54    DETEKSI KEBERADAAN ANTIGEN Ascaridia galli DENGAN IMUNOGLOBULIN YOLK MELALUI METODE IMUNOHISTOKIMIA                 ...
55                               PENDAHULUAN       Metode deteksi antigen-antibodi telah banyak dikembangkan seiringdengan...
56        Kemajuan teknologi yang telah dicapai untuk produksi imunoglobulin yolk(IgY) yang mudah dan efisien membuka pelu...
57agar parafin menjadi lebih keras sehingga memudahkan pemotongan. Cacing A.galli dipotong secara transfersal dan longitud...
58                            HASIL PENELITIAN       Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa antibodi poliklonal IgY yangte...
59                               PEMBAHASAN       Teknik polymer peroxidase merupakan teknik yang banyak digunakan.Teknik ...
60       Penambahan AEC tidak akan menghasilkan kromogranin tanpa adanyaH2O2 dan peroksidase. Antibodi primer akan bereaks...
Upcoming SlideShare
Loading in …5
×

DETEKSI KEBERADAAN ANTIGEN Ascaridia galli DENGAN IMUNOGLOBULIN YOLK MELALUI METODE IMUNOHISTOKIMIA

917 views

Published on

Published in: Education
0 Comments
0 Likes
Statistics
Notes
  • Be the first to comment

  • Be the first to like this

No Downloads
Views
Total views
917
On SlideShare
0
From Embeds
0
Number of Embeds
3
Actions
Shares
0
Downloads
8
Comments
0
Likes
0
Embeds 0
No embeds

