1. 空気中に存在する生物派生物の捕捉に
よる特定生物の存在確認
2020/11/20 つくば遺伝子研究所 1
つくば遺伝子研究所

2. 空気濾過装置
空気中に漂う生物派生物をフィルターに捕集
フィルターに付着した生物派生物から
DNAを抽出
特定生物が環境中に生息しいてるかをPCRで解析

3. チャック付きビニール袋
シリカゲルを入れて、チャックを閉める
マスクを
チャック付き
袋の中へ
冷蔵庫に保管
2020/11/20 つくば遺伝子研究所 3

4. DNA抽出 PCR
アガロース電気泳動
Positive control
sample
2020/11/20 つくば遺伝子研究所 4

5. 1匹
3匹
10匹
30匹
7日 7日 7日 7日
試料採取: 各飼育最終日(7日目)の午前中に1時間吸引により、空気浮遊物を採取、採取後フィルターは
チャック付きビニール袋に入れ、さらに、シリカゲルも入れてDNA調製まで室温保存する。
実験1
1 3 10 30
飼育室の体積: 6.3m3
飼育室の温度: 18～22℃
飼育室の湿度: 40～70％
マウス
2020/11/20 つくば遺伝子研究所 5

6. M 0 1 3 10 30
M: 分子量マーカー
0: マウス0匹
1: マウス1匹
3: マウス3匹
10: マウス10匹
30: マウス30匹
: マウスの存在を示すシグナル
マウス一匹でも、マウスのシグナルが検出されている。１０匹の実験区では、検出出来なかったが、
その理由は、DNAの抽出に問題があるかもしれません。
そこで、再度抽出しも且つPCRサイクル数を増やして、検討して見ました。
PCR: 40cycles
マウス
2020/11/20 つくば遺伝子研究所 6

7. 結果: 1, 3, 10, 30匹で明確なバンド
として検出された。しかし、バンド
の濃淡がないことから、PCR回数を
多いため、プラトウに達したと思わ
れる。
今後、バンドに濃淡が出る程度に
PCRの回数を調整する必要がある。
マウス
2020/11/20 つくば遺伝子研究所 7

8. 30匹
0匹
7日 7日 7日 7日
飼育室の体積: 6.3m3
飼育室の温度: 18～22℃
飼育室の湿度: 40～70％
試料採取: 飼育最終日(7日目)の午前中に1時間吸引により、空気浮遊物を採取、採取後フィルターは
チャック付きビニール袋に入れ、さらに、シリカゲルも入れてDNA調製まで室温保存する。
その後、マウス0匹を維持しながら、7日ごとに、計3回、同様にフィルターで浮遊物を集め、同様に保
存する。
実験2
0 week 1 week 2 weeks 3 weeks
マウス
2020/11/20 つくば遺伝子研究所 8

9. 0 1 2 3 C M
0: 0 week
1: 1 week
2: 2 weeks
3: 3 weeks
C: control (no mouse)
M: Molecular marker
PCR fragment from mouse
結論: マウスがいる間はマウスのシグナルが検出される。マウスがいなくなっても、その後、少なくとも一
週間は、マウスシグナルが検出される。その理由は、マウス由来物が浮遊しているためと考えられる。し
かし、マウスがいなくなって、2週間以上たつと、マウスのシグナルは検出されなくなる。
PCR: 40cycles
マウス
2020/11/20 つくば遺伝子研究所 9

10. PCR反応
Primer: [F-1] sus Tag L5/ 10spe-R2 (ブタ)
95C 9min, 95C 30sec 68C 30sec (40 cycles)
95C 9min, 95C 30sec 68C 30sec (50 cycles)
2.5％アガロースゲル
40 cycles
M Dw1 1 2 3
500bp
Dw1: 水
Dw2: 水
1: 8.60ng, ブタゲノム
2: 2.85ng, ブタゲノム
3: 0.95ng, ブタゲノム
50 cycles
M Dw1 Dw2 2 3
Component
Reaction mix (ml)
2x QIAGEN Multiplex PCR Master Mix 10.0
primer F [2pmol/ml] 4pmol/20ml 2.0
primer R [2pmol/ml] 4pmol/20ml 2.0
DW (ml)
DW4(0515) 1.0
Temp (ml)
DNA solution 5.0
total 20.0
ブタ／イノシシ
2020/11/20 つくば遺伝子研究所 10

