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IESCH 
Universidad Salazar 
LICENCIATURA EN 
QUÍMICO FARMACÉUTICO BIÓLOGO. 
MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICOLOGÍA 
DRA. JULIA M...
CONTENIDO 
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MISION Y VISION DEL IESCH 
El Instituto de Estudios Superiores de Chiapas, tiene por Misión: 
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MISION Y VISION DE LA LICENCIATURA en Químico Farmacéutico Biólogo. 
Misión: 
“Formar profesionales en Químico Farmacéutic...
PERFIL DEL EGRESADO 
“El egresado de la carrera de químico farmacéutico biólogo deberá poseer los 
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Introducción a la Micología Médica 
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REGLAMENTO DEL LABORATORIO 
GENERALES: 
El presente reglamento tiene como objetivo establecer las normas y 
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· El Material biológico necesario para la realización de las prácticas será 
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· El alumno presentará un examen teórico de la práctica, durante el 
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6. Tome en cuenta las fuentes flamables: equipo eléctrico, mecheros, tuberías 
de gas, fuentes de calor, etc. 
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MANEJO DE EQUIPO Y CRISTALERIA. 
a. Cerciórese que la cristalería este limpia y sin daño al recibirla. 
b. Si va a aplicar...
mantenerse lejos de mecheros encendidos y deben de manejarse en 
campanas de extracción de vapores. 
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PREPARACIÓN DEL ÁREA DE TRABAJO: 
La mesa de trabajo debe ser con cubierta de acero inoxidable, o cualquier material 
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Criterios de Calificación 
Parte practica: 
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Practica No. 1. Toma de muestras clínicas para el diagnostico de micosis 
cutáneas ó superficiales (dermatofitosis). 
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Material 
Cajas Petri de vidrio estéril 
Guantes de látex estériles 
Rollos de cinta transparente adhesiva. 
Tijeras 
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Para la toma de muestra de escamas provenientes de piel, realizar un raspado 
muy cuidadoso de la misma forma que se reali...
3. ¿Cuáles son las características a observar en un examen directo con KOH en 
las preparaciones realizadas a partir de es...
Practica No.2. Primoaislamiento de hongos patógenos de humano a partir de 
muestras biológicas infectadas. 
Objetivo 
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Material 
Guantes de látex estériles 
Rollos de cinta transparente adhesiva. 
Tijeras 
Portaobjetos 
Gotero 
Mechero 
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Sellar con parafil la orilla de la caja Petri de los cultivos puros obtenidos y guardar 
en refrigeración dichas muestras....
Practica No.3. Morfología macroscópica y microscópica colonial de hongos 
filamentosos causantes de micosis. 
Objetivo 
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Material 
Guantes de látex estériles 
Rollos de cinta transparente adhesiva. 
Tijeras 
Portaobjetos y cubreobjetos 
Gotero...
Procedimiento 
Observación macroscópica de hongos 
1. Con el asa recta coger una pequeña cantidad de micelio y depositarlo...
Bibliografía 
Cabañes F. 2001. Identificación de hongos dermatofitos. Revista Iberoamericana 
de Micología. ISBN: 84-607-3...
Practica No. 4. Identificación de hongos dermatofitos patógenos de humano. 
Objetivo 
Identificar las estructuras taxonómi...
Material 
Guantes de látex estériles 
Rollos de cinta transparente adhesiva. 
Tijeras 
Portaobjetos y cubreobjetos 
Gotero...
Procedimiento 
Observación macroscópica de hongos 
1. Con el asa recta coger una pequeña cantidad de micelio y depositarlo...
Cuestionario 
1. ¿Cuál es la utilidad del uso de hidróxido de potasio a 15% en un examen directo 
de uñas o cabellos en la...
Practica No. 5. Métodos de conservación de hongos patógenos. 
Objetivo 
Conocer los principales métodos de conservación em...
Material 
Guantes de látex estériles 
Tijeras 
Mechero 
Mangos de bisturí con hoja. 
Asas micológicas. 
Cajas Petri con Sa...
En un tubo eppendorf con agua destilada estéril (1500 μl) suspender esporas del 
hongo a conservar y guardar en refrigerac...
Practica No.6. Identificación de hongos levaduriformes 
Objetivo 
Conocer el procedimiento micológico empleado en la ident...
Material 
Cubreobjetos y portaobjetos 
Asas bacteriológicas 
Placas de agar Saboraud 
Placas de agar de Malta 
Mechero 
Pi...
Procedimiento 
Observación macroscópica de levaduras 
1. Dividir una placa de agar Saboraud en dos zonas. 
2. Sembrar en e...
Observación microscópica de levaduras 
1. Inocular una placa de agar de malta mediante estrías por agotamiento. 
Tomando u...
Bibliografía 
Aguirre J. 2002. Candidiasis orales. Rev. Iber. Mic. 19: 17-21 
Ballesté R, Salvatella R. 2004. Manual de to...
Practica No.7. Aislamiento del agente causal de mucormicosis (cigomicosis). 
Objetivo 
Aislar e identificar a hongos causa...
Material 
Microscopio compuesto 
Placas con medio de Saboraud 
Pinzas 
Aguja de inocular en forma de “L” 
Lámpara de alcoh...
Cuestionario 
1. Observe ahora la laminilla preparada de Rhizopus y compárela con la que usted 
preparó. Localice e identi...
Practica No. 8. Técnica de microcultivo para la identificación de hongos 
patógenos de humanos. 
Objetivo 
Observación de ...
Material 
Papel filtro (Whatman No.1) 
Pinzas 
Mango de bisturí con hoja 
Placas de Saboraud 
Placa de agar de medio estan...
Procedimiento 
Parte 1. 
1. En una caja Petri colocar un triángulo de vidrio con la ayuda de pinzas. 
2. Sobre el triángul...
d).- Exponer al calor de vapor de agua el portaobjetos y cubreobjetos durante 5 
minutos aproximadamente (hasta que se lib...
ANEXOS 
MEDIOS DE CULTIVO 
Agar dextrososa de Sabouraud (ADS). 
Composición: 
Dextrosa 40.0 
Peptona de Caseína 5.0 
Diger...
Procedimiento: 
Se prepara de igual forma al medio de Agar Dextrosa de Saboraud (ADS), con la 
diferencia que después de e...
Placas de agar malta 
Composición: 
Glucosa 10 gr 
Extracto de malta 3 gr 
Peptona 5 gr 
Agar 20 gr 
Agua destilada 1000 m...
