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Psichiatria e sperimentazione
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Il modello animale dovrebbe
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Valore predittivo

Riproducibilità

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validazione dei metodi alternativi
Criteri di rilevanza

Criteri di riproducibilità

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Esistono metodi sostitutivi?
Sì

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Se valutiamo:
- Le metodologie non

Se valutiamo solo le

approvate dall’ECVAM
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Difetti di validazione dei Metodi Alternativi
 Tempi di attesa lunghi per

prevalidazione, validazione e
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 Organs-on-a-chip: sono chip microfluidici che simulano l'attività, la risposta
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Sperimentazione animale e metodi alternativi

  1. 1. Cos’è la sperimentazione animale? La Sperimentazione Animale (SA) è un termine ombrello che racchiude tutte quelle tecniche di ricerca che fanno uso di animali vivi.
  2. 2. La SA è predittiva? Nei test preclinici  Secondo la Food and Drug Administration (ente statunitense che si occupa dell’immissione dei farmaci) il 92% delle sostanze che passano i test su animali non passa quelli su umani.  Inoltre, il 51% dei farmaci commercializzati presenta gravi reazioni avverse che non si erano riscontrate in precedenza, il che farebbe aumentare il numero dei fallimenti dovuti alla sperimentazione animale al 96-98%. “The main causes of failure in the clinic include safety problems and lack of effectiveness: inability to predict these failures before human testing or early in clinical trials dramatically escalates costs.”
  3. 3. La SA è predittiva? Nella ricerca di base Circa il 75% della ricerca di base fa uso di animali (dati NIH). Uno studio del 2003, descrivendo una ricerca algoritmica al computer di tutti gli articoli di ricerca di base pubblicati in sei delle principali riviste scientifiche, ha fatto notare come su 25. 190 articoli ricercati:  solo il 2% (562) aveva all’interno parole come “terapia”, “clinico”, “terapeutico”, “prevenzione”, “vaccino” ed altre dello stesso tipo.  solo lo 0,4% (101) aveva qualche pretesa di potenziale applicazione agli umani  solo 5 hanno passato i trial clinici solamente 1 (lo 0,004%) ha condotto allo sviluppo di una classe di farmaci clinicamente utili nei 20 anni successivi alla pubblicazione del risultato scientifico di base
  4. 4. Differenze con gli animali: la genetica  • la presenza (o assenza) di certi geni. • la presenza (o assenza) di certi alleli. • il background genetico e i geni modificatori che agiscono sui geni influenzati dai farmaci o dalla malattia. • la regolazione e l’espressione dei geni. • le reti di geni. • lo splicing alternativo, che permette a un gene di formare o di contribuire a formare molte proteine diverse. • le proteine e le interazioni tra proteine. • le interazioni tra geni e proteine. • l’evoluzione di vecchi geni che li porta a svolgere nuove funzioni. • il trasferimento genico orizzontale (TGO). Il TGO avviene quando i geni di un organismo vengono incorporati in un altro organismo senza che l’organismo ricevente discenda da quello donatore. Per esempio, la resistenza agli antibiotici può avvenire mediante TGO. • le caratteristiche epigenetiche. L’epigenetica è il settore relativamente nuovo che studia i cambiamenti dell’espressione genica che possono essere ereditati e che avvengono senza modifiche della sequenza di DNA coinvolta. Per esempio, a causa di influenze ambientali, un gene regolatore può essere modificato in modo tale da attivarsi o disattivarsi permettendo a una malattia di manifestarsi. • la presenza di mutazioni geniche e cromosomiche come i polimorfismi del singolo nucleotide, le varianti del numero di copie, le duplicazioni, le inversioni, le cancellazioni e le inserzioni.
