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Cultura e crescimento microbiano aula4 30_11_2015

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Cultura e Crescimento Microbiano
Microbiologia Ambiental

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Cultura e crescimento microbiano aula4 30_11_2015

  1. 1. MICROBIOLOGIA AMBIENTAL ENGENHARIA AMBIENTAL Prof.ª Mestranda Graziele Ruas 2 Sem 2015 CULTURA E CRESCIMENTO MICROBIANO NUTRIÇÃO
  2. 2. Crescimento Microbiano • Objetivos da Aula: • Identificar as fases da curva de crescimento dos microrganismos e o que caracteriza o início e o fim de cada fase; • Conhecer os tipos de associações e os fatores internos e externos que influenciam na velocidade de crescimento dos microrganismos; • Conhecer os métodos de quantificação dos microrganismos. Biologia Ambiental 2014 2
  3. 3. Crescimento Microbiano • O CRESCIMENTO CELULAR é definido como aumento coordenado de todos os constituintes celulares. Consequência => Multiplicação Celular; • O CRESCIMENTO MICROBIANO é normalmente associado ao crescimento de uma população de células de um dado microrganismo, ou seja, com aumento do número de células da população Biologia Ambiental 2014 3
  4. 4. Crescimento Microbiano • Tempo de Geração é o intervalo de tempo necessário para que uma célula se duplique; – O tempo de geração é variável para os diferentes organismos, podendo ser de 10 a 20 minutos ou até dias, os microrganismos de interesse ambiental ou tecnológico têm tempo de geração que varia de 1 a 3 horas; – Depende dos fatores genéticos, ambientais e nutricionais. Biologia Ambiental 2014 4
  5. 5. Crescimento Microbiano • O Crescimento Microbiano pode ocorrer em meio líquido com células em suspensão ou associados a superfícies (biofilmes, flocos, e outros). Biologia Ambiental 2014 5
  6. 6. Crescimento Microbiano • O crescimento individual termina com a divisão da célula, gerando duas células – filhas, independentes e autônomas. Biologia Ambiental 2014 6
  7. 7. Crescimento Microbiano • Etapas do Crescimento Populacional –INÍCIO; –FASE LAG (latência); –FASE EXPONENCIAL (log); –FASE ESTACIONÁRIA; –FASE DE DECLÍNIO. Biologia Ambiental 2014 7
  8. 8. Crescimento Microbiano • Sistema fechado de cultivo => curva de crescimento. (Ex: reatores em batelada). Biologia Ambiental 2014 8
  9. 9. Crescimento Microbiano • Sistema fechado de cultivo => curva de crescimento. Biologia Ambiental 2014 9
  10. 10. Crescimento Microbiano • Sistema fechado de cultivo => curva de crescimento. Biologia Ambiental 2014 10
  11. 11. Crescimento Microbiano –Fase LAG ou Adaptativa (I) • Fase em que não há multiplicação celular; • Ocorre a síntese de enzimas; • As células apresentam-se em tamanho aumentado; • Há síntese e consumo de grânulos de reserva. Biologia Ambiental 2014 11
  12. 12. Crescimento Microbiano –Fase LAG ou Adaptativa (I) • É um período de adaptação ao novo meio, ocorre a síntese de enzimas; • ↑Tamanho das células; • ↑ da atividade Metabólica; • Transcrição do DNA (sem replicação); • Síntese de DNA. Biologia Ambiental 2014 12
  13. 13. Crescimento Microbiano –Fase LOG ou Exponencial (II) • Crescimento logarítmico (Exponencial); • Fim da síntese de enzimas; • Célula voltam ao tamanho normal; • Absorvendo os nutrientes do meio; • Sintetizando constituintes celulares; • As células são sensíveis às mudanças ambientais e compostos antimicrobianos; • Há predominância de células jovens. Biologia Ambiental 2014 13
  14. 14. Crescimento Microbiano –Fase LOG ou Exponencial (III) • Equação do Crescimento • N = N0.2n • Onde N é o nº de microrganismos ao fim de n divisões e N0 é o nº inicial de microrganismos; • A velocidade exponencial de crescimento é expressa pelo número de divisões no tempo: • R=n/t-t0; • Tempo de Geração: • G = 1/R. Biologia Ambiental 2014 14
