La optogenética es una ciencia que surje de la combinación de disciplinas distintas: la óptica, la ingeniería genética y la ingeniería de proteínas.
Las posibilidades que abre son infinitas y prometedoras.
2. OBJETIVOS DE APRENDIZAJE!
• Ser capaces de definir Optogenética
• Entender cómo se desarrolló esta técnica
• Identificar los 3 pilares de la Optogenética
• Aprender mediante un ejemplo el diseño de estos
experimentos
• Conocer las perspectivas futuras de esta técnica
3. La combinación de métodos ópticos y genéticos
para controlar in vivo fenómenos en una célula
específica.
¿Qué es la Optogenética?
Ópticos Genéticos
Dirigir la luz a
zonas de interés
Opsinas
microbianas
Expresión
heteróloga
INTRODUCCIÓN
7. CONTEXTUALIZACIÓN!
Francis Crick en 1979:
La fotoestimulación para manipular tipos celulares específicos
su idea se materializó
[1]
la Optogenética
8. CONTEXTUALIZACIÓN!
Francis Crick en 1979:
La fotoestimulación para manipular tipos celulares específicos
su idea se materializó
pero no aparece de la nada
[1]
la Optogenética
9. CONTEXTUALIZACIÓN!
Francis Crick en 1979:
La fotoestimulación para manipular tipos celulares específicos
su idea se materializó
pero no aparece de la nada
Ajeno a la neurociencia En Optogenética
opsinas conocidas desde la época de Crick hasta 2005 no se incorporaron a neuronas
se había expresado opsinas en células
mamíferas
hasta 2005 no se expresaron en neuronas
óptica bien desarrollada para ensayos in
vitro
interacción luz-célula in vivo supuso
limitación
[1]
la Optogenética
10. 2005-2009 la optogenética se desarrolló:
• Dificultades en su implementación
• Pocas publicaciones y avances
Optogenética: “the three-body problem”
CONTEXTUALIZACIÓN!
Modelos animales:
-‐ C.elegans
-‐ Drosophila
-‐ Pez cebra
-‐ Ratón
-‐ Rata
-‐ Primates
[2]
11. ¿Cómo actúan los 3 pilares juntos?
LAS BASES DE LA OPTOGÉNETICA
En Optogenética se necesita
12. ¿Cómo actúan los 3 pilares juntos?
LAS BASES DE LA OPTOGÉNETICA
En Optogenética se necesita
Una proteína
bacteriana
OPSINAS
[2]
13. ¿Cómo actúan los 3 pilares juntos?
LAS BASES DE LA OPTOGÉNETICA
En Optogenética se necesita
Una proteína
bacteriana
OPSINAS
[2]
[3]
14. ¿Cómo actúan los 3 pilares juntos?
LAS BASES DE LA OPTOGÉNETICA
En Optogenética se necesita
Una proteína
bacteriana
OPSINAS
Expresar la proteína en la
membrana de la célula
de interés
EXPRESIÓN HETERÓLOGA
[2]
[2]
15. ¿Cómo actúan los 3 pilares juntos?
LAS BASES DE LA OPTOGÉNETICA
En Optogenética se necesita
Una proteína
bacteriana
OPSINAS
Expresar la proteína en la
membrana de la célula
de interés
EXPRESIÓN HETERÓLOGA
Activar la
proteína con luz
LUZ DIRIGIDA CON
FIBRA ÓPTICA
[2]
[2]
[2]
17. • Familia de genes
• Codifican para las rodopsinas
Los elementos, uno por uno
1. OPSINAS
convierten
los fotones a
corriente
eléctrica
dirigen esa
corriente a
través de la
membrana
LAS BASES DE LA OPTOGENÉTICA!
cuando se
estimulan
con la luz
[4]
19. Los 3 tipos más comunes en la Optogenética son:
Los elementos, uno por uno
1. OPSINAS
LAS BASES DE LA OPTOGENÉTICA!
20. Los 3 tipos más comunes en la Optogenética son:
Los elementos, uno por uno
1. OPSINAS
Canalrodopsinas
Permite el paso de
cationes por su
poro
[2]
LAS BASES DE LA OPTOGENÉTICA!
21. Los 3 tipos más comunes en la Optogenética son:
Los elementos, uno por uno
1. OPSINAS
Halorodopsinas
Bombean Cl- al
medio extracelular
Canalrodopsinas
Permite el paso de
cationes por su
poro
[2][2]
LAS BASES DE LA OPTOGENÉTICA!