No notes for slide

DETEKSI KEBERADAAN ANTIGEN Ascaridia galli DENGAN IMUNOGLOBULIN YOLK MELALUI METODE IMUNOHISTOKIMIA

  1. 1. 54 DETEKSI KEBERADAAN ANTIGEN Ascaridia galli DENGAN IMUNOGLOBULIN YOLK MELALUI METODE IMUNOHISTOKIMIA ABSTRAK Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui keberadaan antigenekskretori/sekretori Ascaridia galli dengan metode imunohistokimia. Cacing A.galli dewasa dipotong secara melintang dan memanjang pada bagian kepala danekor. Jaringan tubuh A. galli yang dipotong diblok di dalam parafin dan preparathistologi dibuat melalui proses tahapan dehidrasi, clearing, infiltrasi danembeding dengan parafin, pemotongan dan pewarnaan. Keberadaan antigen padajaringan cacing A. galli dideteksi dengan uji imunohistokimia. Slide dihangatkandi dalam buffer sitrat pada temperatur 90-95oC. Aktivitas endogen dihambatdengan H2O2 3% dan skim milk 0,1%. Slide diinkubasikan dengan antibodiprimer imunoglobulin yolk (IgY) selama satu malam pada temperatur 4oC, danantibodi sekunder anti-chicken IgY HRP-conjugat selama satu jam padatemperatur ruangan. Slide diwarnai dengan kromogen AEC, conterstain denganLillie Mayer Haematoxylin, dan ditutup di dalam genangan gliserin. Hasilpenelitian menunjukkan bahwa antigen dapat dideteksi keberadaannya padabagian kutikula dan saluran cerna A. galli. Hasil tersebut merefleksikan bahwaIgY yang terbentuk oleh rangsangan produk ekskretori/sekretori stadium L3 A.galli dapat mengenal antigen A. galli sehingga IgY tersebut dapat digunakandalam imunodiagnostik.Kata kunci: Ascaridia galli, antigen ekskretori/sekretori, imunohistokimia ABSTRACT The purpose of the present study was to determine the presence of antigenin the Ascaridia galli. A. galli adult worms were cut in transversal andlongitudinal by mean of cranial and caudal. The tissue of A. galli were blocked inparaffin and the histologic preparates were done by means of dehydration,clearing, infiltration and embedding in paraffin, section and staining. The antigenwere detected with immunohistochemistry. Slides were warmed in citrate buffer at90-95oC. Endogenous activities were blocked with 3% H2O2 and 0.1% skim milk.Slides were incubated with both primary antibody yolk immunoglobulin (IgY) forovernight at 4oC and secondary antibody rabbit anti-chicken IgY HRP-conjugatefor one hour at room temperature. Slides were stained with AEC chromogen,counterstained with Lillie Mayer Haematoxylin, and mounted in glyserin aqueousmount. The result showed that antigen were able detected in cuticle and intestinesof A. galli. This research concluded that IgY stimulated by the excretory/secretory antigen of L3 stage was able to recognized A. galli antigen so the IgYcould be applied for immunodiagnostic.Key words: Ascaridia galli, excretory/secretory antigen, immunohistochemistry
  2. 2. 55 PENDAHULUAN Metode deteksi antigen-antibodi telah banyak dikembangkan seiringdengan penemuan teknologi mutakhir dalam bidang biologi molekuler bersamaandengan penemuan terbaru metode produksi antibodi spesifik terhadap antigen didalam serum dan kuning telur (yolk). Kemajuan tersebut memberi kesempatanuntuk membuat cara imunodiagnostik yang aman dan akurat (Motoi et al. 2005). Lehr et al. (1999) menyatakan bahwa kombinasi dari konsep-konsepimunologis dan histologis merupakan suatu jalan yang terbukti sangat bergunadalam biologi molekuler dan biomedis, terutama dalam analisis imunoserologispada organ-organ dalam keadaan normal maupun patologik. Untuk tujuan tersebuttelah digambarkan pendekatan kuantitatif sejak abad terakhir ini, misalnya olehEhrlich dan Landsteiner sebagai pelopor-pelopor dalam pengembangan teknik ini. Prinsip dari teknik imunohistokimia adalah adanya ikatan antigen-antibodiyang digunakan untuk mendeteksi suatu molekul dalam jaringan. Pada penelitianini, metode imunohistokimia ditujukan untuk mendeteksi antigen cacing A. gallidengan menggunakan IgY yang dipicu oleh antigen ekskretori/sekretori stadiumL3 A. galli sebagai antibodi primer sehingga terbentuk kompleks antigen-antibodi.Motoi et al. (2005) membuktikan bahwa IgY yang dipicu oleh antigen virus rabiesdapat digunakan pada uji imunohistokimia yang sangat rektif mengenal antigenrabies pada sitoplasma sel-sel neuron (sel syaraf) dari ganglion trigeminaljaringan otak tikus. Imunohistokimia