  15. 15. Crescimento Microbiano –Fase LOG ou Exponencial (III) Biologia Ambiental 2014 15
  16. 16. Fase Log ou Exponencial (III) Biologia Ambiental 2014 16
  17. 17. Crescimento Microbiano –Fase Estacionária (III) • O número de bactérias que surge é o mesmo que morre; • Acúmulo de metabólicos tóxicos (Ácidos Orgânicos); • Exaustão de Nutrientes; • Alteração nas condições físicas do meio; • As células apresentam tamanho • Menor que nas fases anteriores; Biologia Ambiental 2014 17
  18. 18. Crescimento Microbiano –Fase Estacionária (III) • Nessa fase há um favorecimento à adesão e agregação entre as células; • A membrana plasmática torna-se menos permeável; • A célula tem maior resistência ao choque térmico, pressão osmótica e estresse oxidativo; • Há redução da síntese proteica; • Há síntese de proteínas específicas. Biologia Ambiental 2014 18
  19. 19. Crescimento Microbiano –Fase de Declínio (IV) • As células perdem a capacidade de se dividir; • Número de células mortas > células novas; • Ocorre o processo de esporulação (Esporos Bacterianos); • Há impossibilidade de produção de energia e elevado produção de enzimas autolíticas. Biologia Ambiental 2014 19
  20. 20. Biologia Ambiental 2014 20
  21. 21. Crescimento Descontínuo e Crescimento Contínuo • Crescimento Descontínuo: são as quatro fases citadas (Lag, Log, Estacionária e Declínio); • Crescimento Contínuo: compreende as duas fases lag e exponencial, estabilizando e mantendo a fase exponencial com o suprimento contínuo de nutrientes e remoção contínua e na mesma proporção de células do meio. Biologia Ambiental 2014 21
  22. 22. Medidas de Crescimento Microbiano • Vários métodos na contagem do número total de células ou mensuração da massa celular – adaptáveis para diferentes organismos ou situações; • Avaliação Direta – contagem de células, filtração e técnica do número mais provável; • Avaliação Indireta – Turbidez, Atividade Metabólica e Peso seco. Biologia Ambiental 2014 22
  23. 23. Medidas do Crescimento Microbiano • Métodos que determinam o número de células; – Diretos; – Indiretos. • Métodos que determinam a massa das células. Biologia Ambiental 2014 23
  24. 24. Métodos que Determinam o Número de Células • Método Diretos; •Métodos Indiretos. Biologia Ambiental 2014 24
  25. 25. Métodos que Determinam o Número de Células – Método Direto • Métodos Diretos 1. Enumeração ao microscópio (com uso de lâminas especiais); (Câmara de Petroff-Hausser e de Neubauer); 2. Enumeração por câmara eletrônica (através de condutividade elétrica). Biologia Ambiental 2014 25
  26. 26. Biologia Ambiental 2014 26
  27. 27. Biologia Ambiental 2014 27
  28. 28. Métodos que Determinam o Número de Células – Método direto • Métodos diretos 1. Método de contagem de células viáveis ou unidades formadoras de colônias (UFC). Biologia Ambiental 2014 28
  29. 29. Métodos que Determinam o Número de Células – Método direto Biologia Ambiental 2014 29 Diluição Decimal para Plaqueamento
  30. 30. Biologia Ambiental 2014 30
  31. 31. Biologia Ambiental 2014 31
  32. 32. Biologia Ambiental 2014 32 Útil para analisar grandes volumes de água
  33. 33. Biologia Ambiental 2014 33
  34. 34. Biologia Ambiental 2014 34
  35. 35. Métodos que Determinam o Número de Células – Método direto MÉTODO DO NÚMERO MAIS PROVÁVEL • É uma técnica estatística: quanto maior o número de bactérias em uma amostra, maior será o número de diluições necessárias para reduzir a densidade até um ponto em que nenhuma bactéria esteja presente nos tubos de diluição seriada; • Esse método também é utilizada para identificar microrganismos (como bactérias que fermentam lactose produzindo ácido = coliformes); • Oferece uma estimativa de 95% de probabilidade de a população bacteriana estar em uma faixa determinada. Biologia Ambiental 2014 35
  36. 36. Métodos que Determinam o Número de Células – Método Indireto Biologia Ambiental 2014 36