Procedimiento: 
Disolver la harina de maíz en el agua destilada. Dejar reposar a temperatura 
ambiente durante 15 minutos....
PREPARACIÓN DE SOLUCIONES 
Hidróxido de potasio 
Composición 
Hidróxido de potasio 10 gr 
Agua destilada 100 ml 
Procedimi...
Preparación: 
1. Se calienta el agua y se añade el fenol previamente fundido, seguido del Acido 
láctico y de la glicerina...
Procedimiento: 
Disolver el oxalato en el agua destilada. Mezclar una parte de la solución A con 
cuatro partes de la solu...
Puntas para ambas micropipetas (100 piezas) 
Papel toalla (papel absorbente) (2 rollos). 
Desinfectante (Lysol®) (2 frasco...
Anexo de practica No.4. 
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Anexos de la práctica No.6 
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Microcultivo y Cuestionario de Hongos
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Practica de micologia

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Es un manual de practicas de micología, en este se describen algunas técnicas para la identificación de hongos causantes de micosis en los seres humanos, la identificación de hongos levaduriformes y filamentosos.

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Practica de micologia

  1. 1. IESCH Universidad Salazar LICENCIATURA EN QUÍMICO FARMACÉUTICO BIÓLOGO. MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICOLOGÍA DRA. JULIA MANUELA LÁZARO ZERMEÑO TUXTLA GUTIÉRREZ, CHIAPAS, AGOSTO DEL 2014 1
  2. 2. CONTENIDO Misión y Visión Institucional.............................................................................2 Misión y Visión de la Carrera.............................................................................3 Perfil del Egresado.............................................................................................4 Introducción a la Micología Medica..................................................................5 Reglamento del Laboratorio..............................................................................6 Reglas de Seguridad..........................................................................................9 Criterios de Calificación...................................................................................14 Formato de reporte de prácticas........................................……………………14 Practica No. 1. Toma de muestras clínicas para el diagnostico de micosis cutáneas ó superficiales (dermatofitosis)…………………………………………15 Practica No. 2. Primoaislamiento de hongos patógenos de humano a partir de muestras biológicas infectadas………………………………………………………………………………..19 Practica No.3. Morfología macroscópica y microscópica colonial de hongos filamentosos causantes de micosis……………………………….………………..22 Practica No. 4. Identificación de hongos dermatofitos patógenos de humano………………………………………………………………………………….26 Practica No. 5. Métodos de conservación de hongos patógenos……………30 Practica No.6. Identificación de hongos levaduriformes………………………33 Practica No.7. Aislamiento del agente causal de mucormicosis (cigomicosis) ……………………………………………………………………………38 Practica No. 8. Técnica de microcultivo para la identificación de hongos patógenos de humanos……………………………………………………………….41 ANEXOS………………………………………………………………………………45-57 2
  3. 3. MISION Y VISION DEL IESCH El Instituto de Estudios Superiores de Chiapas, tiene por Misión: “Formar al ser humano, fomentando el desarrollo de actitudes, valores, habilidades y conocimientos en pertinencia y vinculados con el entorno económico, social, político y cultural que demanda nuestra región y el país” Y por Visión: “Ser una Institución integrada a los sectores productivos y sociales que conjunten actividades docentes y de investigación con el servicio y mejora de nuestro estado y país, acorde al proceso de globalización actual, fomentando excelencia y calidad” 3
  4. 4. MISION Y VISION DE LA LICENCIATURA en Químico Farmacéutico Biólogo. Misión: “Formar profesionales en Químico Farmacéutico Biólogo con capacidad para la producción de bienes y servicios para la salud y para realizar actividades de intervención, investigación y docencia que respondan a las necesidades individuales y colectivas que demanda nuestra región y país, con una visión integral del ser humano y con alto sentido de responsabilidad y humanismo” Visión: “Ser una licenciatura con alto nivel académico y amplio reconocimiento social, líder en la formación de profesionales químico farmacéutico biólogo; integrada a los sectores productivos y sociales que vincule actividades de docencia, investigación y servicio, acorde al proceso de globalización actual, fomentando la excelencia y la calidad en su quehacer diario” 4
  5. 5. PERFIL DEL EGRESADO “El egresado de la carrera de químico farmacéutico biólogo deberá poseer los conocimientos habilidades y aptitudes para poder colaborar en el equipo de salud realizando funciones específicas en la investigación, desarrollo, preparación y control de fármacos y medicamentos, teniendo la responsabilidad social para fabricar y/o distribuir al público los medicamentos y la información necesaria de los mismos. Desarrollar, supervisar, Investigar y realizar los procedimientos y técnicas analíticas en el área de la salud colaborando en la resolución de problemas de salud relacionados con la prevención, diagnóstico y control de enfermedades de acuerdo con la normatividad del país y las recomendaciones internacionales. Participar en el establecimiento de la normatividad que rige las actividades del área de Salud, colaborar en la verificación, peritaje y supervisión del cumplimiento de las normas. Además de contar con los conocimientos necesarios para incorporarse en estudios de postgrado, todo esto para servir a la sociedad responsablemente contribuyendo así al desarrollo de su entorno regional”. 5
