Successfully reported this slideshow.
We use your LinkedIn profile and activity data to personalize ads and to show you more relevant ads. You can change your ad preferences anytime.
DNA DİZİ (SEKANS) ANALİZ
TEKNİKLERİ
Ezgi SALMANLI
DANIŞMAN
PROF. DR. TANER KARAOĞLU
02.06.2016 ANKARA ÜNİVERSİTESİ VETERİN...
DNA’nın Yapısı
• DNA, genetik bilginin taşıyıcısıdır ve genetik ürünlerin yapısını belirler
• Fonksiyonları;
• Genetik bil...
DNA’nın Yapısı
• 1953, Watson & Crick
• Monomerleri nükleotit olan linear bir
polimerdir
• Helikal simetrili
• İki polükle...
DNA’nın Yapısı
• Monomer, Nükleotit
• Heterosiklik baz
• N ve C
• Pürin, çift halkalı, Adenin (A) ve Guanin (G)
• Pirimidi...
DNA’nın Yapısı
• Nükleozitler, baz ve şekerin fosfatsız kombinasyonudur.
• Nükleozitlerin serbest şekerinin 5’ –OH grubunu...
DNA’nın polimerizasyonu
• 5’>3’
• Nükleotit şekerinin 3’ karbon atomuna bağlı
serbest OH grubu, diğer bir nükleotitin
fosf...
02.06.2016 ANKARA ÜNİVERSİTESİ VETERİNER FAKÜLTESİ VİROLOJİ ANABİLİM DALI
7
Dizi (sekans) Analiz Teknikleri-Tarihçe
• DNA molekülündeki nükleotit bazlarının sırasıyla hangi baz olduğunun
belirlenmes...
DNA Dizi ( Sekans) Analiz Teknikleri-
Klasifikasyon
• Reaksiyon, seperasyon, tespit ve çıktı analizi
• Baz spesifik reaksi...
Geleneksel Yöntemler-Maxam-Gilbert
Kimyasal Degradasyon Yöntemi
• 1977, Purin ve pirimidinlere hasar veren kimyasallar
1. ...
• ds ya da ssDNA 32P
• Pürin;
Dimetil Sülfat (DMS), şeker ile baz arasındaki glikozidik bağı kırar
Piperidin, aynı bazın o...
02.06.2016 ANKARA ÜNİVERSİTESİ VETERİNER FAKÜLTESİ VİROLOJİ ANABİLİM DALI
12
• Dört reaksiyon poliakrilamid jele yüklenir
• Fragmanlar büyüklüklerine göre ayrışırlar
• En alttan yukarı doğru okunduğu...
Geleneksel Yöntemler-Sanger’in Enzimik
Yöntemi
• Zincir sonlandırma yöntemi,dideoksi nükleotit yöntemi
• 1977, Sanger ve a...
• Metodun orijinalinde;
• P-işaretli primer kalıp DNA’ya bağlanır ve DNA sentezi başlar
• DNA polimeraz dNTP’nin yeni sent...
Sanger’in Enzimik Metotu-dNTP ve ddNTP
• dNTP ( deoksiribonükleosittrifosfat); deoksiriboz şekeri, azotlu baz ve üç adet
f...
Geleneksel Yöntemler-Sanger’in Enzimik
Yöntemi
• Dört reaksiyon miksi hazırlanır ; kalıp DNA, DNA primer’ı, standart dNTP’...
• Her reaksiyon ayrı kuyucukta
yürütülür.
• Aşağıdan yukarı DNA’nın sekansı
elde edilir.
02.06.2016 ANKARA ÜNİVERSİTESİ VE...
Geleneksel Yöntemler-Sanger’in Enzimik
Yöntemi
• Sanger’in enzimik yönteminin zaman içinde
çeşitli varyantları geliştirilm...
İşaretli Primer Yöntemi
• 1986, L. Hood ve ark. , Radyoaktif işaret yerine
floresan işaretleri kullanmış ve otoradyografi
...
İşaretli ddNTP yöntemi (dye-terminator sequencing)
• Jamer M. Prober, floresan işaretli ddNTP
• Succinilfloresanslar; SF-5...
• PCR ile üretilen işaretli DNA fragmentleri
PAGE ile ayrılır ve floresan denetleme
sistemi tarafından identifiye edilir.
...
• Detektörlerden toplanan dijitalleştirilmiş sinyaller, pik bulan bir
algoritmada kullanılır ve DNA bantlarının zaman-pozi...
• Floresan işaretler;
1) Rhodamin’ler
Leroy Hood ve ark.