  5. 5. Differenze con gli animali: i sistemi complessi Gli animali (uomo  I sistemi complessi sono costituiti da molti componenti che possono essere raggruppati in moduli che interagiscono tra loro, hanno proprietà emergenti che derivano dalle interazioni tra le parti, sono resistenti ai cambiamenti, esibiscono ridondanza nei loro componenti, sono autoorganizzati, danno risposte non lineari, hanno livelli gerarchici di organizzazione, interagiscono con l’ambiente, hanno cicli di retroazione e sono dinamici. compreso) sono tipici esempi di sistemi complessi a molti livelli, dotati di proprietà emergenti, modulari e non lineari. Una perturbazione nel sistema S1 che provoca un effetto A, non necessariamente porterà allo stesso effetto A nel sistema complesso S2, a prescindere da quanto “simili” possano essere i sistemi S1 ed S2.
  6. 6. Caratteri conservativi e sistemi complessi Mentre nello studio dei processi biochimici di base non c’è bisogno di “scomodare” l’organismo intero nella sua complessità in quanto l’esame del processo conservato avviene allo stesso livello di organizzazione o nello stesso modulo ed è soggetto di studio del riduzionismo, l’uso del modello animale quale modello causale analogo (CAM) ovvero come modello predittivo per l’uomo nello studio di patologie umane complesse, reazione a farmaci e vaccini, dispositivi, xenobiotici, ecc. implica spesso che il tratto o la risposta in fase di studio sia situato a livelli più alti di organizzazione, si trovi in un modulo diverso, o sia influenzato da altri moduli e dunque la mera presenza di processi conservati tra le specie diviene insufficiente per l’estrapolazione dei dati all’uomo.
  7. 7. I modelli animali geneticamente modificati sono predittivi?  No. La modificazione genetica dei modelli animali tramite l’aggiunta di geni esogeni (animali transgenici) o tramite l’inattivazione o la delezione di geni (animali knockout) è spesso effettuata per renderli dei modelli più vicini all’essere umano. Tuttavia, oltre ad essere molto tecnicamente difficile da raggiungere, tale modifica può non consentire conclusioni chiare a causa di un gran numero di fattori, tra cui quelli che riflettono la complessità intrinseca degli organismi viventi, quali la variabile ridondanza di alcune vie metaboliche tra specie.  I modelli basati sull’uso di knockout genico sono spesso deludenti. Nel 30% dei knockout, non vengono osservati effetti fenotipici, forse a causa delle osservazioni insufficienti degli animali o perché il meccanismo di ridondanza maschera gli effetti del knockout. In altri casi, l’interferenza del gene, che è stato eliminato con altri geni, è troppo complessa e non può essere analizzata facilmente, non portando ad alcuna chiara conclusione. Spesso, infatti, nei modelli animali geneticamente modificati, l’organismo esprime reazioni che annullano, compensano o modificano la risposta
  8. 8. I modelli animali geneticamente modificati sono predittivi? Lynch: Stingl, Völkel e Lindl, dopo 20 anni di studio dell’ipertensione su  “L’annotazione delle funzioni geniche animali GM basata esclusivamente su fenotipi mutanti in modelli animali, così come  “Perciò, anche se questi le assunzioni di funzioni conservate tra le approcci sono ritenuti senza specie, possono essere fuorvianti.” eccezione “molto […] l’ipotesi che le funzioni geniche e i promettenti” in letteratura, sistemi genetici siano conservati tra i non ci si può aspettare che la modelli e gli esseri umani è data per ricerca sugli Organismi scontata, spesso a dispetto di prove che le funzioni e le reti geniche Geneticamente Modificati divergono nel corso dell’evoluzione. rechi alcun contributo ad una […] i modelli animali di funzioni nuova strategia terapeutica geniche e di malattie umane non nel prossimo futuro.” possono fornire informazioni adeguate, in particolare per la rapida evoluzione di geni e sistemi.”