  6. 6. Introducción a la Micología Médica A través del curso, el alumno se percatara de que los hongos tienen una influencia importante en la vida del hombre. Algunos hongos proporcionan al hombre productos alimenticios, algunas enzimas utilizadas en procesos industriales, colorantes, antibióticos, entre otros productos. Sin embargo muy pocos hongos pueden ocasionar enfermedades en animales y seres humanos. En el curso se estudiara la participación de los hongos en la vida del hombre como causantes de enfermedades. La micología médica, como se ha visto, es un área interdisciplinaria que se ocupa de los hongos que causan daño al hombre y que esta patología está relacionada con otras especialidades médicas. Al finalizar este laboratorio el estudiante podrá: conocer la estructura básica de los hongos y su clasificación. Conocer características distintivas de los diferentes filos de hongos de interés en micología medica. Conocer las técnicas de asepsia básica al preparar laminillas de hongos para determinar el diagnostico de micosis. Día a día, el número de infecciones causadas por estos agentes aumenta principalmente los de tipo oportunista; sin embargo, en nuestro país no se cuenta con datos epidemiológicos precisos que indiquen las tasas de morbilidad y mortalidad en las micosis. Lo anterior se debe a diversos factores; entre ellos, no se cuenta con suficiente conocimiento de estos padecimientos, no se hace un diagnóstico diferencial adecuado y por lo tanto, las micosis pasan inadvertidas en un gran número de casos. Estos problemas pueden resolverse si se cuenta con un laboratorio de diagnóstico micológico, en donde labore personal capacitado con conocimientos para desarrollar este tipo de trabajo. Por lo anterior, la parte practica dedicada a la materia de micología medica; se enfocará a que el alumno conozca las técnicas de laboratorio empleadas en la toma de muestras biológicas empleadas en el diagnostico de las micosis, así mismo, el alumno obtendrá los conocimientos y las herramientas necesarias para aislar e identificar el agente fúngico involucrado en diferentes tipos de micosis de importancia medica. 6
  7. 7. REGLAMENTO DEL LABORATORIO GENERALES: El presente reglamento tiene como objetivo establecer las normas y conductas que deben presentar catedráticos, alumnos y laboratoristas en el transcurso de las prácticas de la materia de Bioquímica Inmunológica, para establecer los parámetros de calificaciones asignadas a los alumnos. CAPITULO I DEL LABORATORISTA Artículo 1 · El laboratorista permanecerá en el laboratorio en el horario que le corresponde. · Tendrá listo el material (cristalería, instrumental, reactivos y equipos) para las prácticas dentro del laboratorio, de acuerdo a lo solicitado por el profesor, con tres días de anticipación por lo menos. · Entregará con debida cortesía, el material a los alumnos y a los profesores durante el tiempo estipulado para cada sesión de laboratorio. · El material será entregado durante los primeros 15 minutos. · Recibirá y revisará que el material y el equipo estén en buen estado y en perfectas condiciones de limpieza, · Auxiliará a los profesores en la preparación de soluciones u otros reactivos que se requieran para el desarrollo de la práctica. · Orientará a los estudiantes en el manejo y cuidado del equipo. · Tendrá al día los inventarios físicos, de cristalería, instrumental, reactivos y equipo de laboratorio a su cargo y los entregará a fin de semestre a la Coordinación de la materia. 7
  8. 8. · Mantendrá el equipo en su sitio procurando su correcta utilización y bajo controles de seguridad. · Será el responsable absoluto de que el equipo de laboratorio este en perfecto estado de uso (limpio, funcionando, etc) · Controlará el regreso de material, equipo, etc, en el tiempo estipulado. · En casos estrictamente necesarios, se quedará unos minutos más para facilitar la práctica. · Al final del semestre le entregará a los alumnos un comprobante de No Adeudo de material de Laboratorio. · Esta prohibido comer, beber o fumar dentro del laboratorio. CAPITULO II DE LOS ALUMNOS Artículo 2 · El alumno deberá llegar puntual a la hora correspondiente de la práctica. Se le dará una tolerancia máxima de 10 minutos, transcurrido ese tiempo, no podrá ingresar al laboratorio. · Es indispensable el uso de la bata dentro del laboratorio, no se permite el uso de filipina. · Esta prohibido comer, beber o fumar dentro del laboratorio, cualquier incurrimiento en lo antes mencionado anulará el derecho a realizar la práctica. · Entrando al laboratorio, el alumno deberá entregar los requisitos de la práctica a realizar de lo contrario se anulará dicha práctica. · Se deberá entregar un “Reporte de Práctica” 8 días después de haberla realizado. El contenido del mismo será indicado por el catedrático. · El alumno deberá cumplir con al menos el 80% de asistencias en el laboratorio durante todo el ciclo escolar, para evitar la baja del curso práctico. 8
  9. 9. · El Material biológico necesario para la realización de las prácticas será proporcionado por los alumnos, el incumplimiento de esta disposición anulará el derecho a realizar la práctica. · El alumno deberá solicitar el material de laboratorio con un máximo de 3 días de anticipación, mediante un vale a los laboratorista, de lo contrario perderá el derecho de realizar la práctica. · Cualquier material que resulte dañado durante la realización de la práctica deberá ser repuesto por el alumno a más tardar en 8 días, de lo contrario perderá el derecho de realizar la siguiente práctica y su calificación de ese mes será anulada. · La calificación de laboratorio constituirá el 20% de la calificación global de la materia. · El alumno presentará un examen teórico de la práctica, durante el transcurso de la realización de la misma. · La calificación de cada práctica estará integrada por el reporte, la evaluación teórica de la práctica y el desempeño durante la misma. · La calificación mínima aprobatoria es de 6.0 · Es requisito indispensable aprobar la teoría para validar la calificación del Laboratorio. · Los alumnos que reprueben más del 20% del total de las prácticas, se verán obligados a presentar un Examen teórico-práctico Final del Laboratorio, como requisito indispensable para poder tomar en cuenta el porcentaje correspondiente al Laboratorio para la calificación final de la materia. CAPITULO III DE LOS PROFESORES Artículo 3 · El profesor deberá llegar 10 minutos antes del inicio de la práctica para verificar el orden y funcionamiento del material de laboratorio que se empleará en el desarrollo de la misma. · La calificación de laboratorio constituirá el 20% de la calificación global de la materia. 9