diartikan sebagai suatu metode untuk mendeteksi suatumolekul yang ada di jaringan dengan menggunakan antibodi poliklonal ataumonoklonal terhadap molekul yang akan dideteksi (merupakan reaksi antigen-antibodi) dan dapat memberikan gambaran kualitatif dari intensitas warna yangterbentuk maupun gambaran kuantitatif. Teknik imunohistokimia dapat digunakanuntuk mempelajari distribusi enzim yang spesifik pada struktur sel intak(normal/lengkap), mendeteksikan komponen sel, biomakromolekul sepertiprotein, karbohidrat (Lehr et al. 1999; Ding dan Candido 2000; Nagano et al.2004; Yarim et al. 2004; Rostaing et al. 2004; dan Motoi et al. 2005).
  3. 3. 56 Kemajuan teknologi yang telah dicapai untuk produksi imunoglobulin yolk(IgY) yang mudah dan efisien membuka peluang pemanfaatan IgY dalamberbagai uji imunodiagnostik dan pencegahan penyakit infeksi. IgY telahdimanfaatkan untuk mencegah diare dan karies pada gigi (Soejoedono et al.2005), dan untuk mencegah rabies (Motoi et al. 2006; dan Paryati 2006). IgYdapat dimanfaatkan untuk imunodiagnostik melalui uji imunohistokimia (Motoi etal. 2005) dan uji ELISA (Paryati 2006). Tujuan penelitian ini adalah untukmengetahui keberadaan antigen A. galli dengan menggunakan IgY terhadapekskretori/sekretori A. galli melalui uji imunohistokimia. BAHAN DAN METODETempat dan Waktu Penelitian Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Patologi, Departemen Klinik,Patologi dan Reproduksi, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor.Waktu Penelitian berlangsung 2 bulan dari bulan Juni sampai dengan Juli 2007.Rancangan Penelitian Cacing A. galli dewasa dipotong secara transfersal dan longitudinal setebal3 – 5 µm. Preparat objek ditetesi antibodi primer terhadap ekskretori/sekretori A.galli, antibodi sekunder (IgY conjugate HRP, rabbit anti-chicken). Preparat objekditetesi dengan peroksidase, dan kromogen 3-amino-9-ethyl-carbazole (AEC).Counterstain dilakukan dengan meneteskan Lillie Mayer Hematoksilin secaramerata dan dicuci dengan dionized water. Preparat objek ditutup dengan coverglass yang digenangi dengan gliserin. Visualisasi endapan berwarna(kromogranin) yang terbentuk diamati di bawah mikroskop yang menunjukkanadanya kompleks antigen-antibodi (Lehr et al. 1999).Uji Imunohistokimia Preparat histologi jaringan tubuh cacing A. galli dibuat melalui prosestahapan dehidrasi, clearing, infiltrasi dan embeding dengan parafin, pemotongandan pewarnaan. Jaringan diblok di dalam parafin dan disimpan di dalam lemari es
  4. 4. 57agar parafin menjadi lebih keras sehingga memudahkan pemotongan. Cacing A.galli dipotong secara transfersal dan longitudinal setebal 3 – 5 µm denganmikrotom. Sayatan jaringan diapungkan diatas air hangat pada temperatur 60oCdan dilekatkan pada gelas objek. Parafin dihilangkan dengan xylol (III, II, dan I)masing-masing selama 3 menit. Rehidrasi dilakukan dengan cara merendampreparat objek secara bergantian dalam alkohol konsentrasi 95%, 90%, 80%, dan70% masing-masing selama 3 menit. Preparat objek dicuci (clearing) dengandiionized water selama 15 menit. Peroksidase endogen dihilangkan dengan H2O23% selama 20 menit dan skim milk 0,1% selama 30 menit, dibilas dengandiionized water dan PBS masing-masing 3 kali 5 menit (Yarim et al. 2004). Slide (preparat objek) ditetesi antibodi primer IgY terhadapekskretori/sekretori A. galli secara merata. Antibodi primer yang digunakan padapenelitian ini diperoleh dari hasil purifikasi IgY dengan metode fast performansliquid chromatografi (FPLC) di dalam kuning telur (yolk) dari ayam yangdiimunisasi dengan antigen ekskretori/sekretori stadium L3 A. galli. Preparatobjek dimasukkan ke dalam kotak preparat (humidity chamber) diberi kertastissue yang ditetesi dengan PBS untuk menjaga kelembaban, dimasukkan kedalam lemari es pada temperatur 4oC selama satu malam, dan dicuci 3 kali 5 menitdengan PBS. Preparat objek ditetesi antibodi sekunder (IgY conjugate HRP rabbitanti-chicken, Promega), diinkubasi pada temperatur ruangan selama satu jam, dandicuci 3 kali 5 menit dengan PBS. Preparat objek ditetesi dengan peroksidase,diinkubasi pada temperatur ruangan selama 30 menit, dan dicuci 3 kali 5 menitdengan PBS (Ding dan Candido 2000; Inoue et al. 2003; Rostaing et al. 2004; danMotoi et al. 2005). Preparat objek ditetesi kromogen AEC, diinkubasi pada temperaturruangan selama 3 menit, dan dicuci 3 kali 5 menit dengan PBS. Counterstaindilakukan dengan meneteskan Lillie Mayer Hematoksilin secara merata selamasatu menit dan dicuci dengan dionized water. Preparat objek ditutup dengan coverglass yang direkatkan dengan gliserin. Imunoreaktivitas positif dievaluasi dibawah mikroskop dengan lensa objektif 40 kali. Visualisasi endapan berwarna(kromogranin) yang terbentuk menunjukkan adanya kompleks antigen-antibodi(Lehr et al. 1999).
