Curso Internacional de Ciencia y Tecnología
Curso de Ciencias Para Profesores
Julio 2013
20 de Julio 2013
Universidad Rica...
“Descubriendo la función de los
genes en los microorganismos”
Julio - 2013
UPCH-LID Bryan Lucero 1/31
Bryan Lucero
Laborat...
Esquema
• Dogma Central BM.
• Estrategias de estudio
• Knock Out / Knock Down .
• M. tuberculosis.
• Pirazinamida.
• Metal...
Dogma Central de la Biología Molecular
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Flujo de información
ADN
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(Crick ,1970) “'Ce...
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¿Cómo descubrir la función de un
gen?
Genética Funcional
Knockout
Knock down
(Kaur, 2010)
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TUBERCULOSIS
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(WHO,2010)
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• 4.42 Mb
• ~4124 genes.
• 65.62 GC%
GENOMA
(Broad Institute, 2013)
FÁRMACOS
UPCH-LID Bryan Lucero 8/31
Pirazinamida
(Minsa,2009)
Causas de resistencia
• Mal funcionamiento
de la PZAsa
• Falta Expresión de la
PZAsa.
• Mutaciones en RpsA.
• Fallas en la...
Falla por mutaciones
en el promotor
Falla por mutaciones
en el gen codificante
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Causas de resistencia
• Mal funcionamiento
de la PZAsa
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PZAsa.
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Causas de resistencia
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de la PZAsa
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PZAsa.
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• Fallas en la...
¿conocemos todas la piezas?
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Justificación
• Mejor entendimiento del mecanismo de resistencia
• Mejor diagnóstico de resistencia a PZA.
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Resultados esperados
• Se espera encontrar niveles óptimos de silenciamiento genético para determinar
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Limitaciones
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Condición
del gen
Sesgo en los
criterios de
selección
Familia
genética
Gracias por su
atención
Agradecimientos
Laboratorio de Biología Molecular y Bioinformática.
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Otros Proyectos
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Función de los genes en microorganismos - Bryan Lucero

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20 de Julio 2013
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Científicos Peruanos Jóvenes en el Perú y el Extranjero
Centro de Preparación para la Ciencia y Tecnología
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Función de los genes en microorganismos - Bryan Lucero