FAM, JOE, TAMRA, ROX
2) dRhodamin’ler
Rosenblum ve ark.
Dichloror...
• Rhodamine boyalarla yapılan sekans analizlerinde, elektroferogram
piklerindeki değişkenlik, baz isimledirme işleminin ke...
02.06.2016
ANKARA ÜNİVERSİTESİ VETERİNER FAKÜLTESİ VİROLOJİ ANABİLİM DALI
26
• EO bağlantısı
• G piklerinin üstesinden gel...
Seperasyon- Tabaka Jel Sekans Analizi
• PAGE;
Molekülleri büyüklüklerine göre ayıran sistemler
Fazla dişli tarak kullanımı...
Seperasyon-Kapillar Elektroforez, CE
• Harold Swerdlow ve ark.,
• 50nm çapında ısıyı iyi dağıtan sistemlerdir
• Yüksek vol...
02.06.2016 ANKARA ÜNİVERSİTESİ VETERİNER FAKÜLTESİ VİROLOJİ ANABİLİM DALI
29
Büyük Boyutlu Sekans Stratejileri
• 700-800 nt sınırlaması
1) Shotgun, Rastgele Yaklaşım
2) Primer walking- primer yürütme...
Shotgun Sekans Analizi
• Rastgele yaklaşım
• Sekanslanacak bölge üzerinde kontrol yoktur
• DNA çeşitli kesim metotları ile...
02.06.2016 ANKARA ÜNİVERSİTESİ VETERİNER FAKÜLTESİ VİROLOJİ ANABİLİM DALI
32
• Shotgun sekansları bilgisayar ortamında contig denen devamlı
sekanslar haline getirilmek üzere toplanır
• Contig, orijin...
• Bu işlem için kullanılan bilgisayar programları;
• Vektör sekansını filtreler
• Benzerlik skorlaması yapar
• Nadir olara...
02.06.2016 ANKARA ÜNİVERSİTESİ VETERİNER FAKÜLTESİ VİROLOJİ ANABİLİM DALI
35
• Her birleştime işlemi için Consed vb editör...
Primer yürütme stratejisi
• Bilinmeyen DNA sekansı tam
boyutlu olarak vektöre insersiye edilip
amplifiye edilir
• Ticari v...
Gelecek Nesil Sekanslama Teknolojileri
• Next generation sequencing, Gelecek Nesil Sekans Analizleri, Büyük
ölçekte parale...
1)Pirosekans analizi
• DNA sentezi sırasında açığa çıkan pirofosfatın (PPi) tespitine dayalı
tekniktir.
• Her nükleotit bi...
• Kalıp hazırlanması;
emPCR kullanılır
Streptavidin kaplı boncuklar
02.06.2016 ANKARA ÜNİVERSİTESİ VETERİNER FAKÜLTESİ VİR...
1) Solidfaz pirosekanslama
Üçlü enzim sistemi, fazla substrat her basamakta yıkama ile atılır.
02.06.2016 ANKARA ÜNİVERSİT...
2) Likit faz pirosekanslama
Dördüncü bir enzim, apiraz
Nükleotit degrade eder
Tek tüpte pirosekans reaksiyonu
02.06.2016 A...
• Roche 454
DNA’nın fragmentasyon
Adaptör bağlanması
Boncuklar
Her boncuk mikroplate’e alınır ve kuyucuklar daha küçük
bon...
02.06.2016 ANKARA ÜNİVERSİTESİ VETERİNER FAKÜLTESİ VİROLOJİ ANABİLİM DALI
43
2)Reversible Termination
• Kalıp DNA,DNA'nın fragmentasyonu,uçlara adaptörlerin bağlanması
• Bu fragmentler daha sonra cam...
• Illumina (SOLEXA) Genome Analyzer
• Sekans kimyası 3 aşamalı;
• Zincir uzaması DNA polimeraz ve dört reversible nükleoti...
3)Ligasyon ile Sekans Analizi
• DNA polimeraz içermez
• İkişer baz tespit eder
• Kalıp DNA, fragmentasyon, adaptör bağlanm...
• Applied Biosystem’s Solid
• Oktamerin son üç bazı floresan boya ile uzaklaştırılır ve geride 5 baz
bırakılır
• Önceki aş...
Sonuç
• Sekans analizi günümüze kadar birçok gelişme göstermiş ve hala gelişmeye
devam eden bir tekniktir
• Temelde araştı...
