Espectrometría de Masa

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  • Click a second time – animation will show the pulse and the ions drifting at different rates. KE = ½ mv 2
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    1. 1. ESPECTROMETRÍA DE MASA IVON LOPEZ Algunas aplicaciones de la Espectrometría de Masa en biología y biomedicina
    2. 2. Espectrometría de Masa• La Espectrometría de Masa es una técnica que permite determinar la masa de moléculas por medio de la medida de la relación masa/carga (m/z).• La medida de masas moleculares involucra la producción, separación y detección de iones moleculares en fase gaseosa.• Cada molé cula puede originar iones moleculares con distinto número de cargas ( y distintas m/z).• La masa molecular es una propiedad física fundamental e inalterable de la materia……
    3. 3. Bioespectrometría• Aplicación de la Espectrometría de Masa al estudio de bio-moléculas: identificación, niveles, modificaciones.• Incluye la combinación de herramientas de la Bioquímica (cromatografía, electroforesis, bioafinidad y digestiones enzimáticas, entre otras) con la Espectrometría de Masa.
    4. 4. Espectrometría de masa y Biología Las medidas de masa de péptidos y proteínas (...y de otras macromoléculas) eran extremadamente difíciles de realizar hasta fines de los años 80’, cuando aparecieron dos nuevos métodos para producir iones en fase gaseosa:
    5. 5. Espectrometría de masa: Espectrómetro de masa MALDI-TOF Espectrómetro de masa MALDI TOF/TOF (Applied Biosystems Voyager DE-PRO) (Applied Biosystems 4800 Analizer)
    6. 6. 4000 Series MALDI TOF/TOF™ Analyzer Training Analizador de masaL os iones se separan de acuerdo a sus relaciones de m/z, de maneraque los iones más livianos reciben una mayor aceleración .Los iones más livianos llegan al detector antes que los iones de masasmayores. La medida del “tiempo de vuelo” de cada uno se puede usarpara calcular su masa. © 2007 Applera Corporation and MDS Inc.6
    7. 7. Espectro de masa de péptidos generados por digestión con tripsina “ingel” de una proteína de membrana Appl Environ Microbiol 2002 Dec;68(12):5877-81
    8. 8. Elemento Masa % 1 H 1.0078 99.985 2 H 2.0141 0.015 12 C 12.0000 98.90 13 C 13.0034 1.10 14 N 14.0031 99.634 15 N 15.0001 0.366 16 O 15.9949 99.762 17 O 16.9991 0.038 18 O 17.9992 0.200 31 P 30.9738 100.00 32 S 31.9721 95.02 33 S 32.9715 0.75 34 S 33.9679 4.21 36 S 35.9671 0.02 79 Br 78.9183 50.69 81 Br 80.9163 49.31
    9. 9. Resolución en MALDI-TOF Voyager Spec #1=>BC=>RSM10000=>MC=>MC=>MC[BP = 1672.8, 3222] 1672.917 1672.92 3222.3 100 90 80 70 60% Intensity 50 40 Modo lineal 30 Resolucion: 2467 20 (FWHM) 10 0 0 1655.0 1662.2 1669.4 1676.6 1683.8 1691.0 Mass (m/z) Voyager Spec #1=>BC=>NR(2.00)=>MC=>MC[BP = 1672.9, 16255] 1672.918 1.6E+4 100 90 80 70 60% Intensity 50 Modo reflector 40 Resolucion:8500 30 20 (FWHM) 10 0 0 1655.0 1662.2 1669.4 1676.6 1683.8 1691.0 Mass (m/z)
    10. 10. CARACTERIZACIÓN DE PROTEÍNAS POR ESPECTROMETRÍA DE MASA• Identificación de proteínas – comparación correlativa en una base de datos de secuencias• Control de calidad – proteínas recombinantes, reacciones de modificación• Modificaciones postraduccionales – fosforilación, glicosilación, metilación, etc.• Niveles de expresión – métodos cuantitativos
    11. 11. Identificación de proteínas 1000 m/z (m/z) 1500 Mass 2000 Extracción de péptidos y análisis de masasSeparación en gel 2D Selección de la muestra Tratamiento con una enzima proteolítica Búsqueda en banco de datos
    12. 12. Identificación de proteínas por MALDI-TOF• Proteína aislada• Proteína identificada por la masa de los péptidos (PMF), generados por un método específico: – Enzimático o químico• Para su identificación, la secuencia de la proteína debe estar en una base de datos• La identificación es probabilística: según criterios estadísticos
    13. 13. Identificación de Proteínas de Células Huésped en materia prima del Factor G-CSF Pureza/SDS-PAGE/ GCSF Pureza/HPLC/GCSF36 A292420 B14 B A
    14. 14. ESTRATEGIA GENERAL PARA EL ANÁLISIS DEPROTEÍNAS POR ESPECTROMETRÍA DE MASA Proteína Enzima Mezcla de péptidos Espectrómetro de masa Alternativamente, Masa de los péptidos secuenciación de cada péptido Búsqueda en bancos de datos; Verificación de secuencia y Identificación de la proteína detección de modificaciones postraduccionales .… MS/MS
    15. 15. • Modelo: Voyager DE-PRO (Applied Biosystems, USA).• Datos técnicos: • Posibilidades de operación: - Laser de nitrógeno (λ 337 nm) - Modo lineal - Voltaje de aceleración: hasta ± 25 kV - Modo reflector - Tubo de vuelo: 1.3 m (modo lineal); 2.0 m (modo reflector) - "Delay extraction" (DE) - Sistema alto vacío: 2 bombas turbo-moleculares (10 -8 - "Post Source Decay“ (PSD) Torr) - "Collision-Induced Dissociation“ (CID) - Rango de masa: 500 Da hasta > 400 kDa - Exactitud de masa : hasta 0.002% (20 ppm) - Sensibilidad (péptidos): subpicomolar

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