22. Los 3 tipos más comunes en la Optogenética son:
Los elementos, uno por uno
1. OPSINAS
Halorodopsinas
Bombean Cl- al
medio extracelular
Bacteriorodopsinas
Bombean H+ al
medio extracelular
Canalrodopsinas
Permite el paso de
cationes por su
poro
[2][2][2]
LAS BASES DE LA OPTOGENÉTICA!
23. Los elementos, uno por uno 1. OPSINAS
LAS BASES DE LA OPTOGENÉTICA
Excitatorias: depolarizan Inhibitorias: hiperpolarizan
[5]
24. Los elementos, uno por uno
2. EXPRESIÓN DE OPSINAS
LAS BASES DE LA OPTOGENÉTICA
25. Los elementos, uno por uno
2. EXPRESIÓN DE OPSINAS
Consideraciones:
Fotocorrientes generadas por las opsinas son bajas
Se necesitan altos niveles de expresión génica
Se debe optimizar:
neuronas muy sensibles y vulnerables
pueden dañarse por la sobreexpresión de proteínas de membrana
LAS BASES DE LA OPTOGENÉTICA
26. Los elementos, uno por uno
3. INTERFAZ CÉLULA-LUZ
• Se necesita alta intensidad de luz
• Se busca:
§ especificidad en el tipo cellular
§ minimizar la toxicidad celular
LAS BASES DE LA OPTOGENÉTICA
[2]
[6]
27. Principalmente en neurobiología
APLICACIONES!
• Describir circuitos neuronales implicados en síntomas de estados
patológicos: epilepsia, Parkinson…
• Investigar a gran escala cepas mutantes de C. elegans con
defectos en proteínas sinápticas.
• Identificar neuronas y proyecciones moduladoras de
comportamientos: escape, sociales. En D. melanogaster, Danio
rerio y Mus musculus.
• Estudiar el aprendizaje y la memoria en Mus musculus.
• Regular el ritmo cardíaco.
29. Estudio del aprendizaje y la memoria
Un recuerdo está codificado por una población
dispersa de neuronas
APLICACIONES!
30. Estudio del aprendizaje y la memoria
Un recuerdo está codificado por una población
dispersa de neuronas
Eliminación/
inactivación
Pérdida del
recuerdo
Activación
Reexpresión
APLICACIONES!
31. Estudio del aprendizaje y la memoria
Un recuerdo está codificado por una población
dispersa de neuronas
Eliminación/
inactivación
Pérdida del
recuerdo
Activación
Reexpresión
Objetivo
APLICACIONES!
32. Estudio del aprendizaje y la memoria
Marcaje de las neuronas
c-fos tTA
Sistema inducible Tet-off
Ratones transgénicos
c-fos-tTA
APLICACIONES!
[7]
33. Estudio del aprendizaje y la memoria
Marcaje de las neuronas
c-fos tTA
Sistema inducible Tet-off
Ratones transgénicos
c-fos-tTA
ITR ChannelRhodopsin-2-EYFPTRE Vector DNA:
AAV-TRE-ChR2-EYFP
+
ITR
APLICACIONES!
[7]
34. Estudio del aprendizaje y la memoria
Dos puntos de control para el
marcaje:
• Activación neuronal
• Ausencia de Doxiciclina
Si las neuronas se activan,
quedarán marcadas sólo en
ausencia de doxiciclina.
APLICACIONES!
[8]
35. Estudio del aprendizaje y la memoria
• Habituación: caja A, doxiciclina.
• Condicionamiento: caja B, choque eléctrico. Sin doxiciclina.
• Test: caja A, doxiciclina. Épocas con y sin luz.
Esquema básico
APLICACIONES!
[8]
36. Estudio del aprendizaje y la memoria
• Habituación: caja A, doxiciclina.
• Condicionamiento: caja B, choque eléctrico. Sin doxiciclina.
• Test: caja A, doxiciclina. Épocas con y sin luz.
Esquema básico
APLICACIONES!
[8]
[8]
37. Estudio del aprendizaje y la memoria
• Habituación: caja A, doxiciclina.
• Condicionamiento: caja B, choque eléctrico. Sin doxiciclina.
• Test: caja A, doxiciclina. Épocas con y sin luz.
Esquema básico
APLICACIONES!
[8]
38. Estudio del aprendizaje y la memoria
Miden la
inmovilización
• Habituación: caja A, doxiciclina.
• Condicionamiento: caja B, choque eléctrico. Sin doxiciclina.
• Test: caja A, doxiciclina. Épocas con y sin luz.
Esquema básico
APLICACIONES!
[8]
[9]
39. Estudio del aprendizaje y la memoria
Resultados
No Shock No ChR2
CONTROLES
APLICACIONES!