  9. 9. I modelli animali geneticamente modificati sono predittivi? 1) I geni, le proteine, le interazioni proteinaproteina, l’epressione e la regolazione dei geni variano con la specie in questione. 2) Gli animali geneticamente modificati hanno ancora organi e sistemi che influenzano l’intero organismo a parte il gene modificato in questione. 3) Gli animali sono sistemi complessi, pertanto lievi modificazioni del sistema, salvo in caso di ridondanza (che è nota per essere un importante fattore di confusione negli studi genetici knockout), possono avere conseguenze indesiderate e impreviste per il sistema nel suo complesso (gli effetti pleiotropici sono rilevanti in questo ambito).
  10. 10. I modelli animali geneticamente modificati sono predittivi?  4) Gli effetti poligenici sono difficili da studiare usando le correnti tecnologie. Come osservato da Hau: “Molte funzioni fisiologiche sono poligeniche e controllate da più di un gene, e questo richiede attività di ricerca considerabili per identificare il contributo di geni multipli nei meccanismi biologici normali come in quelli anormali. L’inserimento di DNA nel genoma di animali o la delezione di specifici geni dà luogo a risultati spesso imprevedibili in termini di risultati scientifici, nonché in termini di benessere animale nelle prime generazioni di animali prodotti.”  5) Le variazioni intraspecifiche nella genetica degli animali modificati possono essere un fattore di confusione che maschera gli effetti della manipolazione genetica: “I topi in ogni background inbred sono geneticamente identici, tuttavia quando non sono in un background puro, le differenze fenotipiche possono essere correlate a differenze nel background dei ceppi piuttosto che alla stessa manipolazione genetica. L’uso di topi fratelli nel background misto aiuta ma, a seconda del fenotipo, potrebbe non essere sufficiente”. (Shapiro 2007)
  11. 11. Modelli animali e reazioni avverse ai farmaci Ogni anno, per colpa degli effetti avversi ai farmaci, 1,5 milioni di persone vengono danneggiate al punto da richiedere un’ospedalizzazione solo negli USA e 197 000 muoiono solo nell’UE. Uno studio del 2012 ha dimostrato che i test su animali hanno omesso nell’81% dei casi di segnalare 93 gravi reazioni avverse legate a 43 farmaci presi in esame che hanno seriamente danneggiato i pazienti a cui furono somministrati. Tutto ciò nonostante agli animali vengano somministrate dosi elevate e per lunghi periodi, proprio allo scopo di far emergere anche i potenziali effetti collaterali rari.
  12. 12. Psichiatria e sperimentazione animale “Gli attuali test basati su animali hanno fallito nell’identificare farmaci efficaci con nuovi meccanismi molecolari, e hanno dato una scarsa comprensione della patofisiologia dei comuni disturbi psichiatrici […] Anatomicamente, gran parte dei circuiti neurali coinvolti nei sintomi psichiatrici – ad esempio, quelli della corteccia cerebrale prefrontale – sono nuovi o notevolmente espansi negli esseri umani, e i pattern di espressione genica nella corteccia cerebrale umana sembrano anch’essi essere recentemente evoluti, anche rispetto ai primati non umani. […] i disturbi psichiatrici sono molto più eterogenei e poligenici, mettendo in dubbio l’utilità dei modelli murini genetici esistenti.” (Hyman 2012)
  13. 13. Il modello animale dovrebbe essere sottoposto a validazione? “L’affermazione che i test su animali siano intrinsecamente validi, solo perchè sono test su animali, è discussa e respinta. Si è concluso che non c’è alcuna ragione giustificabile per sottoporre i test su animali a procedure nuove o considerevolmente modificate che siano meno rigorose di quelle applicate ai test senza animali e alle strategie di sperimentazione” (Balls 2004)
  14. 14. I modelli animali sono predittivi? Valore predittivo Riproducibilità Secondo quanto ci  Hartung riporta i dati di comunicano Hackam e Redelmeier, la concordanza positiva dell’animale non supera il 33%, mentre secondo Greek, che riporta a sua volta i risultati di Heywood, il valore predittivo positivo sarebbe pari al 31%. Gottmann e colleghi, i quali, valutando il potenziale carcinogenico di 121 sostanze, hanno comparato i risultati provenienti dalla letteratura scientifica generale con quelli del National Cancer Institute/National Toxicology Program e hanno rilevato solo il 57% di concordanza a parità di specie (topi e ratti). La trasposizione di questi risultati all’uomo sarà dunque ancora più bassa.