Teşekkürler 
02.06.2016 ANKARA ÜNİVERSİTESİ VETERİNER FAKÜLTESİ VİROLOJİ ANABİLİM DALI
49
Upcoming SlideShare
Loading in …5
×

DNA sekans analizleri (DNA sequencing)

5,393 views

Published on

  • Be the first to comment

DNA sekans analizleri (DNA sequencing)

  1. 1. DNA DİZİ (SEKANS) ANALİZ TEKNİKLERİ Ezgi SALMANLI DANIŞMAN PROF. DR. TANER KARAOĞLU 02.06.2016 ANKARA ÜNİVERSİTESİ VETERİNER FAKÜLTESİ VİROLOJİ ANABİLİM DALI
  2. 2. DNA’nın Yapısı • DNA, genetik bilginin taşıyıcısıdır ve genetik ürünlerin yapısını belirler • Fonksiyonları; • Genetik bilginin taşınması • Aktarılması • Proteinlerin kodlanması 02.06.2016 ANKARA ÜNİVERSİTESİ VETERİNER FAKÜLTESİ VİROLOJİ ANABİLİM DALI 2
  3. 3. DNA’nın Yapısı • 1953, Watson & Crick • Monomerleri nükleotit olan linear bir polimerdir • Helikal simetrili • İki polükleotit zinciri, komplementer • Dış tarafta şeker-fosfat omurgası • İç tarafta bazlar • İki iplikçiğin oryantasyonu antiparaleldir ve 5’-3’ yönleri birbirinin tersidir. 02.06.2016 ANKARA ÜNİVERSİTESİ VETERİNER FAKÜLTESİ VİROLOJİ ANABİLİM DALI 3
  4. 4. DNA’nın Yapısı • Monomer, Nükleotit • Heterosiklik baz • N ve C • Pürin, çift halkalı, Adenin (A) ve Guanin (G) • Pirimidin, tek halkalı, Sitozin, Timin ya da Urasil • Şeker (Riboz ya da Deoksiriboz) • 1C b-glikozil bağı ile baza bağlı • Fosfat • 5’-OH grubu fosforile olur • Asidik karakter 02.06.2016 ANKARA ÜNİVERSİTESİ VETERİNER FAKÜLTESİ VİROLOJİ ANABİLİM DALI4
  5. 5. DNA’nın Yapısı • Nükleozitler, baz ve şekerin fosfatsız kombinasyonudur. • Nükleozitlerin serbest şekerinin 5’ –OH grubunun esterleşerek fosforile olmasıyla nükleotitler oluşur 02.06.2016 ANKARA ÜNİVERSİTESİ VETERİNER FAKÜLTESİ VİROLOJİ ANABİLİM DALI 5
  6. 6. DNA’nın polimerizasyonu • 5’>3’ • Nükleotit şekerinin 3’ karbon atomuna bağlı serbest OH grubu, diğer bir nükleotitin fosfat grubuna hamle yaparak yeni bazı ekler, DNA polimeraz • Pirofosfat salınır • Fosfodiester bağı oluşur • İki sarmal karşılıklı olarak ise bazlar arasındaki Hidrojen bağları sayesinde birarada tutulur. • Hidrofobik etki ile DNA molekülünün stabilitesi sağlanır • İki halkalı pürin bazlar, tek halkalı pirimidin bazlar ile karşı karşıya gelir. • A her zaman T ile, iki hidrojen bağı • G her zaman C ile, üç hidrojen bağı 02.06.2016 ANKARA ÜNİVERSİTESİ VETERİNER FAKÜLTESİ VİROLOJİ ANABİLİM DALI 6
  7. 7. 02.06.2016 ANKARA ÜNİVERSİTESİ VETERİNER FAKÜLTESİ VİROLOJİ ANABİLİM DALI 7
  8. 8. Dizi (sekans) Analiz Teknikleri-Tarihçe • DNA molekülündeki nükleotit bazlarının sırasıyla hangi baz olduğunun belirlenmesine denmektedir. • 1953, DNA’nın çift sarmal yapısının bulunması • 1972, ilk genin sekanslanması • 1977, Sanger ve Maxam-Gilbert • 1977, φX174, ilk tam genom sekansı • 1984, ilk uzun genom Epstein-Barr virüs • 1987, Applied Biosystems, otomasyon 02.06.2016 ANKARA ÜNİVERSİTESİ VETERİNER FAKÜLTESİ VİROLOJİ ANABİLİM DALI 8