[8]
40. Estudio del aprendizaje y la memoria
Activar directamente una subpoblación de células implicada
en la formación de un recuerdo es suficiente para inducir
la expresión del comportamiento asociado al mismo.
Resultados
No Shock No ChR2
CONTROLES
Conclusión
APLICACIONES!
[8]
43. Posibles direcciones futuras
CONCLUSIONES!
1. En Neurociencia
• Elucidación de las bases de su funcionamiento
• Control intrínseco y preciso en sistemas intactos in vivo
2. Expansión del toolkit
• Aplicación a otros tejidos: muscular, cardíaco,
embrionario…
• Ajustar las necesidades técnicas: velocidad, precisión…
44. “La historia tras esta tecnología subraya el valor
de la protección de nichos ecológicos
excepcionales y la importancia del apoyo a la
ciencia puramente básica.
Nunca deberíamos olvidar que no sabemos
dónde nos lleva la larga marcha de la ciencia o
qué necesitaremos para iluminar nuestro camino.”
Karl Deisseroth
CONCLUSIONES!
45. BIBLIOGRAFÍA!
v Imágenes:
1. The Harvard Undergraduate Research Journal: The Development and Current Directions of
Optogenetics (http://thurj.org/feature/2013/05/4355/). Consultado el 20/10/2015.
2. Deisseroth, K. (2015). Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience. Nature
neuroscience, 18(9), 1213-1225.
3. Delroisse, J., Ullrich-Lüter, E., Ortega-Martinez, O., Dupont, S., Arnone, M. I., Mallefet, J., &
Flammang, P. (2014). High opsin diversity in a non-visual infaunal brittle star. BMC
genomics, 15(1), 1035.
4. Membrana: Plasma membrane 3D. Trendyworks LLC. https://lh3.googleusercontent. com /
xo5tKkxkXC1wc-qjVTpg03V9Rv2G0W4mtCSiTTbD5Qk5HrGEfNwBUQfflMj02TtY jp0=h900.
Láser: Pixabay. https://pixabay.com/p-160991/?no_redirect. Consultado el 20/10/2015.
5. Pastrana, E. (2011). Optogenetics: controlling cell function with light. Nature Methods, 8(1),
24-25.
6. Streye: Top 5 Innovaciones Tecnológicas Médicas. (http://streye.com/blog/top-5-innovacion-
tecnologica-medicas). Consultado el 20/10/2015
7. Imagui: http://www.imagui.com/a/raton-dibujo-iyEa7XeR6n. Consultado el 20/10/2015.
8. Liu, X., Ramirez, S., Pang, P. T., Puryear, C. B., Govindarajan, A., Deisseroth, K., & Tonegawa,
S. (2012). Optogenetic stimulation of a hippocampal engram activates fear memory recall.
Nature, 484(7394), 381-385.
9. Imagui: http://www.imagui.com/a/dibujar-raton-c85aGadLb. Consultado el 20/10/2015.
46. BIBLIOGRAFÍA!
v General:
§ Deisseroth, K. (2015). Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience.
Nature neuroscience, 18(9), 1213-1225.
§ Pastrana, E. (2011). Optogenetics: controlling cell function with light. Nature Methods,
8(1), 24-25.
§ Liu, X., Ramirez, S., Pang, P. T., Puryear, C. B., Govindarajan, A., Deisseroth, K., &
Tonegawa, S. (2012). Optogenetic stimulation of a hippocampal engram activates fear
memory recall. Nature, 484(7394), 381-385.
§ Deisseroth, K. (2011). Optogenetics. Nature methods, 8(1), 26-29.
§ Boyden, E. S. (2015). Optogenetics and the future of neuroscience. Nature
neuroscience, 18(9), 1200-1201.
§ Liu, X., Ramirez, S., & Tonegawa, S. (2014). Inception of a false memory by optogenetic
manipulation of a hippocampal memory engram. Philosophical Transactions of the Royal
Society B: Biological Sciences, 369(1633), 20130142.
§ Deisseroth, K. (2010). Controlling the brain with light. Scientific American, 303(5), 48-55.
§ Fenno, L., Yizhar, O., & Deisseroth, K. (2011). The development and application of
optogenetics. Annual review of neuroscience, 34, 389-412.
§ Guru, A., Post, R. J., Ho, Y. Y., & Warden, M. R. (2015). Making sense of optogenetics.
International Journal of Neuropsychopharmacology, pyv079.
§ Nussinovitch, U., & Gepstein, L. (2015). Optogenetics for in vivo cardiac pacing and
resynchronization therapies. Nature biotechnology.