O documento descreve a tecnologia de produção de hibridomas utilizando o sistema de fagos. O processo envolve a imunização de animais, a inserção de genes de anticorpos em bacteriófagos, e a seleção de fagos que exibem moléculas específicas através de lavagens e eluições sucessivas. A técnica permite isolar clones que produzem anticorpos monoclonais de alta afinidade e especificidade para aplicações como diagnósticos e desenvolvimento de vacinas e drogas.

1. TECNOLOGIA DE PRODUÇÃO DE
HIBRIDOMA UTILIZANDO O SISTEMA
DE FAGOS
Arianna Lanxin
Ivson Cassiano
Mayla Abrahim
Virginia Andrade

2. TECNOLOGIA DE PRODUÇÃO DE
HIBRIDOMA UTILIZANDO O SISTEMA
DE FAGOS
Arianna Lanxin
Ivson Cassiano
Mayla Abrahim
Virginia Andrade

3. Hibridomas

4. Anticorpos
• São proteínas sintetizadas e excretadas por
plasmócitos, derivadas dos linfócitos B, usadas pelo
sistema imunológico para identificar e neutralizar corpos
estranhos como bactérias, vírus ou células tumorais.
Realizando assim a defesa do organismo (imunidade
humoral).

5. Anticorpo monoclonal
• Se liga a um determinado epítopo
• São imunoglobulinas geradas por uma população
geneticamente idêntica de células B
• Formam anticorpos idênticos

6. Mecanismos de transcrição do genoma do
bacteriófago na célula hospedeira

7. Phage display
O conceito de exposição em fagos foi introduzido
pela primeira vez para fragmentos peptídicos curtos
Expressão funcional de
polipetídeos de E. coli em
bacteriófagos com atividade
funcionalde enzimas
George P. Smith,
Science (1985)

8. Phage display
• Desde a sua descrição por Smith em 1985, a
tecnologia de “Phage Display”, exposição de
biomoléculas em fagos, tem apresentado uma
crescente utilização em diversas áreas das Ciências.
• Este autor foi pioneiro a conseguir a expressão da
enzima de restrição Eco RI como uma fusão da
proteína três (pIII) do capsídeo do fago.

9. Phage display
Métodos de estudos da interação entre biomoléculas
• Com o uso desta técnica, é possível selecionar e
isolar vetores de clonagem gerados a partir de bibliotecas
genômicas, juntamente com seu produto gênico (peptídeo).
• Por meio da utilização de fagos infecciosos filamentosos, esta
técnica permite o rastreamento dos clones devido a ligação
do fenótipo (o peptídeo de interesse) com o genótipo (o
vetor de clonagem) que o expressou.

10. Metodologia
Imunização
4 inoculações
Monitoramento com imunoensaios
RNAs codificantes de imunoglobulinas
Baço
Medula óssea

11. Metodologia
Inserção de genes no bacteriófago
Panning
Lavagens
Eluição
Amplificação dos fagos em cultivo bacteriano
- Fagos expondo moléculas específicas
para o antigeno
(ligação, eluição e amplificação)
O processo é monitorado por titulação dos fagos e imunoensaios
3 a 5 x

12. Metodologia
O processo é monitorado por
titulação dos fagos e
imunoensaios.
O material é então
isolado, sequenciado, analisad
o quanto a afinidade e
especificidade. Para então
serem obtidos na forma
solúvel, sem o fago, e
destinadas a suas aplicações.
Ligação, eluição e amplificação

13. Fagos
• Bacteriófagos, ou simplesmente fagos.
• A palavra “fagos” tem origem grega e mesmo traduzida
como “comer”, não possui o significado preciso, pois
bacteriófagos não comem bactérias.
• Bacteriófagos são vírus muito pequenos da família
Inoviridae que infectam bactérias. Podem ser vírus de
DNA ou de RNA que infectam somente organismos
procariotos. São formados apenas pelo
nucleocapsídeo, não existindo formas envelopadas.

14. Fagos filamentosos
Proteínas do capsídeo
Permitem a apresentação
de moléculas.
pVIII – Grande quantidade de moléculas pequenas, até 8 aas
pIII – Proteínas grandes como o fragmento Fc
Mas usados f1, fd e M13
Infectam enterobactérias, como E. coli.
Não causam infecção lítica.

15. Fagos

16. Transmissão do genoma
A infecção de E. coli pelo fago
filamentoso se inicia pela
interação de pIII com o pilus
sexual da célula e pela
despolimerização do
capsídeo, processo que é
desencadeado pelo complexo
bacteriano TolA. O genoma do
fago penetra no citoplasma e é
convertido em DNA de fita
dupla , que serve de molde
para a replicação e
a produção das proteínas virais

17. Infecção

18. Fagomídeos
• Fagomídeos são vetores de clonagem constituídos por
DNA, os quais apresentam propriedades tanto de
bacteriófago quanto de plasmídeo.
• Este vetores carregam, além da origem de replicação
plasmidial, uma origem de replicação derivada de
bacteriófago. Diferem de plasmídeos comuns por terem a
capacidade de serem empacotados em capsídeos de
fagos, em função de possuírem também uma sequência
gênica de sinalização para empacotamento.
• Fago HELP – empacota o fagomídeo

19. Bibliotecas de anticorpos
• É possível construir bibliotecas de fagos que
expressam o anticorpo integral ou somente as
porções Fab e scFv, que interferem minimamente
na estabilidade da partícula viral

20. Aplicações
• Mapeamento de epítopos de diversas proteínas
antigênicas, constituintes de vários agentes causadores de
doenças.
• Reagentes para diagnósticos
• Desenvolvimento de vacinas
• Novas drogas
• Ativadores e inibidores enzimaticos
• Estudos moleculares na interação patogeno-hospedeiro
• Testes de imunogenicidade
• Quimioterápicos ou oligonucleotídeos, anti-senso para
tumor.

21. Vantagem
• Poucos animais em teste
• Alta especificidade;
• Alta afinidade;
• Determinação de um só epítopo de um antigénio;
• Alta homogeneidade;
• Ausência de anticorpos não específicos;
• Maior facilidade de caracterização;
• Reduzida variabilidade de lote para lote

22. Desvantagem
• Normalmente são extremamente caros;
• Reconhecimento de um só epítopo de um
antigénio. Esse epítopo pode estar destruído (por
ex: pela fixação) mesmo que exista a molécula total
do antigénio;
• Se o soro não foi produzido contra um epítopo
específico do antigénio que se quer detectar e se
existirem outros antigénios com esse epítopo, a
imensa vantagem da alta especificidade será inútil