  10. 10. · El alumno presentará un examen teórico de la práctica, durante el transcurso de la realización de la misma. · La calificación de cada práctica estará integrada por el reporte, la evaluación teórica de la práctica y el desempeño durante la misma. · La calificación mínima aprobatoria es de 6.0 · Los alumnos que reprueben más del 20% del total de las prácticas, se verán obligados a presentar un Examen teórico-práctico Final del Laboratorio, como requisito indispensable para poder tomar en cuenta el porcentaje correspondiente al Laboratorio para la calificación final de la materia. · Está prohibido comer, beber o fumar dentro del laboratorio. · Las calificaciones mensuales deberán entregarse al profesor titular a más tardar 5 días antes de la aplicación del examen mensual. · Se deberán entregar al profesor 10 reactivos referentes a lo revisado durante el mes para su inclusión en el examen mensual teórico, a mas tardar 5 días antes de la aplicación de este, · Se deberá proporcionar junto con las calificaciones, la relación de alumnos que adeudan material, así como las inasistencias para su contabilización. MEDIDAS DE SEGURIDAD QUE DEBE TOMAR DURANTE EL DESARROLLO DE LA PRÁCTICA. 1. Leer antes su práctica. En ocasiones se le pedirá traer materiales y si no los trae no podrá efectuar su práctica. 2. Traiga consigo siempre material de limpieza, como franela, detergente y jabón neutro. 3. No coloque mochilas sobre su mesa de trabajo. 4. Tenga consigo siempre su manual de prácticas o diagrama de flujo de la misma. 5. Efectué solo lo que se le señala. Lo demás podría ocasionar riesgos. 10
  11. 11. 6. Tome en cuenta las fuentes flamables: equipo eléctrico, mecheros, tuberías de gas, fuentes de calor, etc. 7. No utilice equipos de comunicación mientras trabaja en el laboratorio. 8. No pruebe ni huela las sustancias químicas a menos que se lo indique su profesor. 9. No se frote los ojos con las manos mientras se este trabajando, si necesita hacerlo use un pañuelo apropiado. 10.Antes de succionar pipetas, lávelas y séquelas para no contaminar los reactivos. 11.Nunca mezcle sustancias químicas a menos que el procedimiento se lo indique. 12.Si la meza de trabajo se ensucia, inmediatamente debe limpiarla con una toalla húmeda para eliminar los residuos de los reactivos. 13.Deseche las sustancias según las instrucciones de su profesor. 14.Cuando ponga a calentar tubos de ensayo, debe hacerlo inclinado este 45° C. en dirección opuesta a sus compañeros y usted. 15.Use pinzas para manejar recipientes calientes. 16.No utilice la boca para pipetear sustancias químicas, use una perilla. 17.En caso de quemaduras, avise al encargado de laboratorio o a su profesor. 18.Siempre deje limpia su mesa de trabajo y lave el material que utilizo con agua y jabón, con un enjuague final con agua destilada. 19.Cuando utilice aparatos especiales, entréguelos limpios. 20. Entregue el material, reactivos y equipos. 21.Al concluir la practica quítese la bata y lávese las manos. 11
  12. 12. MANEJO DE EQUIPO Y CRISTALERIA. a. Cerciórese que la cristalería este limpia y sin daño al recibirla. b. Si va a aplicar calor a la cristalería, revise que sea tipo Pyrex. c. Si usted daño cristalería, debe inmediatamente informarlo al encargado de laboratorio. d. Toda la cristalería se lava con jabón y los tubos de ensayo se colocan en la gradilla boca abajo. e. No utilice termómetros como agitadores. f. Utilice espátulas limpias para recoger los reactivos sólidos. g. Limpie los goteros y las pipetas antes de usarlas para evitar contaminaciones. h. Cuando tenga que utilizar equipos de los cuales desconozca su funcionamiento pregunte al profesor. MANEJO DE REACTIVOS. i. Antes de usar un reactivo químico lea cuidadosamente la etiqueta, este le indica nombre, formula, concentración. Tome lo que necesita y cierre el recipiente. ii. No use ningún reactivo que no posea etiqueta. iii. Mantenga los reactivos en el lugar indicado por su profesor. Los ácidos y base fuertes manténgalos alejados de su mesa de trabajo. iv. Para medir volúmenes de ácidos y bases concentrados, use probetas o buretas. Nunca pipetas. v. Al usar reactivos evite tocarse los ojos o la boca. vi. Mucho de los solventes que se utilizan en laboratorio son flamables, entre ellos están el metanol, la acetona, el éter y el hexano. Por ello deben 12
  13. 13. mantenerse lejos de mecheros encendidos y deben de manejarse en campanas de extracción de vapores. vii. Los ácidos y base fuertes deben de manejarse en campanas de extracción de vapores. viii. Al verter al drenaje ácidos y bases fuertes deje correr mucha agua para diluirlos. ix. No vacié al drenaje material insoluble como grasas, ceras, vidrios, etc. x. Si se derramara cualquier reactivo sobre su piel u ojos, avise de inmediato a su profesor. xi. No introduzca pipetas, goteros o cualquier otro objeto en los reactivos, salvo los que este utilizando para evitar contaminación. xii. No mezcle el contenido de varios tubos a menos que lo indique el procedimiento, puede causar explosiones, calentamiento o vapores tóxicos. xiii. Vierta la solución concentrada en la menos concentrada para evitar reacciones violentas. xiv. Si se produjera derrame de sustancias volátiles, apague mecheros y equipo y limpie el área. xv. Lee las etiquetas de los reactivos para ver si es toxico, inflamable, irritante o corrosivo. Riesgo biológico 13
  14. 14. PREPARACIÓN DEL ÁREA DE TRABAJO: La mesa de trabajo debe ser con cubierta de acero inoxidable, o cualquier material plástico resistente al calor, humedad y corrosión, la cual debe mantenerse limpia y en buen estado de conservación. Contar con suficiente iluminación, natural o artificial, sin reflejos molestos sobre el analista. Sin objetos sobre de ella que vayan de ninguna manera intervengan en el trabajo. Distribuir los materiales dentro del área de trabajo en tal forma que el movimiento del material se realice de izquierda a derecha y siempre dentro del espacio suficiente para realizar las maniobras con fluidez. Al concluir la última actividad en la mesa de trabajo, proceder a su limpieza. El analista estará provisto de bata manga larga, limpia y en buen estado. Bajo ninguna circunstancia fumar, masticar o hablar en tanto se realiza el trabajo. 14
  15. 15. Criterios de Calificación Parte practica: Se evaluara la asistencia a la práctica (es necesario asistir para poder reportar). Diagrama de flujo Reporte de práctica Formato de reporte de practica El reporte de la práctica se realizará en forma de artículo científico eligiendo como modelo alguna revista de micología y debe de contener lo siguiente: Titulo Resumen Introducción Material y métodos Discusión Conclusión Bibliografía Cuestionario. 15
