1.
Microbiología del
compostaje de
“alperujo“
Dr. Germán Tortosa Muñoz
Departamento de Microbiología del Suelo y Sistemas
Simbióticos
Estación Experimental del Zaidín (EEZ-CSIC)
http://www.compostandociencia.com
Email: compostandociencia@gmail.com

2.
¿Qué es el
compostaje?
- Proceso biológico de
transformación de los residuos
orgánicos en compost
- Degradación aeróbica de la MO
-Actividad metabólica de una gran
diversidad de microorganismos
presentes en los propios residuos:
bacterias y hongos.
-Liberación de energía: Incremento
temperatura y fases del
compostaje: mesófila, termófila,
enfriamiento y maduración

3.
Foto: https://www.interempresas.net/Grandes-cultivos/Articulos/240818-Panorama-erosion-olivar-Jaen-procesos-
metodologias-significacion-economica-ambiental.html

4.
La importancia de la materia orgánica
Mejora las propiedades físicas, químicas, y
biológicas
Dos tipos: La biológicamente no activa (humus)
y la biológicamente activa (microorganismos)

5.
Foto: https://www.pnas.org/content/114/52/13587

6.
Experimento Nº1: Cantidad de nitrógeno
equivalente (orgánico vs. inorgánico)
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Peso seco parte aérea (78 días)
C
DN
DN+C
Tratamiento
PSPA
(g)
0
5
10
15
20
25
Peso seco parte aérea (104 días)
C
DN
DN+C
Tratamiento
PSPA
(g)

7.
Experimento Nº2: Dosis compost creciente con
igual nitrógeno inorgánico
Control C1 C2 C3
0
4
8
12
16
20
Desarrollo vegetal
1º corte (98 días)
PSPA (g)
PSR (g)
Tratamientos
Peso
(g)
Control C1 C2 C3
0
4
8
12
16
20
Desarrollo vegetal
2º corte (127 días)
PSPA (g)
PSR (g)
Peso
(g)
Control C1 C2 C3
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Producción de frutos
2º corte (127 días)
Peso
fresco
(g)

8.
0
50
100
150
200
250
300
Contenido en ascorbato (Vitamina C) en frutos
Control
C1
C2
C3
Tratamiento
mg/
100
g
peso
fresco

9.
Microbiología del compostaje
Sigue siendo uno de los grandes retos científicos
1) Técnicas dependientes de cultivo.
2) Técnicas independientes de cultivo
- Material genético microbiano (DNA y RNA) y genes marcadores:
16S rRNA (bacterias), y 18S rRNA o ITS (hongos)
- Técnicas -ómicas: Metagenómica, metatranscriptómica, proteómica,
metabolómica, etc
- PCR cuantitativa (qPCR)
- Secuenciación masiva (NGS): Illumina MiSeq

10.
DNA vs RNA
- Idea central de la biología molecular:
DNA se transcribe a RNA mensajero y éste se traduce una proteína
- Estudios de compostaje basados en DNA:
Composición microbiana y su abundancia relativa durante el proceso
- Estudios de compostaje basados en RNA:
Información sobre las poblaciones “metabólicamente activas“

11.
Materiales y métodos experimentales
Proceso de compostaje
Compostaje de AL como modelo de estudio (Tortosa y col., 2012):
- Pilas de 10.000 kg, AL y estiércol de oveja (1:1, v/v)
- Estudio de dos pilas como réplicas biológicas
- Pilas estáticas y volteos mecánicos (7 volteos, más frecuentes durante la fase bioxidativa)
- Humedad entorno a 40-60%

12.
Esquema experimental
PowerSoil®
DNA Isolation
kit
- Secuenciación NGS
bacterias (Tortosa et al.,
2017)
2 pilas (réplicas biológicas)
Fases mesófila, termófila
y de maduración
DNA

13.
Esquema experimental
PowerSoil®
DNA Isolation
kit
- Secuenciación NGS
bacterias (Tortosa et al.,
2017)
- Secuenciación NGS
hongos y qPCR (Tortosa
et al., 2020).
2 pilas (réplicas biológicas)
Fases mesófila, termófila
y de maduración
DNA

14.
DNA vs RNA
- Idea central de la biología molecular:
DNA se transcribe a RNA mensajero y éste se traduce una proteína
- Estudios de compostaje basados en DNA:
Composición microbiana y su abundancia relativa durante el proceso
- Estudios de compostaje basados en RNA:
Información sobre las poblaciones “metabólicamente activas“

15.
- Compostaje de “alperujo“ (AL) como sistema modelo:
Estudio del proceso (Tortosa et al., 2012)
Descenso degradación MO (Hemi., Toc, Fat y WSCH)
Incremento de la humificación (Lig., HR, HD, PAH)
Evolución bacterias mediante NGS (Tortosa et al., 2017)
Evolución de hongos mediante NGS y qPCR (Tortosa et al., 2020)
- No hay estudios de las comunidades “metabólicamente activas“ en el
compostaje de AL
- Muy poco estudios de diversidad analizando RNA durante el compostaje:
Wang et al., (2019); Ding et al., (2020); Meng et al., (2020)
Objetivos del trabajo:
- Estudio de la diversidad, abundancia y actividad de las bacterias
metabólicamente activas durante el compostaje de AL
- Evaluar su implicación en los procesos de transformación de la materia
orgánica (humificación y maduración)