  9. 9. DNA Dizi ( Sekans) Analiz Teknikleri- Klasifikasyon • Reaksiyon, seperasyon, tespit ve çıktı analizi • Baz spesifik reaksiyonlar ya da enzimatik zincir uzaması DNA polimeraz • Klasifikasyon ; 1.İlk Nesil Sekans Analiz Teknikleri – Geleneksel Yöntemler - Alan-Maxam Gilbert’in Kimyasal degradasyon yöntemi -Sanger’in enzimatik yöntemi ve varyantları (Sanger sekanslama, Dideoxynükleotit yöntemi, Zincir sonlandırma metodu) 2.Gelecek Nesil Sekans Analiz Teknikleri ( İkinci Nesil Sekans Analiz Teknikleri) 1) Pirosekans analizi 2) Reversible Termination 3) Ligasyon ile Sekans Analizi 02.06.2016 ANKARA ÜNİVERSİTESİ VETERİNER FAKÜLTESİ VİROLOJİ ANABİLİM DALI 9
  10. 10. Geleneksel Yöntemler-Maxam-Gilbert Kimyasal Degradasyon Yöntemi • 1977, Purin ve pirimidinlere hasar veren kimyasallar 1. Baz modifikasyonu 2. Modifiye bazın şekerden ayrılması 3. DNA iplikçiğinin bu bazın olduğu pozisyondan kırılması Poliakrilamid Jel Elektroforezi (PAGE) 02.06.2016 ANKARA ÜNİVERSİTESİ VETERİNER FAKÜLTESİ VİROLOJİ ANABİLİM DALI 10
  11. 11. • ds ya da ssDNA 32P • Pürin; Dimetil Sülfat (DMS), şeker ile baz arasındaki glikozidik bağı kırar Piperidin, aynı bazın olduğu nükleotitte fosfodiester bağlarını katalizler DMS ve Piperidin Guanine hasar verir (G) DMS ve Piperidin, formik asit içinde Adenin ve Guanine hasar verir ( A+G) • Pirimidin; Hidrazin, şeker ile baz arasındaki glikozidik bağı kırar Piperidin, fosfodiester bağlarını katalizler Hidrazin ve piperidin Timin ve Sitozin nükleotitlerine hasar verir (T+C) Hidrazin ve piperidin, 1.5M NaCl solüsyonu içinde Sitozine hasar verir (C) 02.06.2016 ANKARA ÜNİVERSİTESİ VETERİNER FAKÜLTESİ VİROLOJİ ANABİLİM DALI11
  12. 12. 02.06.2016 ANKARA ÜNİVERSİTESİ VETERİNER FAKÜLTESİ VİROLOJİ ANABİLİM DALI 12
  13. 13. • Dört reaksiyon poliakrilamid jele yüklenir • Fragmanlar büyüklüklerine göre ayrışırlar • En alttan yukarı doğru okunduğunda 5’-3’ yönünde DNA sekansını verir 02.06.2016 ANKARA ÜNİVERSİTESİ VETERİNER FAKÜLTESİ VİROLOJİ ANABİLİM DALI 13
  14. 14. Geleneksel Yöntemler-Sanger’in Enzimik Yöntemi • Zincir sonlandırma yöntemi,dideoksi nükleotit yöntemi • 1977, Sanger ve ark. 02.06.2016 ANKARA ÜNİVERSİTESİ VETERİNER FAKÜLTESİ VİROLOJİ ANABİLİM DALI14
  15. 15. • Metodun orijinalinde; • P-işaretli primer kalıp DNA’ya bağlanır ve DNA sentezi başlar • DNA polimeraz dNTP’nin yeni sentezlenen DNA’ya polimerizasyonunu gerçekleştirir. • Polimerizasyon enzim ddNTP ile zinciri devam ettirmeye çalışana kadar devam eder => chain termination 02.06.2016 ANKARA ÜNİVERSİTESİ VETERİNER FAKÜLTESİ VİROLOJİ ANABİLİM DALI 15
  16. 16. Sanger’in Enzimik Metotu-dNTP ve ddNTP • dNTP ( deoksiribonükleosittrifosfat); deoksiriboz şekeri, azotlu baz ve üç adet fosfat grubu – iki adet fosfat grubunu polimerizasyon sırasında kaybeder açığa çıkan enerji polimerizasyonun sağlanmasında kullanılır • dATP, dTTP, dCTP, dGTP • Riboz molekülü 2’ ve 3’ karbonlarında, deoksiriboz ise 3’ karbonunda hidroksi grupları; O-p-O bağları içi gerekli • Ribozun 3. formu OH gruplarından tamamen yoksun: dideoksiriboz • Dideoksiribozlarla oluşturulan dideoksitrifosfat bir polinükleotite girdiği zaman zincir uzaması durur: zincir uzaması inhibitörleri 02.06.2016 ANKARA ÜNİVERSİTESİ VETERİNER FAKÜLTESİ VİROLOJİ ANABİLİM DALI 16