11. PCR反応
Primer: [F-7] rat Tag L3/ 10spe-R2 (ブタ)
95C 9min, 95C 30sec 68C 30sec (40 cycles)
95C 9min, 95C 30sec 68C 30sec (50 cycles)
2.5％アガロースゲル
40 cycles
M Dw 1 2 3
500bp
Dw: 水
1: 9.15ng, ラットゲノム
2: 3.05ng, ラットゲノム
3: 1.00ng, ラットゲノム
50 cycles
M Dw 2 3
Component
Reaction mix (ml)
2x QIAGEN Multiplex PCR Master Mix 10.0
primer F [2pmol/ml] 4pmol/20ml 2.0
primer R [2pmol/ml] 4pmol/20ml 2.0
DW (ml)
DW4(0515) 1.0
Temp (ml)
DNA solution 5.0
total 20.0
ラット
2020/11/20 つくば遺伝子研究所 11

12. ブタ／イノシシ: HEPAを用いて、野外での実証試験
420m
養豚場
60分間空気濾過 濾過量は530リットル
2020/11/20 つくば遺伝子研究所 12

13. PCR反応
Primer: [F-1] sus Tag L5/ 10spe-R2 (ブタ)
Primer: [F-7] rat Tag L3/ 10spe-R2 (ラット)
95C 9min, 95C 30sec 68C 30sec (45 cycles)
2.5％アガロースゲル
Dw: 水
1: 養豚場付近、抽出１
2: 養豚場付近、抽出２
4: 1.0ng, ラットゲノム
Component
Reaction mix (ml)
2x QIAGEN Multiplex PCR Master Mix 10.0
primer F [2pmol/ml] 4pmol/20ml 2.0
primer R [2pmol/ml] 4pmol/20ml 2.0
DW (ml)
DW 1.0
Temp (ml)
DNA solution 5.0
total 20.0
ブタのみならず、ラットも検出された
500bp
ブタプライマー
2020/11/20 つくば遺伝子研究所 13

14. 土浦市イノシシマップ
東城寺
黄色基点から東を望む
(風の来る方向)
濾過フィルターは371(HEPA)
2020/11/20 つくば遺伝子研究所 14

15. ラットプライマー
イノシシプライマー
結論: イノシシのDNAは検出された。また、量的には
少ないが、ラットのDNAも検出された。
イノシシもラットもこの領域にいると考えられる
2020/11/20 つくば遺伝子研究所 15

16. 検出量の数値化(サンプル当たりのゲノム数)
ブタ／イノシシ

17. 食堂
ラット等
食堂で、HEPAで６０分間空気を５３０リットル
濾過
2020/11/20 つくば遺伝子研究所 17

18. PCR反応
Primer: [F-7] rat Tag L3/ 10spe-R2 (ラット)
95C 9min, 95C 30sec 68C 30sec (55 cycles)
2.5％アガロースゲル
500bp
Dw: 水
1: 食堂、反応１
2: 食堂、反応２
3: 東城寺、反応1
4: 東城寺、反応2
5: 1.00ng, ラットゲノム
Component
Reaction mix (ml)
2x QIAGEN Multiplex PCR Master Mix 10.0
primer F [2pmol/ml] 4pmol/20ml 2.0
primer R [2pmol/ml] 4pmol/20ml 2.0
DW (ml)
DW 1.0
Temp (ml)
DNA solution 5.0
total 20.0
55 cycles
M Dw 1 2 3 4 5
結果
・食堂、東城寺とも2連の反応で行った。
(各サンプルとも抽出は1本、反応は2本で行った。）
どちらも、2本中1本（#2, #4)にシグナルを検出した。
→食堂、東城寺ともラットは存在するが、極めて少ない。
食堂: 1分子／20ml 2分子／40ml 12分子／530リットル空気
東城寺: ２分子／20ml 4分子／40ml 24分子／530リットル空気
ラットDNAの検出 ２回目のトライアル

