Images /8883n12_27. jpg & imgrefurl =http://web. virginia . edu / Heidi /chapter12/chp12. htm & usg =__hvefvvfO03eb7LwyYMgRkIUrIcY=&h=189&w=343& sz =10& hl = cs &start=9&um=1& tbnid =x4qpPQQPYqUJHM:& tbnh =66& tbnw =120& prev =/ images %3Fq%3DDNA%2Bcruciform%2Bstructure%26hl%3Dcs%26lr%3D%26client%3Dfirefox-a%26channel%3Ds%26rls%3Dorg. mozilla : cs : official %26sa%3DN%26um%3D1 , 20. dubna 2009. </li></ul><ul><li>Vierstraete A. Department of Biology, Faculty of Science, University of Ghett . 1999. </li></ul><ul><li>Citováno z: Linhartová, P., Molekulárně genetické metody pro studium příbuznosti kmenů Acidothiobacillus ferrooxidans, Bakalářská práce, Brno, 2006. </li></ul><ul><li>Šmarda, J., Doškař, J., Pantůček, R., Růžičková V., Koptíková, J., Metody molekulární biologie, Brno, Vydavatelství MU, 2005. ISBN 80-210-3841-1. </li></ul><ul><li>Fermentas LIFE SCIENCES, http://www. fermentas . com / techinfo / nucleicacids / mappbluescriptiiskks . htm , 8. dubna 2009. </li></ul><ul><li>WIKIPEDIA The Free Encyclopedia, </li></ul><ul><li>http://en.wikipedia.org/wiki/PCR, 19. června 2009. </li></ul><ul><li>NCBI, </li></ul><ul><li>http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/58062?report=genbank, 20. dubna 2009. </li></ul>

Detekce poškození DNA pomocí PCR

Ladislav Šigut

Detekce poškození DNA pomocí PCR