  17. 17. Geleneksel Yöntemler-Sanger’in Enzimik Yöntemi • Dört reaksiyon miksi hazırlanır ; kalıp DNA, DNA primer’ı, standart dNTP’ler ve her reaksiyonda bir çeşit ddNTP PCR • ddNTP, dNTP konsenterasyonunun 1% kadar • Polimerizasyon sırasında ddNTP kullanıldığı zaman zincir uzaması durur • Farklı boyutlarda son nükleotiti bilinen fragmentler elde edilir. Hepsinin 5’ ucu aynıdır fakat 3’ uç reaksiyonda kullanılan ddNTP’ye göre değişir. PAGE 02.06.2016 ANKARA ÜNİVERSİTESİ VETERİNER FAKÜLTESİ VİROLOJİ ANABİLİM DALI 17
  18. 18. • Her reaksiyon ayrı kuyucukta yürütülür. • Aşağıdan yukarı DNA’nın sekansı elde edilir. 02.06.2016 ANKARA ÜNİVERSİTESİ VETERİNER FAKÜLTESİ VİROLOJİ ANABİLİM DALI18
  19. 19. Geleneksel Yöntemler-Sanger’in Enzimik Yöntemi • Sanger’in enzimik yönteminin zaman içinde çeşitli varyantları geliştirilmiştir. Bunlar; 1.İşaretli primer Yöntemi 2.İşaretli dNTP Yöntemi 3.İşaretli ddNTP Yöntemi 02.06.2016 ANKARA ÜNİVERSİTESİ VETERİNER FAKÜLTESİ VİROLOJİ ANABİLİM DALI 19
  20. 20. İşaretli Primer Yöntemi • 1986, L. Hood ve ark. , Radyoaktif işaret yerine floresan işaretleri kullanmış ve otoradyografi yerine lazerli floresan detektörlerle baz isimlendirmenin yapılabilirliğini duyurmuş. • 4 reaksiyonda primer dört farklı floresandan biriyle işaretli, bir tip ddNTP ve dört tip dNTP • Reaksiyon sonunda havuzlanan ürün PAGE’de tek sırada yürütülmüş ve lazer floresan detektörü ile taranmış. Bigisayar programı yardımı ile kromatogramlar oluşturulmuş 02.06.2016 ANKARA ÜNİVERSİTESİ VETERİNER FAKÜLTESİ VİROLOJİ ANABİLİM DALI 20
  21. 21. İşaretli ddNTP yöntemi (dye-terminator sequencing) • Jamer M. Prober, floresan işaretli ddNTP • Succinilfloresanslar; SF-505, SF512, SF519, SF526 • Büyüklük olarak identiktirler ve aynı yükü taşırlar • ddG, ddC, ddA ve ddT’ye eklenir 02.06.2016 ANKARA ÜNİVERSİTESİ VETERİNER FAKÜLTESİ VİROLOJİ ANABİLİM DALI 21
  22. 22. • PCR ile üretilen işaretli DNA fragmentleri PAGE ile ayrılır ve floresan denetleme sistemi tarafından identifiye edilir. • Optik filtreleme sistemi; istenmeyen sinyallerin engellenmesi • Ayna; detektörün görüş alanından çıkan ışınlar için dönüş yolu • Filtre; dağılan lazer ışınını yok eder • Kullanılan boyalar emisyon ve absorbsiyon spektrumundaki küçük farklarla ayırt edilir. 02.06.2016 ANKARA ÜNİVERSİTESİ VETERİNER FAKÜLTESİ VİROLOJİ ANABİLİM DALI 22
  23. 23. • Detektörlerden toplanan dijitalleştirilmiş sinyaller, pik bulan bir algoritmada kullanılır ve DNA bantlarının zaman-pozisyonları belirlenir • Piklerin yer-zaman pozisyonları belirlendiğinde istatiksel analizle baz sırası belirlenir • Tek reaksiyon, tek sıra jel, prematüre sonlanan fragmentler görüntülenmez • İlk 15-40 baz düşük kalitede • 700-900 bazdan sonra kalite düşer 02.06.2016 ANKARA ÜNİVERSİTESİ VETERİNER FAKÜLTESİ VİROLOJİ ANABİLİM DALI 23