  1. 1. Curso Internacional de Ciencia y Tecnología Curso de Ciencias Para Profesores Julio 2013 20 de Julio 2013 Universidad Ricardo Palma Organizado por: Científicos Peruanos Jóvenes en el Perú y el Extranjero Centro de Preparación para la Ciencia y Tecnología Universidad Ricardo Palma http://escueladeciencias.hol.es
  2. 2. “Descubriendo la función de los genes en los microorganismos” Julio - 2013 UPCH-LID Bryan Lucero 1/31 Bryan Lucero Laboratorio de Biología Molecular y Bioinformática.
  3. 3. Esquema • Dogma Central BM. • Estrategias de estudio • Knock Out / Knock Down . • M. tuberculosis. • Pirazinamida. • Metalochaperonas / bombas de eflujo. • Limitaciones. • Agradecimientos UPCH-LID Bryan Lucero 2/31
  4. 4. Dogma Central de la Biología Molecular UPCH-LID Bryan Lucero 3/31 Flujo de información ADN ARN Proteína (Crick ,1970) “'Central Dogma of Molecular Biology. Nature 227, 561-563
  5. 5. UPCH-LID Bryan Lucero 4/31 Flujo de información ARN Proteína ADN Transcripción Traducción Replicación Knockout KnockDown M.O
  6. 6. ¿Cómo descubrir la función de un gen? Genética Funcional Knockout Knock down (Kaur, 2010) UPCH-LID Bryan Lucero 5/31
  7. 7. TUBERCULOSIS UPCH-LID Bryan Lucero 6/31 (WHO,2010)
  8. 8. UPCH-LID Bryan Lucero 7/31 • 4.42 Mb • ~4124 genes. • 65.62 GC% GENOMA (Broad Institute, 2013)
  9. 9. FÁRMACOS UPCH-LID Bryan Lucero 8/31 Pirazinamida (Minsa,2009)
  10. 10. Causas de resistencia • Mal funcionamiento de la PZAsa • Falta Expresión de la PZAsa. • Mutaciones en RpsA. • Fallas en la bomba de eflujo. UPCH-LID Bryan Lucero 9/31 (Zhang, 2003)
  11. 11. Falla por mutaciones en el promotor Falla por mutaciones en el gen codificante UPCH-LID Bryan Lucero 10/31 ¿? 5 factores: 1. Entrada de PZA. 2. Actividad de PZAasa. 3. [PZAsa]. 4. Eficiencia de Bombas 5. [Bombas]
  12. 12. Causas de resistencia • Mal funcionamiento de la PZAsa • Falta Expresión de la PZAsa. • Mutaciones en RpsA. • Fallas en la bomba de eflujo. UPCH-LID Bryan Lucero 11/31 (Zhang, 2003) MTCH
  13. 13. Causas de resistencia • Mal funcionamiento de la PZAsa • Falta Expresión de la PZAsa. • Mutaciones en RpsA. • Fallas en la bomba de eflujo. UPCH-LID Bryan Lucero 12/31 (Zhang, 2003) (Zimic,2011)
  14. 14. ¿conocemos todas la piezas? UPCH-LID Bryan Lucero 13/31
  15. 15. Justificación • Mejor entendimiento del mecanismo de resistencia • Mejor diagnóstico de resistencia a PZA. • Mejor tratamiento. Mas rápido , mas económico. UPCH-LID Bryan Lucero 14/31
  16. 16. Determinar la relación directa del efecto del silenciamiento gradual en la expresión de los genes candidatos a bombas de eflujo/mtch sobre el mecanismo de acción de la pirazinamida. • Hallar y priorizar genes candidatos a bombas de eflujo/mtch relacionados al mecanismo de acción de la pirazinamida en el genoma de M. tuberculosis . • Obtener cepas transformadas de M. tuberculosis que permitan un silenciamiento gradual de los genes blancos. • Observar el efecto del silenciamiento gradual de las bombas de eflujo candidatas sobre la condición de resistencia a pirazinamida. • Analizar estadísticamente el efecto directo del silenciamiento genético y la susceptibilidad de estas cepas hacia las droga. OBJETIVOS UPCH-LID Bryan Lucero 15/31
  17. 17. ¿Está alguna de las bombas de eflujo/MTCH candidatas halladas en el genoma de Mycobacterium tuberculosis relacionada directamente al mecanismo de acción de la pirazinamida ? Pregunta problema Hipótesis El silenciamiento de por lo menos un gen candidato a bomba de eflujo estaría involucrado en el mecanismo de acción de la pirazinamida en el eflujo de ácido pirazinoico. UPCH-LID Bryan Lucero 16/31
  18. 18. UPCH-LID Bryan Lucero 17/31 A
  19. 19. Lista de genes candidatos encontrados en M. tuberculosis back Referencias BLAST UPCH-LID Bryan Lucero 18/31 Anotación Búsqueda Directa 1
  20. 20. UPCH-LID Bryan Lucero 19/31 2 PZAsa RpsA 80 genomas Bombas/MTCH Cepas Resistentes Selección de Candidatos
  21. 21. UPCH-LID Bryan Lucero 20/31 B C
  22. 22. BamHI - NedI Plásmido UPCH-LID Bryan Lucero 21/31 Optimización del diseño -Considerar el sitio de unión al ribosoma. -Evitar estructuras secundarias que causen homodimerización. C Transformación de cepas H37Rv
  23. 23. Knock Down Considerando 6-9 nn antes de ATG/GAG y una longitud <400 nn UPCH-LID Bryan Lucero 22/31
  24. 24. UPCH-LID Bryan Lucero 23/31 D
  25. 25. Wayne Test de Wayne El método de Wayne es una prueba colorimétrica que detecta POA, este es expulsado por el bacilo en el medio de cultivo y mediante la reacción de Wayne se forma un complejo químico de color rojo, mediante una lectura a una longitud de 450 nm se detectará la actividad de la pirazinamidasa en relación con el silenciamiento de las metalochaperonas hipotéticas. UPCH-LID Bryan Lucero 24/31 pAZ: Gradiente de Inducción
  26. 26. WAYNE pH 7.4 Control de la matriz: 1 A Controles para PZA: A Controles para IPTG: 1 MATRIZ EXPERIMENTAL H37Rv 12, 24,36,y 48 horas UPCH-LID Bryan Lucero 25/31 (0-200 ug/ml) (0-1000ug/ml)
  27. 27. MIC pH 5.8 Control de la matriz: 1 A Controles para PZA: A Controles para IPTG: 1 MATRIZ EXPERIMENTAL H37Rv UPCH-LID Bryan Lucero 26/31 (0-1000ug/ml) (0-200 ug/ml)
  28. 28. . p<0.05 UPCH-LID Bryan Lucero 27/31 E= x0 + x1*[pza] + x2*[iptg] + x3*[pza]*[iptg]
  29. 29. Pruebas Adicionales RT-qPCR • Genes blanco. • Pirazinamidasa (control). UPCH-LID Bryan Lucero 28/31 Inmunoblot
  30. 30. Resultados esperados • Se espera encontrar niveles óptimos de silenciamiento genético para determinar eficientemente la funcionalidad. • Se espera encontrar expresión diferencial inducida del gen antisentido que promueve una inhibición gradual del gen blanco. • Este estudio espera encontrar diferencias significativas en el eflujo de ácido pirazinoico de las cepas transformadas con la cepa H37Rv wild type. • Demostrar la condición de susceptibilidad de cepas transformadas. • Se plantea hallar el gen específico que codifique a una bomba de eflujo involucrado en el mecanismo de acción de la pirazinamida. UPCH-LID Bryan Lucero 29/31
  31. 31. Limitaciones UPCH-LID Bryan Lucero 30/31 Condición del gen Sesgo en los criterios de selección Familia genética
  32. 32. Gracias por su atención Agradecimientos Laboratorio de Biología Molecular y Bioinformática. UPCH-LID Bryan Lucero 31/31
  33. 33. Otros Proyectos UPCH-LID Bryan Lucero 31/31 @Joebluc BioLuces

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