  37. 37. Biologia Ambiental 2014 37
  38. 38. Métodos que Determinam a Massa das Células MÉTODOS INDIRETOS 1. Massa seca: a massa celular é separada por centrifugação, ou filtração, seca e pesada; 2. Dosagem de proteína celular: as células são centrifugadas e o conteúdo proteico dosado; 3. Dosagem de ATP (Identifica células viáveis) – reação de luminscência. MÉTODOS INDIRETOS 3. Turbidimetria; Biologia Ambiental 2014 38
  39. 39. Biologia Ambiental 2014 39
  40. 40. Fatores que controlam o Desenvolvimento Microbiano Limitações de Crescimento pelos Fatores Ambientais Lei dos Mínimos de Leibig • O crescimento da população é limitado pelo elemento cuja concentração é inferior a um valor mínimo – o crescimento da biomassa é determinado pelo nutriente em menor concentração; Lei de Tolerancia de Shleford • Faixa de tolerância de sobrevivência e crescimento com seus limites superior e inferior – o organismos só cresce em determinada faixa de fatores ambientais; Biologia Ambiental 2014 40
  41. 41. Fatores que controlam o Desenvolvimento Microbiano • FATORES AMBIENTAIS • Os fatores ambientais influenciam a absorção de nutrientes e portanto no próprio metabolismo celular; • Os principais fatores são: pH, pressão osmótica, Temperatura, Oxigênio e Luz. Biologia Ambiental 2014 41
  42. 42. Fatores que controlam o Desenvolvimento Microbiano - pH • A maioria dos microrganismos crescem melhor em pH próximo a neutralidade (6,5 a 7,5); • Os microrganismos apresentam valores de pH, mínimo, ótimo e máximo para multiplicação; Biologia Ambiental 2014 42
  43. 43. Fatores que controlam o Desenvolvimento Microbiano - pH Bactérias: pH entre 5 e 9; Classificação das bactérias em relação ao pH: • Neutrófilas: espécies que crescem em faixas de pH entre 5,4 a 8,5 (EX: Maioria das bactérias patogênicas); • Acidófilas: espécies que crescem em faixas de pH extremamente baixas, entre 0,1 a 5,4. Ex: Bactérias do estomago – Helicobacter pylory. • Alcalinófilas: crescem em faixas de pH entre 8,5 e 11,5. Biologia Ambiental 2014 43
  44. 44. Fatores que controlam o Desenvolvimento Microbiano - pH • Tolerância ao pH • Maior tolerância a valores baixos de pH: Bolores > Leveduras > Bactérias; • Microrganismos patogênicos apresentam uma faixa de pH mais estreita; Biologia Ambiental 2014 44
  45. 45. Biologia Ambiental 2014 45
  46. 46. Fatores que controlam o Desenvolvimento Microbiano - pH Efeito dos Ácidos nos Microrganismos • Maior gasto de energia para manter o pH intracelular; • Desnaturação de proteínas (DNA); • Alteração das atividades das enzimas, vitais para as células; • Menor velocidade de crescimento. Biologia Ambiental 2014 46
  47. 47. Fatores que controlam o Desenvolvimento Microbiano - pH pH do Alimentos • Alimentos pH > 4,5 => mais sujeitos ao crescimento bacteriano; • pH entre 4,0 e 4,5 => predominância do crescimento de bolores e leveduras, poucas bactérias; • pH < 4,0 => crescimento de bolores e leveduras. Biologia Ambiental 2014 47
  48. 48. Fatores que controlam o Desenvolvimento Microbiano – Pressão Osmótica • As bactérias tem mecanismos que as permitem manter a pressão osmótica elevada. • Sempre que houver uma diferença de concentração de soluto entre os meios externos e internos (intracelular), as moléculas de água tenderão a igualar as concentrações, fluindo do lado menos concentrado para o mais concentrado. Biologia Ambiental 2014 48
  49. 49. Fatores que controlam o Desenvolvimento Microbiano – Pressão Osmótica • As bactérias geralmente vivem meios hipotônicos, mas possuem recursos que permitem a manutenção de alta osmolaridade interna; • Por outro lado a parede celular rígida permite que o citoplasma possa apresentar alta concentração de solutos sem lise celular. Biologia Ambiental 2014 49
  50. 50. Fatores que controlam o Desenvolvimento Microbiano – Pressão Osmótica Biologia Ambiental 2014 50