  24. 24. • Floresan işaretler; 1) Rhodamin’ler Leroy Hood ve ark. FAM, JOE, TAMRA, ROX 2) dRhodamin’ler Rosenblum ve ark. Dichlororhodamine’ler (dRhodamine) Rosenblum ve ark. 3) BigDye boyalar- Enerji Transfer Boyaları 5-karboksi-d-rhodamine boyalarını alıcı olarak, 4-aminometilfloresceinin, 5 ya da 6- karboksil izomerlerini ise dönör olarak kullanan enerji transfer boyaları 02.06.2016 ANKARA ÜNİVERSİTESİ VETERİNER FAKÜLTESİ VİROLOJİ ANABİLİM DALI 24
  25. 25. • Rhodamine boyalarla yapılan sekans analizlerinde, elektroferogram piklerindeki değişkenlik, baz isimledirme işleminin kesinliğini ve heterozigot mutasyonların tespitini engellemektedir. • G bazını A bazı ve bazen C bazı takip ettiği zaman, G bazının pik uzunluğu normal G nükleotit pikinden ve önceki A veya C nükleotit pikinden daha az olmaktadır. • G pikleri, suprese bir G pikini de takip ettiğinde de gizlenebilmektedir. 02.06.2016 ANKARA ÜNİVERSİTESİ VETERİNER FAKÜLTESİ VİROLOJİ ANABİLİM DALI 25
  26. 26. 02.06.2016 ANKARA ÜNİVERSİTESİ VETERİNER FAKÜLTESİ VİROLOJİ ANABİLİM DALI 26 • EO bağlantısı • G piklerinin üstesinden gelinmiştir • BigDye; G piklerinden sonra Zayıf T pikleri
  27. 27. Seperasyon- Tabaka Jel Sekans Analizi • PAGE; Molekülleri büyüklüklerine göre ayıran sistemler Fazla dişli tarak kullanımı verimliliği artırır Partiküllerin eliminasyonu, dikkatli manipülasyon ve jel dökmenin dikkat ve iş gücü gerektirmesi 02.06.2016 ANKARA ÜNİVERSİTESİ VETERİNER FAKÜLTESİ VİROLOJİ ANABİLİM DALI 27
  28. 28. Seperasyon-Kapillar Elektroforez, CE • Harold Swerdlow ve ark., • 50nm çapında ısıyı iyi dağıtan sistemlerdir • Yüksek voltajda çalıştırılabilir; koşturma zamanı düşer. • Otomasyona uygun. • Kapillar sistemler ilk olarak poliakrilamid gibi çapraz bağlı polimerlerle, jel doldurmalı olarak floresan okuyan lazerlerle kullanılmaktaydı ve bunlar tekrar kullanıma imkan vermemekteydi • 1993, Karger ve ark. düşük viskoziteli çapraz bağlı olmayan polimer koşturmadan sonra geri çekilir ve yeni koşturmada yenisi tekrar kapillara doldurulur. • Multikapillar sistemler; 8-384’lü 02.06.2016 ANKARA ÜNİVERSİTESİ VETERİNER FAKÜLTESİ VİROLOJİ ANABİLİM DALI 28
  29. 29. 02.06.2016 ANKARA ÜNİVERSİTESİ VETERİNER FAKÜLTESİ VİROLOJİ ANABİLİM DALI 29
  30. 30. Büyük Boyutlu Sekans Stratejileri • 700-800 nt sınırlaması 1) Shotgun, Rastgele Yaklaşım 2) Primer walking- primer yürütme stratejisi 02.06.2016 ANKARA ÜNİVERSİTESİ VETERİNER FAKÜLTESİ VİROLOJİ ANABİLİM DALI 30
  31. 31. Shotgun Sekans Analizi • Rastgele yaklaşım • Sekanslanacak bölge üzerinde kontrol yoktur • DNA çeşitli kesim metotları ile 2-3 kb’lık fragmentlere ayrılır • Bu fragmentler bir vektöre aktarılır; M13, plasmid • Bakteriyel kültür’de amplifikasyon • Pozitif klonların purifikasyonu • Her DNA parçası ayrı olarak sekanslanır ve elektronik olarak devamlı tek bir sekans haline getirilir; sekans toplanması 02.06.2016 ANKARA ÜNİVERSİTESİ VETERİNER FAKÜLTESİ VİROLOJİ ANABİLİM DALI 31
  32. 32. 02.06.2016 ANKARA ÜNİVERSİTESİ VETERİNER FAKÜLTESİ VİROLOJİ ANABİLİM DALI 32