16.
Esquema experimental
PowerSoil®
DNA Isolation
kit
RNA
PowerSoil®
Total RNA
isolation kit
- Secuenciación NGS
bacterias (Tortosa et al.,
2017)
- Secuenciación NGS
hongos y qPCR (Tortosa
et al., 2020).
- qPCR (Tortosa et al.
2021)
- Secuenciación
NGS bacterias
y qPCR
(Tortosa et al.,
2021)
PrimeScript
TM RT
reagent
Kit
2 pilas (réplicas biológicas)
Fases mesófila, termófila
y de maduración
cDNA
RNA
DNA

17.
3) Análisis:
qPCR (DNA y cDNA):
- Amplificación de la región V3
del gen 16S rRNA
- 341F y 534R
- iTaq Universal SYBR Green Supermix
- Patrón: plásmido de Pseudomonas putida
NCB 957
- Número copias 16S rRNA CDW-1
Secuenciación masiva (NGS). Illumina MiSeq (cDNA):
- Amplificación y secuenciación de la región V3-V4
del gen 16S rRNA
- Análisis Bioinformático:
- FastQC, FASTX-Toolkit, fastq-join
- Q20, >20 pb, 15 % overlapping
- SEED2 software (<300 pb), <Q30
- Quimeras y OTUs (SILVA y MOTHUR)
- Ribosomal Database project (RDP-II)

18.
4) Análisis estadístico
- Curvas de rarefacción
- Diversidad alfa: Observed and Chao1 richness; Shannon and InvSimpson
- Diversidad beta: Non-metric MultiDimensional Scaling Analysis (NMDS) based
on Bray-Curtis dissimilarities
- Statistical Analysis of Taxonomical and Functional Profiles (STAMP) open-
source software v2.1.3 release
- One-way ANOVA, Tukey-Kramer post-hoc test (p < 0.05), Storey’s FDR, y eta-
squared corrections
- Correlación de Pearson entre géneros y prop. Físico-químicas
- Functional Annotation of Prokaryotic Taxa
(FAPROTAX) bioinformatic tool (v.1.2.2 release)
Stilianos Louca Lab (Universidad de Oregón)
https://pages.uoregon.edu/slouca/LoucaLab/lib/
php/index.php

19.
Resultados
qPCR (abundancia): DNA (a) y cDNA (b)
- DNA: Incremento durante el proceso; termófila>maduración>mesófila
- cDNA: Termófila como fase más activa del proceso

20.
Resultados
Índices de diversidad
Alfa (α) Beta (β)
- Incremento de la diversidad alfa durante el compostaje
- Similitud en diversidad beta con el avance del proceso

21.
Diversidad bacteriana durante el proceso
- Phyla predominantes: Proteobacteria, Firmicutes, Bacteroidetes y Actinobacteria
(>84 % secuencias identificadas)

22.
Diversidad bacteriana durante el proceso
- Descenso durante el proceso: Stenotrophomonas, Halotea, Pseudomonas,
Acinetobacter, ...

23.
Diversidad bacteriana durante el proceso
- Incremento sólo en la fase termófila: Carnobacterium, Olivibacter, Flavobacterium,
Rhodococcus, ...

24.
Diversidad bacteriana durante el proceso
- Incremento sólo en la maduración: Luteinomonas, Parapedobacter, Truepera,
Planomicrobium, ...

25.
Correlación con la transformación físico-química de
la materia orgánica
- Descenso degradación MO (Hemi., Toc, Fat y WSCH) e incremento de la humificación (Lig., HR, HD, PAH)
- Stenotrophomonas, Halotalea, Pseudomonas y Cohnella (degradación de la MO)
- Luteinomonas, Truepera y Planomicrobium (humificaión)

26.
5- Asignación funcional de los taxones (FAPROTAX)

27.
5- Asignación funcional de los taxones (FAPROTAX)
- Funciones metabólicas características del compostaje relacionadas con la
degradación de la materia orgánica y reducción de patógenos

28.
Conclusiones:
- Transcriptómica (RNA) es una aproximación válida para el estudio de
las comunidades bacterianas potencialmente activas
- qPCR confirma que la fase más activa es la termófila
- Comportamiento diferenciado de la comunidad bacteriana durante el
proceso: descenso durante el proceso, incremento solo en la fase termófila
y sólo en la maduración
- Hay una especialización bacteriana implicada en los diferentes procesos
metabólicos de la degradación de la materia orgánica
- Luteinomonas, Parapedobacter y Planomicrobium son potenciales
biomarcadores para el proceso de maduración y tienen un papel relevante
en la humificación

29.
Hacía donde vamos (o queremos ir):
En Investigación
- Aislamiento y caracterización de PGPR del compost de AL (en marcha)
- Efecto de compost en la fijación simbiótica de nitrógeno (por hacer)
- Tratamiento biológico del “carozo” y aislamiento de bacterias PGPR (en
marcha)
- Patente de un abono orgánico y biológico a partir del compost de AL (por
hacer)
- Compostaje a pequeña escala (en marcha):
Diseño de un reactor (patente)
Curso y libro sobre “La ciencia del compostaje en casa”

30.
http://www.compostandociencia.com
Email: german.tortosa@eez.csic.es
compostandociencia@gmail.com
@germantortosa
¡Muchas gracias por vuestra atención!