  5. 5. 58 HASIL PENELITIAN Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa antibodi poliklonal IgY yangterbentuk oleh rangsangan antigen ekskretori/sekretori stadium L3 A. galli dapatmengenal keberadaan antigen cacing A. galli. Kompleks antigen-antibodiditunjukkan oleh reaksi positif yang ditandai munculnya warna jingga kontraspada potongan melintang dan memanjang pada bagian kutikula dan saluran cernaA. galli (Gambar 12). A 20 µm B 20 µm Gambar 12. Reaksi positif uji imunohistokimia terhadap antigen A. galliKeterangan: A = potongan melintang (20x), B = potongan memanjang (10x). Panah tebal = kutikula, Panah tipis = saluran cerna
  6. 6. 59 PEMBAHASAN Teknik polymer peroxidase merupakan teknik yang banyak digunakan.Teknik ini menggunakan dua antibodi, yaitu antibodi primer dan antibodisekunder yang telah dikonjugasikan dengan peroksidase. Reaksi yang ditimbulkandapat diamati dengan mikroskop cahaya yang dapat memberikan gambarankualitatif dari intensitas produk warna yang terbentuk (Lehr et al. 1999).Pembentukan kompleks reaksi antigen-antibodi tersebut berlangsung seperti yangditunjukkan pada Gambar 13. P Gambar 13. Kompleks antigen-antibodi pada teknik polimer peroksidase Untuk mendeteksi peroksidase, ditambahkan suatu kromogen yang dapatmenghasilkan endapan berwarna (kromogranin) pada suatu reaksi sehinggaproduk dapat tervisualisasi. Tujuan umum teknik imunohistokimia adalah untukmengidentifikasi dan mengkarakterisasi komponen struktur dan fungsi sel, olehkarena itu kompleks antigen-antibodi yang terjadi harus dilabel dengan suatu carakhusus agar dapat tervisualisasi. Substansi yang cocok untuk melabel komplekstersebut adalah yang memberikan reaksi warna yang tegas. Kromogen yangdigunakan pada reaksi yang berperoksidase adalah AEC sehingga reaksiberlangsung seperti yang terlihat pada Gambar 14. Peroksidase H2 O2 Endapan merah jambu (kromogranin) AEC Gambar 14. Reaksi pembentukan produk berwarna
  7. 7. 60 Penambahan AEC tidak akan menghasilkan kromogranin tanpa adanyaH2O2 dan peroksidase. Antibodi primer akan bereaksi/berikatan dengan antigen(molekul) jaringan yang dideteksi, selanjutnya antibodi yang dilabel denganperoksidase akan bereaksi dengan antibodi primer tersebut. Sehingga keberadaanenzim peroksidase ini melambangkan adanya kompleks antigen-antibodi. Padapenelitian ini, kompleks antigen-antibodi yang terbentuk pada kutikula dansepanjang saluran cerna cacing A. galli menghasilkan warna jingga kontras(Gambar 12). Lehr et al. (1999) melaporkan bahwa uji imunohistokimia terhadapkarsinoma sel-sel tumor epitel pada itik membentuk dua warna yang kontras.Warna turquoise (biru hijau) adalah representasi positif sitokeratin sel-sel tumorsedangkan warna pink (merah jambu) adalah representasi positif vimentin stroma. Teknik imunohistokimia adalah salah satu metode imunokimiawi yangsudah dikembangkan pada imunodiagnostik penyakit parasitik. Yarim et al.(2004) menyatakan bahwa uji imunohistokimia dapat mendeteksi keberadaanenzim 3β-hydroxysteroid-dehidrogenase (3β-HSD) pada bradyzoit yang menutupisarcocysts di dalam otot skelet domba sebagai inang intermediet Sarcocystis spp.Nagano et al. (2004) membuktikan bahwa antibodi primer dapat mengenal antigencacing Clonorchis sinensis yang berlokasi pada sel-sel epitel intestinal cacingdewasa dan pada telur intrauterin. KESIMPULAN Dari hasil penelitian ini dapat disimpulkan bahwa IgY yang terbentuk olehrangsangan antigen ekskretori/sekretori larva L3 A. galli dapat mengenal antigenyang berada pada kutikula dan saluran cerna A. galli. SARAN Dari hasil penelitian ini dapat disarankan bahwa untuk mengetahuikemungkinan antigen ekskretori/sekretori stadium L3 dan atau IgY dapatmengurangi kelangsungan hidup A. galli perlu dilakukan penelitian secara in vivodan in vitro.

×