  15. 15. Predittività richiesta nella validazione dei metodi alternativi Criteri di rilevanza Criteri di riproducibilità “Screening tests: predictive “Screening tests: c. 70 value >0.50 (e.g., better than random classification) Adjunct tests: predictive value >/=0.75 Replacement tests: predictive value >/=0.90.” Il modello animale sarebbe considerato “random”. Adjunct tests: c. 70 Replacement tests: c. 80% (or better than the reproducibility of the particular animal test concerned).” La riproducibilità del modello animale è al di sotto di quella richiesta ai test di screening.
  16. 16. Esistono metodi sostitutivi? Sì No Se valutiamo: - Le metodologie non Se valutiamo solo le approvate dall’ECVAM - L’uso di più metodi alternativi in maniera integrata (Integrated Testing Strategies) La ricerca di base non richiede validazione  vi sono metodi alternativi nella ricerca di base metodologie approvate dall’ECVAM.
  17. 17. Difetti di validazione dei Metodi Alternativi  Tempi di attesa lunghi per prevalidazione, validazione e inserimento nelle linee guida dei metodi alternativi  Comparazione del metodo alternativo con modello animale e non con meta-analisi retrospettive derivanti da dati conosciuti sull’uomo (validazione retrospettiva).  Mancanza di priorità ai potenziali sostitutivi rispetto ai metodi che mirano a ridurre la sperimentazione animale  Mancanza di priorità ai metodi il cui campo d'azione si estende a più ambiti sperimentali  Mancanza di priorità ai metodi che utilizzano cellule umane e non animali. Il caso del Cytosensor Microphysiometer  Il Cytosensor Microphysiometer, che doveva rimpiazzare il Draize Test, diede un risultato inizialmente inconcludente, dato che si confrontò il suo risultato con quello del Draize test stesso, finchè non fu validato grazie a meta-analisi retrospettive.  Ciò dimostra inequivocabilmente che comparare i dati di un metodo alternativo con quelli di un modello mai validato, come l’animale, può darci risultati fuorvianti sulle potenzialità della metodologia che si sta valutando.
  18. 18. Principali metodi alternativi  Organs-on-a-chip: sono chip microfluidici che simulano l'attività, la risposta meccanica e fisiologica di interi organi e sistemi.  Bioreattori Multi-Compartimentali Modulari (McmB): sono sistemi di colture cellulari in 3D a più camere interconnesse che permettono di riprodurre la complessità dell'organismo in vivo e le interazioni organo-organo.  Co-colture integrate discrete multiorgano (IdMOC): sono dei nuovi sistemi in vitro in grado di valutare gli effetti biologici delle sostanze con interazioni tra più tipi di cellule, tra cui interazioni endocrine, paracrine e metaboliche. Permettono di studiare la tossicità e la farmacologia dipendenti dal metabolismo.  Medicina personalizzata: è la prescrizione personalizzata di farmaci sulla base di informazioni raccolte con la farmacogenomica. La farmacogenomica è la branca della farmacologia che si occupa dell’influenza della variabilità genetica sulla risposta al farmaco da parte dei pazienti, correlando l’espressione genica o la variazione dei singoli nucleotidi con l’efficacia, la tossicità e le interazioni tra i farmaci.  Metodologie in vitro e in silico avanzate: le attuali tecnologie in vitro in 2D non riescono a riprodurre efficacemente l’organismo umano, spesso inoltre si utilizzano tessuti animali al posto di corrispettivi umani, si tarano i metodi in silico su topi piuttosto che su esseri umani e si utilizzano queste metodologie in maniera isolata e disorganizzata. Pertanto richiediamo l’implementazione e lo sviluppo di tecnologie avanzate in silico e in vitro 3D su tessuti umani, utilizzate in maniera integrata tra loro in modo da poter superare le limitazioni dei singoli metodi. ma anche microarray, neuroimaging, microdosing, organi bioartificiali, virtual organs, tossicogenomica, proteomica, metabolomica, cellule staminali, modelli matematici e molto altro.
  19. 19. http://opposizionesperimentazioneanimale.wordpress .com

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