19. ラットの検量線
プライマー 4pmole プライマー 8pmole

20. シロアリの検出
2020/11/20 つくば遺伝子研究所 20

21. シロアリの種類と被害
• イエシロアリは水を運ぶ能力があり、松材を好み、屋根裏まで
被害が及んでいる場合があります
• ヤマトシロアリは、雨漏りがある場合は屋根裏部分まで被害が
及ぶことがあります。柱の背割れに蟻道を形成して、2階部が
被害を受けることがあります。
• アメリカカンザイシロアリは、湿気とは関係なく、直接、2階
部分に侵入し被害を及ぼすことがあります。
• ダイコクシロアリは、乾燥にきわめて強く、水がなくても生活
ができるので、乾燥状態の木材でも生息が可能です。

22. シロアリの分布
ダイコクシロアリ
https://www.hakutaikyo.or.jp/faq/1813.html
https://www.e-c-c.co.jp/gaichu/shiroari/daikokushiroari.html

23. 中古住宅売買に関するシロアリ問題
https://smtrc.jp/useful/knowledge/sellbuy-law/2019_06.html
空気濾過装置による、非破壊検査システムをシロアリの生息の確認に利用出来るのでは・・・

24. ヤマトシロアリ Reticulitermes speratus kyushuensis
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/1219676367
イエシロアリ Coptotermes formosanus
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_015800.1
アメリカカンザイシロアリ Incisitermes minor
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_037511.1
ダイコクシロアリ Cryptotermes domesticus
配列情報なし
2020/11/20 つくば遺伝子研究所 24
シロアリのミトコンドリアDNA配列情報

25. シロアリの検出
日本に生息するシロアリ４種(イエシロアリ、ヤマトシロアリ、アメリカカンザイシロアリ、ダイコクシロアリ)
をそれぞれ特異的に検出することが可能となった。

26. 家屋内の空気を集めてシロアリの痕跡を調べる
家屋換気図: http://dannetsujyutaku.com/serial/architect/1_index/2_2
空気濾過装置

27. 現場
現場1: イエシロアリの駆除
はほぼ完了している場所
現場2:イエシロアリの駆除は進
行中の場所

28. DNA抽出
１．フィルターをDNA抽出液に入れる。
２．プロテネースK、56Cで1時間処理する。
３．フェノール・クロロフォルム液を加え、上層を取得する。
４．クロロフォルムで洗浄後、イソプロパノール沈殿をする。
５．沈殿をDWに溶解する。
PCR反応
Primer: Cfor-F/Cfor-R (イエシロアリ)
95C 9min (1cycle), 95C 20sec 66C 20sec 72C 30sec (45cycles), 72C 5min (1cycle)
2.5％アガロースゲル
Dw: 水
Ma60: 吉村先生の飼育室で60分吸引したマスクで
回収したDNA
Ge1: 現場1で60分吸引したマスクで回収したDNA
Ge2: 現場2で60分吸引したマスクで回収したDNA

29. 4 pmole primer
縦バーは標準偏差
イエシロアリ

30. アメリカカンザイシロアリ
4 pmole primer

31. ダイコクシロアリ
4 pmole primer

32. A邸
経過年 シロアリゲノム数
0 10
1 15
2 10
3 100
4 300
5 15
シロアリ駆除

33. チャタテムシの検出
https://www.city.nagoya.jp/kenkofukushi/page/0000005189.html
https://kurapita.com/chrysomelid-extermination/

34. DNAデータベース未登録の生物種検出の試み
標的生物種について、DNAデータベースを用いて、プライマーを設計し、PCRを行うが、PCR産物が検出され
なかった場合、通常の方法では、この段階で断念せざるを得ない。(その生物種のゲノム配列情報がない。)
生物には、一般に、DNAとしては、核ゲノムとミトコンドリアゲノムがある。生物を検出す
るには、細胞当たり、コピー数を多い配列(ミトコンドリア、反復配列)を用いることにより、
高感度に検出することが出来る。また、生物種に特異的でなくてはならない。
新規考案方法
①標的生物から、DNAを高純度に精製する
②NGSでランダムにシークエンス解析する。目標40億塩基
③アッセンブルを行う。
出力例 > 245361 594 1580 ATCTGGTCGCGCTCGGCATCGCTATGGCGCGCATCGAAATGGATCAC......
Id番号 長さ Kmerのマップ数
KMERS is the number of KMERS that mapped to the sequence during assembly
④コピー数の多い配列を選択するため、Kmerのマップ数/長さ の大きいものを選
択し、且つ、アセンブルされた配列の長さが５００塩基以上のものを抽出する。
そして、そこからプイラマーを作成する。