  16. 16. Practica No. 1. Toma de muestras clínicas para el diagnostico de micosis cutáneas ó superficiales (dermatofitosis). Objetivo Conocer y realizar las diferentes técnicas de la toma de muestras para el diagnóstico micológico en pacientes con infecciones causadas por dermatofitos. Introducción Para determinar el agente causal de las infecciones causadas por hongos es necesario realizar estudios de laboratorio que orienten la búsqueda y aislamiento del hongo implicado. Para ello se requiere de la toma de muestra clínica. La confiabilidad de los resultados que se obtienen, a partir de los procedimientos de laboratorio para el diagnóstico micológico, dependerá en gran parte de la toma adecuada de la muestra biológica. La muestra biológica debe ser abundante y la técnica de toma, se elegirá de acuerdo con el tipo de micosis por investigar. Los dermatofitos son un grupo de hongos queratinofílicos, pero su presencia en la piel y anexos (uñas, pelo) no siempre implica enfermedad. Son organismos microscópicos adaptados a la vida parasitaria, de distribución mundial, según su adaptación pueden ser geófilicos, zoófilicos y antropófilicos Los dermatófitos constituyen un conjunto de hongos filamentosos superiores con actividad queratinolítica y capacidad para parasitar la piel y las faneras de los animales y el hombre. Son patógenos primarios. Pertenecen a tres géneros: Epidermophyton (E. floccosum), Microsporum (M. canis, M. gypseum y otras) y Trichophyton (T. mentagrophytes, T. interdigitale, T. rubrum). 16
  17. 17. Material Cajas Petri de vidrio estéril Guantes de látex estériles Rollos de cinta transparente adhesiva. Tijeras Portaobjetos Gotero Mechero Cuadritos (8X8 cm) de Papel filtro estériles Mangos de bisturí con hoja. Asas micológicas. Cuadros de alfombra “moqueta” estéril de 5 cm por lado. Cajas Petri con Saboraud simple Cajas Petri con Saboraud más antibiótico (mycosel). Papel toalla (papel absorbente) Desinfectante (Lysol®) Reactivos Frascos con hidróxido de potasio (KOH) a 15%. Equipo Microscopio óptico Procedimiento Para la toma de muestra del material biológico en uñas, realizar un raspado muy del área afectada con ayuda de un bisturí, el cual, previamente ha sido pasado a la flama y dejado enfriar cerca de la flama. La toma de material se realizará colocando la punta del bisturí por debajo de la lámina ungueal y raspando firmemente; tratando de llegar al límite entre la zona sana y la afectada visualizado clínicamente. Las escamas obtenidas colocarlas en cajas Petri de vidrio estéril. 17
  18. 18. Para la toma de muestra de escamas provenientes de piel, realizar un raspado muy cuidadoso de la misma forma que se realizo el anterior. También, en este caso tomar escamas por medio de la técnica de la cinta adhesiva y pegar la cinta sobre el portaobjeto. Para la toma de muestra de escamas provenientes de piel cabelluda, es necesario frotar intensamente el área afectada con la “moqueta”, dejando caer las escamas en caja Petri de vidrio estéril. Envolver la caja Petri con papel estraza y etiquetar (fecha y lugar, sexo, edad y zona corporal que procede la muestra). Realizar prueba de KOH: en un portaobjeto colocar una gota de KOH al 15% y sobre está colocar las escamas. Colocar el cubreobjetos y pasar la preparación por la flama del mechero 3 veces. Dejar reposar por 5-10 minutos. Observar al microscopio con los objetivos de 10X y 40X las preparaciones; buscando las estructuras fúngicas que caracterizan una muestra positiva al examen directo con KOH. Inocular las muestras positivas en placas con Saboraud simple y en placas con Saboraud más antibiótico (Mycosel). Incubar a temperatura ambiente durante 5-15 días. Observar consecutivamente la aparición de colonias y transferir cada una de ellas a placas nuevas con Saboraud simple o Mycosel, dependiendo de la procedencia de la colonia. Cuestionario 1. Describir otra técnica empleada en la toma de muestra clínicas procedentes de micosis. 2. ¿Cuál es la importancia de realizar una buena toma del material biológico para el diagnostico de micosis? 18
  19. 19. 3. ¿Cuáles son las características a observar en un examen directo con KOH en las preparaciones realizadas a partir de escamas de piel y sus anexos? 4. Postula una nueva técnica útil para la toma de material biológico procedente de micosis superficiales o sistémicas. También puedes modificar las ya existentes y explicar en qué consiste dicha modificación. En ambos casos explica los beneficios y perjuicios de dicha técnica. Bibliografía Arenas R. 2002. Dermatofitosis en México. Rev. Iberoamericana Micológica. 19: 63-67. Arano M. y Castañeda E. 2003. Micosis humanas. Procedimientos diagnósticos. Exámenes directos. 2ª edición. Instituto Nacional de Salud. Colombia. Kane J., Summerbell R., Singler L., Krajden S. y Land G. 1997. Laboratory Handbook of Dermatophytes. A clinical Guide and Laboratory of Dermatophytes and other filamentos fungi from. Publishing company. Koneman EW y Roberts GD. 1992. Micología practica de laboratorio. 3a edición. Editorial Médica Panamericana. Argentina. López-Martínez R., Méndez-Tovar L., Hernández- Hernández F., Castañón- Olivares R. 2004. Micología Médica. Procedimientos para el diagnostico de laboratorio. 2ª edición. Trillas. México. 19
  20. 20. Practica No.2. Primoaislamiento de hongos patógenos de humano a partir de muestras biológicas infectadas. Objetivo Obtener cultivos puros de agentes infecciosos causantes de micosis de importancia medica. Introducción Para el diagnóstico de laboratorio se realizan examen directo o frotis y cultivo a partir de la muestra biológica. Los hongos crecen bien en medios artificiales y tienen requerimientos nutritivos simples, una fuente de carbono orgánico, generalmente en azúcar, y de nitrógeno suelen ser los elementos suficientes para obtener un buen crecimiento. Junto a ellos, un soporte sólido, el agar, permite a los hongos filamentosos el desarrollo del micelio aéreo, donde se localizan las estructuras reproductoras y el desarrollo de colonias en el caso de las levaduras. El medio de cultivo más utilizado para los hongos es el medio de Saboraud, que reúne estas características y un pH de 5.6, que dificulta el crecimiento bacteriano. La adición al medio de antibióticos como el cloranfenicol o la gentamicina, que inhiben el crecimiento de las bacterias contaminantes, o antifúngicos especiales (como la actidiona o cicloheiximida) que inhiben el crecimiento de muchos hongos no patógenos, transforman al medio de Saboraud en un medio más selectivo. Los medios de cultivo después de sembrados, se incuban en condiciones aerobias y la temperatura óptima suele ser 25-30 ºC para los agentes de micosis superficiales y los oportunistas y de 35-37ºC para los que producen infecciones profundas. Los hongos levaduriformes dan lugar en 24-48 horas a colonias de aspecto y morfología similar a las bacterianas. El desarrollo de las colonias de los hongos filamentosos es mucho más variable; algunos crecen muy lentamente, pero sus colonias son muy características y en general se diferencian fácilmente de las levaduras. 20