  51. 51. Fatores que controlam o Desenvolvimento Microbiano – Temperatura • Quando a temperatura aumenta, os processos químicos e enzimáticos ficam mais rápidos; • ↑ Temperatura => ↑Taxa de crescimento; • Pode ocorrer desnaturação proteica. Biologia Ambiental 2014 51
  52. 52. Fatores que controlam o Desenvolvimento Microbiano – Temperatura • Classes Térmicas do Microrganismos Biologia Ambiental 2014 52
  53. 53. Fatores que controlam o Desenvolvimento Microbiano – Temperatura Psicrotrófico: • Pseudomonas, Alcalígenes, Flavobacterium, Micrococcus; Mesófilos: • A maioria das espécies ; Maior parte dos patógenos; Termófilos: • Algumas espécies de Bacillus e Clostridium. Bolores: • Faixa ampla de temperatura; Crescem em temperatura de refrigeração; Leveduras: • Crescem na temperatura de psicrotróficos e mesófilos. Biologia Ambiental 2014 53
  54. 54. Fatores que controlam o Desenvolvimento Microbiano – Luz • A luz é um fator essencial para bactérias fotossintetizantes; • Pode inibir o crescimento de alguns microrganismos. Biologia Ambiental 2014 54
  55. 55. Fatores que controlam o Desenvolvimento Microbiano – Oxigênio • O oxigênio exerce um papel decisivo no crescimento bacteriano, já que os microrganismos reagem diferentes a sua presença. As bactérias podem ser divididas em: • Aeróbias estritas: Necessitam de O2; • Microaerófilas: Necessitam de O2 em baixa concentração; • Facultativas: Desenvolvem-se tanto na presença, quanto na ausência de O2; • Anaeróbias Tolerantes: não utilizam O2; • Anaeróbias Estritas: Oxigênio é letal. Biologia Ambiental 2014 55
  56. 56. Fatores que controlam o Desenvolvimento Microbiano – Oxigênio Biologia Ambiental 2014 56
  57. 57. Efeito da Concentração de Nutrientes (ou Substrato) Biologia Ambiental 2014 57
  58. 58. Efeito da Concentração de Nutrientes (ou Substrato) Biologia Ambiental 2014 58
  59. 59. Efeito da Concentração de Nutrientes (ou Substrato) • Baixas concentrações de nutrientes determinam baixa velocidade de tomada de nutrientes. • Quando as concentrações dos nutrientes estão baixas a velocidade de assimilação é que determina a velocidade específica de crescimento; • Já quando as concentrações dos nutrientes são altas, a constante de velocidade específica independe de tais concentrações. Segundo Barbosa et al. (1999) “a velocidade máxima provavelmente é resultante da saturação dos transportadores de membrana pelos nutrientes”. Biologia Ambiental 2014 59
  60. 60. Efeito da Concentração de Nutrientes (ou Substrato) Macronutrientes • Necessários em grandes quantidades; • Tem papel na estrutura celular e metabolismo; Micronutrientes: • Necessários em Pequenas quantidades; • Funções enzimáticas e estruturais das biomoléculas. Biologia Ambiental 2014 60
  61. 61. Componentes Celulares Fonte de Carbono • Compostos Orgânicos (heterotróficos) – carboidratos, lipídeos, proteínas; • Dióxido de Carbono (autotróficos) – a fonte de energia é a luz ou compostos inorgânicos. Biologia Ambiental 2014 61
  62. 62. Componentes Celulares - Macronutrientes Fonte de Nitrogênio • É o elemento necessário em maior quantidade depois do carbono, ~12%. – constitui proteínas, ácidos nucléicos, etc). • O N está presente em moléculas orgânicas (Aminoácidos, peptídeos) e em moléculas inorgânicas (NH3, NO3 -, N2) Biologia Ambiental 2014 62
  63. 63. Componentes Celulares - Macronutrientes Hidrogênio • Presente em compostos orgânicos e inorgânicos (água, sais e gases); • Funções: • Manutenção do pH; • Formação de ligações de H entre moléculas; • Fonte de energia nas reações de oxirredução na respiração. Biologia Ambiental 2014 63