  33. 33. • Shotgun sekansları bilgisayar ortamında contig denen devamlı sekanslar haline getirilmek üzere toplanır • Contig, orijinal kalıp DNA’dan alınan temelle iki ya da daha fazla sekansın çakışan bölgelerinin okunmasından oluşur. • Otomatik olarak başlayıp manuel olarak düzenleme ile son bulur 02.06.2016 ANKARA ÜNİVERSİTESİ VETERİNER FAKÜLTESİ VİROLOJİ ANABİLİM DALI33
  34. 34. • Bu işlem için kullanılan bilgisayar programları; • Vektör sekansını filtreler • Benzerlik skorlaması yapar • Nadir olarak homojen kalitede tek bir contig ile karşılaşılır Manuel faz, gap closure (boşluk kapanması), bitirme Consed 02.06.2016 ANKARA ÜNİVERSİTESİ VETERİNER FAKÜLTESİ VİROLOJİ ANABİLİM DALI 34
  35. 35. 02.06.2016 ANKARA ÜNİVERSİTESİ VETERİNER FAKÜLTESİ VİROLOJİ ANABİLİM DALI 35 • Her birleştime işlemi için Consed vb editörler bir sekans okuması listesi gösterir. • Manuel denetim aşaması • Konsensus sekansı • Bazen ek sekans reaksiyonu bazen de o bölgenin direk sekansı gerekebilmektedir.
  36. 36. Primer yürütme stratejisi • Bilinmeyen DNA sekansı tam boyutlu olarak vektöre insersiye edilip amplifiye edilir • Ticari vektör primerları ilk sekans reaksiyonu için kullanılır,600-650 bazlık bir sekans çıktısı elde edilir • Bu bölge içinden 2. bir spesifik oligonükleotit sentezlenir ve ilkiyle aynı yönü izlerek sekansı 500 bp civarı genişletmek için kullanılır. 02.06.2016 ANKARA ÜNİVERSİTESİ VETERİNER FAKÜLTESİ VİROLOJİ ANABİLİM DALI 36
  37. 37. Gelecek Nesil Sekanslama Teknolojileri • Next generation sequencing, Gelecek Nesil Sekans Analizleri, Büyük ölçekte paralel sekans analizleri • 454 sekanslama(454 genom sekanslayıcı,roche applied science) • Solexa teknoloji (Illumina genom analyser) • The SOLID platform(Applied biosystem) 02.06.2016 ANKARA ÜNİVERSİTESİ VETERİNER FAKÜLTESİ VİROLOJİ ANABİLİM DALI 37
  38. 38. 1)Pirosekans analizi • DNA sentezi sırasında açığa çıkan pirofosfatın (PPi) tespitine dayalı tekniktir. • Her nükleotit birleştirilmesinde PPİ açığa çıkar • PPİ adenosine 5’ fosfosülfat varlığında ATP sülfürilaz tarafından ATP'ye dönüştürülür. • ATP, kemiluminesens bir enzim olan, lusiferazın lusiferine okside olması ve ışık yayması reaksiyonuna enerji sağlar ve substrat olarak görev yapar. Eklenen nükleotit bilindiğinden, kalıbın sekansı tespit edilebilir. • Işık CCD kamera (charge coupled device) tarafından tespit edilir 02.06.2016 ANKARA ÜNİVERSİTESİ VETERİNER FAKÜLTESİ VİROLOJİ ANABİLİM DALI 38
  39. 39. • Kalıp hazırlanması; emPCR kullanılır Streptavidin kaplı boncuklar 02.06.2016 ANKARA ÜNİVERSİTESİ VETERİNER FAKÜLTESİ VİROLOJİ ANABİLİM DALI 39
  40. 40. 1) Solidfaz pirosekanslama Üçlü enzim sistemi, fazla substrat her basamakta yıkama ile atılır. 02.06.2016 ANKARA ÜNİVERSİTESİ VETERİNER FAKÜLTESİ VİROLOJİ ANABİLİM DALI 40
  41. 41. 2) Likit faz pirosekanslama Dördüncü bir enzim, apiraz Nükleotit degrade eder Tek tüpte pirosekans reaksiyonu 02.06.2016 ANKARA ÜNİVERSİTESİ VETERİNER FAKÜLTESİ VİROLOJİ ANABİLİM DALI 41