  21. 21. Material Guantes de látex estériles Rollos de cinta transparente adhesiva. Tijeras Portaobjetos Gotero Mechero Mangos de bisturí con hoja. Asas micológicas. Cajas Petri con Saboraud simple Cajas Petri con Mycosel. Parafil Papel toalla (papel absorbente) Desinfectante (Lysol®) Reactivos Frascos con hidróxido de potasio (KOH) a 15%. Equipo Microscopio óptico Procedimiento Inocular en medio de Saboraud las muestras biológicas positivas al examen directo con KOH al 15%. Incubar a temperatura ambiente durante 5-15 días hasta observar el crecimiento de colonias fúngicas. Trasferir cada una de las colonias obtenidas en una nueva placa con medio de Saboraud y otra placa con Saboraud adicionada con cicloheximida. Incubar durante 1-8 días, hasta observar una colonia de crecimiento definido. 21
  22. 22. Sellar con parafil la orilla de la caja Petri de los cultivos puros obtenidos y guardar en refrigeración dichas muestras. Cuestionario 1. ¿Qué es un cultivo puro? 2. ¿Cuál es la finalidad de contar con un cultivo puro en un laboratorio de micología médica? 3. ¿En que difieren los cultivos de hongos filamentosos al de hongos levaduriformes? 4. ¿Porque el primoaislamiento de hongos patógenos de humano en medios de cultivo en Saboraud se realiza en placas con y sin antibiótico? Bibliografía Arango M. y Castañeda E. 2003. Micosis humanas. Procedimientos diagnósticos. Exámenes directos. 2ª edición. Instituto Nacional de Salud. Colombia. Cabañes J. 2001. Identificación de hongos dermatofitos. Revista Iberoamericana de Micología. ISBN: 84-607-3050-6. López-Martínez R., Méndez-Tovar L., Hernández- Hernández F., Castañón- Olivares R. 2004. Micología Médica. Procedimientos para el diagnostico de laboratorio. 2ª edición. Trillas. México. Koneman E. y Roberts G. 1992. Micología practica de laboratorio. 3a edición. Editorial Médica Panamericana. Argentina. 22
  23. 23. Practica No.3. Morfología macroscópica y microscópica colonial de hongos filamentosos causantes de micosis. Objetivo Analizar y observar la morfología fúngica a nivel macroscópica y microscópica para identificar a nivel de genero el agente etiológico de micosis causadas por hongos filamentosos. Introducción La identificación rutinaria de hongos patógenos en el laboratorio de micología se basa fundamentalmente en criterios morfológicos, macroscópicos y microscópicos. Por ello, el diagnóstico de micosis incluye la identificación del agente causal, mediante el uso de medios de cultivo. A partir del cultivo se observa y analiza las características de la colonia, lo que permite orientar el procedimiento de laboratorio para la identificación del hongo. Debe de reconocerse si el hongo aislado es una levadura u hongo filamentoso (hialino o dermatiaceo). Los hongos filamentosos se identifican a nivel de género especie por la morfología del micelio, pero sobre todo por las características microscópicas de sus esporas asexuadas y los elementos que las originan. Para conseguir la producción de esporas a veces se requieren medios de cultivo especiales que facilitan la esporulación. Las estructuras reproductoras asexuadas (conidioforos) son muy frágiles y para poder observarlas al microscopio sin distorsionarlas o destruirlas se emplean técnicas especiales (microcultivo). Los hongos no esporulados (micelio estéril) son difícilmente identificables. 23
  24. 24. Material Guantes de látex estériles Rollos de cinta transparente adhesiva. Tijeras Portaobjetos y cubreobjetos Gotero Mechero Mangos de bisturí con hoja. Asas micológicas. Cajas Petri con Saboraud simple Cajas Petri con Mycosel. Parafil Lupa Papel toalla (papel absorbente) Desinfectante (Lysol®) Reactivos Frascos con hidróxido de potasio (KOH) a 15%. Frascos con azul de lactofenol. Equipo Microscopio óptico 24
  25. 25. Procedimiento Observación macroscópica de hongos 1. Con el asa recta coger una pequeña cantidad de micelio y depositarlo, sin extender la muestra, sobre la superficie del medio de cultivo de Saboraud. Repetir la operación con cada uno de los distintos tipos de colonias fúngicas que se analicen. Incubar las placas entre 5-7 días a 20-25 ºC. 2. Con la lupa observar y anotar las siguientes características: a. tipos de colonias fúngicas; b. grado de crecimiento; c. aspecto de las colonias: forma, textura superficial y color; d. formación y tipo de exudado; e. producción de pigmentos y f. olor. Observación microscópica de hongos. 1. Partiendo de una colonia de hongos de un cultivo puro y utilizando un asa de micología ó bien un asa de picadura, colocar en la punta un pedazo de cinta adhesiva y con mucho cuidado colocarla sobre la colonia. 2. El fragmento de cinta, con mucho cuidado colocarlo sobre un portaobjetos, el cual previamente se ha colocado una gota de azul de lactofenol. 3. Colocar un cubre y absorber con papel de filtro el exceso de colorante. 4. Observar al microscopio con objetivo de inmersión. Cuestionario 1. ¿Cuál es la función del azul de lactofenol en la preparación? 2. ¿Cuáles son las características taxonómicas macroscópicas y microscópicas para identificar en los hongos filamentosos? 3. Menciona y describe otras técnicas empleadas en la identificación de hongos patógenos de humano diferente a la taxonómica. 25
  26. 26. Bibliografía Cabañes F. 2001. Identificación de hongos dermatofitos. Revista Iberoamericana de Micología. ISBN: 84-607-3050-6. Fernández R., Segundo C., Arenas R., Silva D. y Guzmán A. 2002. Determinación de las variedades de Trichophyton mentagrophytes en10 casos de dermatofitosis de Paraguay. Bioquímica 27: 41-45. Ballesté R., Fernández N., Mousqués N., Xavier B., Arteta Z., Mernes M. y Gezuele E. 2000. Dermatofitosis en población asistida en el Instituto de Higiene. Revista Medica Uruguay 16: 232-242. 26