35. 新規方法を用いてプライマーを設計し、それを検証
結論:新規方法により、目的のチャタテム
シを検出するシステムが完成した。
本新規方法により、配列が登録されてい
ない生物であっても、検出システムを構
築することが出来る事が判った。

36. 環境中に検出されたチャタテムシ(ゲノム)量の推定

37. A工場
チャタテムシ駆除
経過年 チャタテムシゲノム数
0 10
1 15
2 10
3 100
4 300
5 15

38. トコジラミの検出
2020/11/20 つくば遺伝子研究所 38

39. トコジラミについて
• トコジラミ（床虱、学名：Cimex lectularius、英語: Bed bug）
とは、吸血性の寄生昆虫である。「シラミ」と命名されている
が、シラミ目ではなく、カメムシ目トコジラミ科の昆虫で捕食
性のカメムシであるマキバサシガメ科などに近縁である。トコ
ジラミ科の昆虫は全て吸血性であるが、そのほとんどは主に鳥
類やコウモリ類を宿主とする[1]。一方で本種および近縁種のタ
イワントコジラミ（台湾床虱。学名：Cimex hemipterus。別
名、ネッタイトコジラミ、ネッタイナンキンムシ、熱帯南京
虫）のみが、ヒトを主な吸血源とする。
2020/11/20 つくば遺伝子研究所 39

40. Cimex lectularius/Cimex hemipterus
Cimex lectularius
登録されている配列は２種類
Cimex hemipterus
登録されている配列は５２種類
これらの配列を基に、それぞれの種を区別し、同種内では、全ての亜
種を検出するプライマーセットを作成
中国/米国 米国
2020/11/20 つくば遺伝子研究所 40

41. インドネシア
トコジラミ
サンプル
2020/11/20 つくば遺伝子研究所 41

42. PCR条件
Primer:
Cime-HF22/Cime-HR22（熱帯トコジラミ）
Cime-LF25/Cime-LR25（日本トコジラミ）
Template
Dw
10倍希釈To (x10), Yo (x10), Ne (x10), Am (x10), Ma (x10), Ku (x100)
95C 9min (1cycle), 95C 20sec 66C 20sec 72C 30sec (35cycles), 72C 5min (1cycle)
2.5％アガロースゲル
M Dw To Yo Ne Am Ma Ku M
500bp
M:マーカー
Dw: 水
To: 東京の一般住宅で採取したトコジラミのDNA
Yo: 実験室トコジラミのDNA
Ne: 熱帯トコジラミのDNA
Am: アメリカで採取したトコジラミのDNA
Ma: マルカメムシのDNA
Ku: クサギカメムシのDNA
M Dw To Yo Ne Am Ma Ku M
Cime-HF22/Cime-HR22 Cime-LF25/Cime-LR25
124bp 156bp

43. 考察
• PCRサイクル数を50にして行ったが、35サイクルと結果は変わらなかっ
た。このことから言えることは、確実に、①トコジラミ用プライマーと熱
帯トコジラミ用プイラマーは、それぞれを区別することが出来る。②トコ
ジラミプイラマー群は、マルカメムシ、クサギカメムシのDNAとは反応
しない。
• トコジラミプライマーセットは、中国/米国でのトコジラミの配列を基に、
作成しているので、米国で採取したトコジラミを検出できないとは考えら
れない。その結果、サンプルの損壊等により、DNAが回収出来なかった
と判断した。

44. サンプル内の
トコジラミ(日
本)ゲノム数を
数値化

45. サンプル内の
熱帯トコジラ
ミのゲノム数
を数値化

46. Aホテル
経過月 トコジラミの検出ゲノム数
0 10
1 15
2 10
3 100
4 300
5 0
駆除