  42. 42. • Roche 454 DNA’nın fragmentasyon Adaptör bağlanması Boncuklar Her boncuk mikroplate’e alınır ve kuyucuklar daha küçük boncuklarla doldurulur (sulfurilaz ve lusiferaz) Zincir uzaması CCD kamera tarafından takip edilir 02.06.2016 ANKARA ÜNİVERSİTESİ VETERİNER FAKÜLTESİ VİROLOJİ ANABİLİM DALI 42
  43. 43. 02.06.2016 ANKARA ÜNİVERSİTESİ VETERİNER FAKÜLTESİ VİROLOJİ ANABİLİM DALI 43
  44. 44. 2)Reversible Termination • Kalıp DNA,DNA'nın fragmentasyonu,uçlara adaptörlerin bağlanması • Bu fragmentler daha sonra cam bir yüzeye sabitlenmiş 'çimenlik' alanda bulunan problara hibridize olurlar. • Burada hem amplifikasyon hem sekanslama gerçekleşir. Amplifikasyon 'bridge pcr' denen bir teknikle yapılır; yüzeye sabitlenmiş iki primer DNA salkımları oluşturur. 02.06.2016 ANKARA ÜNİVERSİTESİ VETERİNER FAKÜLTESİ VİROLOJİ ANABİLİM DALI 44
  45. 45. • Illumina (SOLEXA) Genome Analyzer • Sekans kimyası 3 aşamalı; • Zincir uzaması DNA polimeraz ve dört reversible nükleotit sonlandırıcı ile • Her nükleotit birleşmesinden sonra birleşmeyen nükleotitler yıkanır ve görüntüleme işlemi yapılır • Görüntülemeden sonra 3’-OH bloke grup kimyasal olarak uzaklaştırılır. • Yeni siklus gerçekleştirilir. 02.06.2016 ANKARA ÜNİVERSİTESİ VETERİNER FAKÜLTESİ VİROLOJİ ANABİLİM DALI 45
  46. 46. 3)Ligasyon ile Sekans Analizi • DNA polimeraz içermez • İkişer baz tespit eder • Kalıp DNA, fragmentasyon, adaptör bağlanması, boncuklara hibridizasyon ve emPCR • Primer ve prob eklenmesi reaksiyonu başlatır • Prob’un ilk iki bazı prob’u tanımlar geri kalan 6 baz dejeneredir • İki baz mümkün tüm kombinasyonları içerir • Prob kalıba hibridize olduktan sonra DNA ligaz tarafından zincire bağlanır. ‘Flow cell’ prob’u uzaklaştırmak için yıkanır ve görüntü kaydedilir ve renk tespit edilir. 02.06.2016 ANKARA ÜNİVERSİTESİ VETERİNER FAKÜLTESİ VİROLOJİ ANABİLİM DALI 46
  47. 47. • Applied Biosystem’s Solid • Oktamerin son üç bazı floresan boya ile uzaklaştırılır ve geride 5 baz bırakılır • Önceki aşamalar 6. ve 7. bazlar için tekrarlanır. Tipik olarak bu aşama yaklaşık 10 kez tekrarlanır. Sonuç olarak on adet dinükleotite karşılık gelen floresan renkler tespit edilir (1-2, 6-7, 11-12, 16-17, 21-22, 26- 27, 31-32, 36-37, 41-42, 46-47) • İlk primer ve tüm bağlanmış parçalar eritilir • Primer reset, n-1 primer ile devam eder 02.06.2016 ANKARA ÜNİVERSİTESİ VETERİNER FAKÜLTESİ VİROLOJİ ANABİLİM DALI 47
  48. 48. Sonuç • Sekans analizi günümüze kadar birçok gelişme göstermiş ve hala gelişmeye devam eden bir tekniktir • Temelde araştırıcılar sekans analizini çeşitli hastalıkların tanımlanmasında kullanmaktadırlar • Globalizasyon Yeni patojenler (Marburg, Severe Acute respiratory Syndrome) • Otomatik sanger sekans analiz platformları insan genom projesinin 13 yıldan kısa bir sürede tamamlanmasını sağlamış olsa da teknoloji hala çok fazla DNA, reagent, işgücü gerektirmektedir. • Oxford’s Nanopore tech., elektriksel potansiyel • ZS Genetics, EM 02.06.2016 ANKARA ÜNİVERSİTESİ VETERİNER FAKÜLTESİ VİROLOJİ ANABİLİM DALI 48
  49. 49. Teşekkürler  02.06.2016 ANKARA ÜNİVERSİTESİ VETERİNER FAKÜLTESİ VİROLOJİ ANABİLİM DALI 49

×