  64. 64. Componentes Celulares Outros Macronutrientes: • P –Síntese de ácidos nucléicos, ATP; • ƒS –Estabilidade de aminoácidos, componente de vitaminas; • ƒK–Atividade de enzimas; • ƒMg–Estabilidade dos ribossomos; • ƒCa–Estabilidade da parede celular e termoestabilidade de endósporos; • ƒNa–Requerido em maior quantidade por microrganismos marinhos. Bactérias halofílicas extremas não crescem com menos de 15% de sal; • ƒFe–Papel chave na respiração, componente dos citocromos e das proteínas envolvidas no transporte de elétrons. Biologia Ambiental 2014 64
  65. 65. Componentes Celulares Micronutrientes • São necessárias quantidade muito pequenas na composição do meio de cultura : Zn, Cu, Mn, Co, Mo e B. • Função estrutural em várias enzimas; • Nem sempre sua adição é necessária; • Meio de Sintéticos com alto grau de pureza podem não ter esses elementos. Biologia Ambiental 2014 65
  66. 66. Meios de Cultura • Meios de cultura são soluções de nutrientes que promovam o crescimento dos microrganismos; • Existem diferentes meios de cultura para os diferentes microrganismos e finalidades; • Para se ter sucesso no cultivo de microrganismos é necessários: conhecer suas necessidades nutricionais => fornecer os nutrientes na proporção adequada. Biologia Ambiental 2014 66
  67. 67. Meio de Cultura • Pode ser: • Quimicamente Definidos (vendidos com os componentes pré misturados) – pode-se usar o Agar como agente solidificante (polissacarídeo complexo de algas marinhas;) ou • Complexos – tem maior variabilidade de acordo com o lote. • Meios gerais (vários organismos crescem); ou • Específicos (identificação de espécies). Biologia Ambiental 2014 67
  68. 68. Biologia Ambiental 2014 68
  69. 69. Biologia Ambiental 2014 69
  70. 70. Biologia Ambiental 2014 70
  71. 71. Meio de Cultura Observação: • Os micro-organismos introduzidos em um meio de cultura para iniciar o crescimento são chamados de inóculo. Os microorganismos que crescem e se multiplicam dentro ou sobre um meio de cultura são denominados cultura. Biologia Ambiental 2014 71
  72. 72. Meios de Cultura – Como de ser? • Nutrientes na proporção adequada; • Água; • pH adequado; • O Meio deve ser estéril – inicialmente não deve conter microrganismos vivos, assim a cultura será somente do organismos inoculado; • Incubada em temperatura apropriada. Biologia Ambiental 2014 72
  73. 73. Meios de Cultura Seletivos e Diferenciais • No saneamento é interessante detectar a presença de microrganismos específicos associados a doenças e para esse fim são usados meios seletivos e diferenciais; • Os meios seletivos impedem o crescimento de bactérias indesejadas e favorecem as de interesse. • Exemplo: o ágar sulfeto bismuto isola a bactéria da tifoide, gram negativa (Salmonella typhi), pois inibe as bactérias gram positivas e a maiorias das bactérias gram negativas intestinais. Biologia Ambiental 2014 73
  74. 74. Meios de Cultura Seletivos e Diferenciais • Os meios diferenciais facilitam a identificação de colônias em relação as outras colônias; • Alguns meios de cultura tem reações identificáveis com meios diferenciais em tubos ou placas. (Identificação de colônias de Streptococis pyogenes – lisam as hemácias, meio Agar sangue (contêm hemácias)). Biologia Ambiental 2014 74
  75. 75. Meios de Cultura Seletivos e Diferenciais • Meio Diferencial Biologia Ambiental 2014 75
  76. 76. Meios de Cultura Seletivos e Diferenciais Biologia Ambiental 2014 76
  77. 77. Bibliografia • MADIGAN, M.T., MARTINKO, J.M., PARKER, J. Microbiologia de Brock.São Paulo: Prentice Hall, 2004. • PELCZAR, M.J., CHAN, E.C.S., KRIEG, N.R. Microbiologia. São Paulo: Makron Books, 1996. volumes 1 e 2. • TORTORA, G.J., FUNKE, B.R., CASE, C.L. Microbiologia. Porto Alegre: Artmed, 2000. Biologia Ambiental 2014 77
  78. 78. Perguntas 1. Quais são as etapas do crescimento microbiano? Explique cada uma delas. 2. O que são macro e micronutrientes? Porque é importante conhecer as necessidades nutricionais dos microrganismos? 3. Para que serve os meios de cultura? Biologia Ambiental 2014 78

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