  27. 27. Practica No. 4. Identificación de hongos dermatofitos patógenos de humano. Objetivo Identificar las estructuras taxonómicas claves en la identificación de hongos causantes de micosis superficiales Introducción Las lesiones epidérmicas causadas por dermatofitos son eritematosas, vesiculares o hiperqueratósicas, más o menos inflamatorias dependiendo del paciente. Los cabellos y las uñas cuando se afectan son frágiles por lo que se fragmentan con facilidad. Estas lesiones, son el resultado conjunto de la invasión del estrato córneo por el hongo, la liberación de sus productos metabólicos, algunos con propiedades antigénicas y enzimáticas (queratinasas, colagenasas, elastasas), así como de la respuesta inflamatoria del hospedero, expresada en la epidermis y la dermis. El mecanismo de infección es por contacto directo con el agente infeccioso, aunque se requiere de ciertas condiciones que favorezcan su desarrollo, como la humedad, el calor y la maceración local. La intensidad de la enfermedad depende de la cepa o las especies de dermatofito y de la sensibilidad del huésped al hongo en particular, así como la idiosincrasia de cada huésped. Cuando una o más esporas se depositan en la capa cornea, penetran en ella, desarrollando filamentos hialinos y septados. En general los artroconidias del hongo germinan y dan lugar a la formación de hifas y las lesiones se inician como una ámpula eritematosa. Los hongos causantes de dermatofitosis pertenecen a tres géneros: Epidermophyton (E. floccosum), Microsporum (M. canis, M. gypseum y otras) y Trichophyton (T. mentagrophytes, T. interdigitale, T. rubrum). 27
  28. 28. Material Guantes de látex estériles Rollos de cinta transparente adhesiva. Tijeras Portaobjetos y cubreobjetos Gotero Mechero Mangos de bisturí con hoja. Asas micológicas. Cajas Petri con Saboraud simple Cajas Petri con Mycosel Lupa Papel toalla (papel absorbente) Desinfectante (Lysol®) Reactivos Frascos con hidróxido de potasio (KOH) a 15%. Frascos con azul de lactofenol. Equipo Microscopio óptico 28
  29. 29. Procedimiento Observación macroscópica de hongos 1. Con el asa recta coger una pequeña cantidad de micelio y depositarlo, sin extender la muestra, sobre la superficie del medio de cultivo de Saboraud. Repetir la operación con cada uno de los distintos tipos de colonias fúngicas que se analicen. Incubar las placas entre 5-7 días a 20-25 ºC. 2. Con la lupa observar y anotar las siguientes características: a. tipos de colonias fúngicas; b. grado de crecimiento; c. aspecto de las colonias: forma, textura, borde de la colonia, superficial y color; d. formación y tipo de exudado; e. producción de pigmentos. Observación microscópica de hongos mediante técnica de cinta adhesiva 1. Se corta una tira de 4-5 cm de cinta adhesiva transparente tomándola únicamente por los extremos. 2. Cerca del mechero se abre la caja y se presionar cuidadosamente la cinta transparente sobre la periferia de la colonia. 3. Colocar la cinta con la muestra adherida sobre una gota de azul de lactofenol, previamente colocado en el centro del portaobjetos. La cinta funcionará como cubreobjetos por lo que se deberá aplanar cuidadosamente, evitando la formación de burbujas y sin alterar demasiado las estructuras. 4. Dejar reposar durante 3-5 minutos y hacer observaciones en el microscopio con los objetivos 10X y 40X. Localizar en las preparaciones hifas, estructuras especiales como conidióforos, esporangióforos, esporangiolos, rizoides, etc., que ayuden a la identificación taxonómica. 29
  30. 30. Cuestionario 1. ¿Cuál es la utilidad del uso de hidróxido de potasio a 15% en un examen directo de uñas o cabellos en la búsqueda de dermatofitos?: 2. Describe las colonias obtenidas en las placas y menciona si consideras que se trata de hongos dermatofitos y porque. 3. Describe las lesiones humanas originadas por dermatofitos en el cuerpo humano. 4. ¿Cuáles son las características taxonómicas macroscópicas y microscópicas para identificar los géneros Epidermophyton, Microsporum y Trichophyton?. Bibliografía Arenas R. 2002. Dermatofitosis en México. Rev. Iberoamericana Micológica. 19: 63-67. Arano M. y Castañeda E. 2003. Micosis humanas. Procedimientos diagnósticos. Exámenes directos. 2ª edición. Instituto Nacional de Salud. Colombia. Cabañes F. 2001. Identificación de hongos dermatofitos. Asociación Española de Micología. Pfizer. Revista Iberoamericana de Micología. 84:607-610. Rubio M., Rezusta A., Gil J. y Ruesca B. 1999. Perspectiva micológica de los dermatofitos en el ser humano. Revista Iberoamericana Micología16: 16-22. 30
  31. 31. Practica No. 5. Métodos de conservación de hongos patógenos. Objetivo Conocer los principales métodos de conservación empleado en las cepas de hongos filamentosos. Introducción La conservación de organismos es una estrategia principal para la preservación de la especies. Para evitar la degeneración y el envejecimiento de las cepas es necesario preservarlas adecuadamente y retardar, hasta donde sea posible, los cambios degenerativos normales que ocurren en las células. La declinación de las características deseables de una cepa, se han atribuido a diferentes factores que actúan en el almacenamiento de la misma, tales como: carencia o agotamiento de los nutrientes en el medio de cultivo; acumulación de secreciones tóxicas propias del metabolismo del hongo; alteración del pH en el medio (acidez o alcalinidad); disminución en la concentración de oxigeno y la consecuente acumulación de C02. Entre los diversos procedimientos de conservación utilizados para hongos, se destacan como favoritos el cultivo periódico en cuñas en agar, bajo aceite mineral, conservación de esporas en tierra, arena o silica gel, cepas liofilizadas, congelación en nitrógeno liquido y en agua destilada. Se pueden resumir estos métodos agrupándolos en tres apartados, que son: Métodos de elección o de conservación a largo plazo, mediano plazo y otros métodos. La elección de los métodos tiene en cuenta varios factores, según sea el objetivo de la colección así como la disposición de recursos destinados para tal finalidad. 31
  32. 32. Material Guantes de látex estériles Tijeras Mechero Mangos de bisturí con hoja. Asas micológicas. Cajas Petri con Saboraud simple Cajas Petri con Saboraud más antibiótico. Parafil Micropipetas de 100 y 1000 microlitros Puntas para ambas micropipetas Gradilla para tubos eppendorf Tubos eppendorf Papel toalla (papel absorbente) Desinfectante (Lysol®) Agua destilada estéril Reactivos Glicerol al 10% Procedimiento Las cepas de hongos filamentosos cultivadas en placas de medio sólido destinadas a la conservación se procederá de la forma siguiente: cortar una porción de la colonia en cuadritos de 1mm x 1mm aproximadamente. Los cuadritos de micelio colocarlos en glicerol (10%) y guardados a -80 °C en un ultracongelador. También se almacenó a -20°C una copia de las cepas anteriores en tubos con medio solido. Repetir este procedimiento para la conservación de hongos levaduriformes. 32
  33. 33. En un tubo eppendorf con agua destilada estéril (1500 μl) suspender esporas del hongo a conservar y guardar en refrigeración. Cuestionario 1. ¿Cuál es la importancia de la preservación de cepas fúngicas en el laboratorio de micología medica? 2. Menciona y explica otros métodos de conservación utilizados en la preservación de cepas de hongos patógenos. 3. ¿Cuáles son las ventajas y desventajas de la preservación de cepas de hongos en aceite, como glicerol? Bibliografía Kane J., Summerbell R., Singler L., Krajden S. y Land G. 1997. Laboratory Handbook of Dermatophytes. A clinical Guide and Laboratory of Dermatophytes and other filamentos fungi from. Publishing company. Koneman EW y Roberts GD. 1992. Micología practica de laboratorio. 3a edición. Editorial Médica Panamericana. Argentina. López-Martínez R., Méndez-Tovar L., Hernández- Hernández F., Castañón- Olivares R. 2004. Micología Médica. Procedimientos para el diagnostico de laboratorio. 2ª edición. Trillas. México. 33
  34. 34. Practica No.6. Identificación de hongos levaduriformes Objetivo Conocer el procedimiento micológico empleado en la identificación de hongos levaduriformes. Introducción Entre los hongos levaduriformes los géneros más importantes en patología son Candida y Cryptooococcus, ambos de distribución universal. Las infecciones por cándida son, junto con las causadas por los dermatófitos, las infecciones fúngicas más frecuentes. Candida es un hongo dimórfico comensal del cuerpo humano y reside en las mucosas, tubo digestivo, aparato respiratorio alto y piel del hombre y otros animales vertebrados, así como en detritus y alimentos. Sin embargo, pueden producir infecciones por un factor predisponente local o general, por lo que puede considerarse sin error grave a Candida como un género oportunista. En tejido parasitado por este hongo se observan levaduras con seudomicelio y micelio verdadero. El género Candida está formado por diversas especies (C. albicans, C. tropicalis, C. krusei, C. parapsilosis, C. guilliermondii y otras). Presentan una forma ligeramente ovalada y un tamaño de 2 a 4 μm por 3 a 7μm 5. Las especies de Candida crecen bien en medios bacteriológicos usuales y en el medio de Sabouraud. Entre las 48-72 horas dan lugar a colonias macrocópicamente visibles. Los hongos levaduriformes se identifican mediante pruebas metabólicas, de modo semejante a las bacterias. La identificación de las levaduras se realiza con el estudio macro y micromorfológico de las colonias y para establecer el diagnóstico de especie se requieren otras pruebas morfológicas adicionales (clamidosporos y tubos germinales) y pruebas bioquímicas (asimilación de hidratos de carbono, degradación de la urea, asimilación de inositol, entre otras). 34
  35. 35. Material Cubreobjetos y portaobjetos Asas bacteriológicas Placas de agar Saboraud Placas de agar de Malta Mechero Pinzas estériles Papel toalla (papel absorbente) Desinfectante (Lysol®) Material Biológico Cultivo de levaduras Reactivos Lugol Cristal violeta Safranina Equipo Microscopio óptico 35
  36. 36. Procedimiento Observación macroscópica de levaduras 1. Dividir una placa de agar Saboraud en dos zonas. 2. Sembrar en estría por agotamiento, cultivos frescos de levaduras. Lectura de resultados en el microscopio. Utilizar el objetivo que resulte más adecuado partiendo siempre del de menor aumento. 4. Realizar una tinción Gram para cada levadura (Gram positiva): Tinción de Gram 1. Cubrir el frotis con 2 gotas de cristal violeta durante 30 segundos a 1 minuto 2. Lavar cuidadosamente el frotis con agua de la llave o destilada para eliminar el exceso de colorante. 3. Sacudir un poco y sin dejar secar cubrir el portaobjeto con 2 gotas de lugol por 30 segundos. 4. Lavar cuidadosamente el frotis con agua. 5. Inclinar el portaobjetos y aplica gota a gota el decolorante dejando que escurra hasta que no fluya más la tintura. Inmediatamente lavar con agua. 6. Aplicar 2 gotas de safranina durante 30 segundos. 7. Lavar nuevamente con agua, eliminar cuidadosamente el exceso con una toalla de papel y dejar secar al aire. 36
  37. 37. Observación microscópica de levaduras 1. Inocular una placa de agar de malta mediante estrías por agotamiento. Tomando una pequeña parte de una colonia aislada de la levadura se realizan estrías en tres zonas de la placa, sin retomar nuevo inoculo entre una y otra; de este modo habremos dispuesto un inoculo decreciente máximo en la zona 1 y más escaso en la zona 3. Es importante, con vistas a la colocación de la placa en el microscopio para su observación, que el inoculo quede separado aproximadamente 15 mm del borde de la placa. 2. Colocar un cubreobjetos estéril las zonas inoculadas. Si los cubreobjetos se esterilizan a la llama, asegurarse de que estén totalmente fríos antes de su colocación. 3. Incubar a temperatura ambiente y en la oscuridad (o bien a 28-30 ºC en estufa de cultivos durante 48 h). Reincubar 24 h. más si fuese necesario. 4. Observación microscópica: micelio, blastosporas. a. Situar la placa sin tapa sobre la platina del microscopio. b. Realizar la observación con objetivo 10X. Realizar el enfoque y posteriores manipulaciones con mucha precaución, evitando tocar el cubreobjetos o los bordes de la placa con el objetivo. Desplazar la placa manualmente para recorrer otras zonas. Cuestionario 1. ¿Qué muestras biológicas se deben tomar para confirmar el diagnóstico de candidosis cutánea?: 2. ¿Qué exámenes de laboratorio solicitaría para confirmar el diagnóstico de candidosis diseminada o sistémica?: 3. Anote tres pruebas de laboratorio que sirvan para determinar las especies de Candida: 4. ¿Cuál es la diferencia entre micelio y pseudomicelio? 37
  38. 38. Bibliografía Aguirre J. 2002. Candidiasis orales. Rev. Iber. Mic. 19: 17-21 Ballesté R, Salvatella R. 2004. Manual de toma de muestra para estudio bacteriológico, parasitológico y micológico. Selección, recolección, conservación y transporte. Montevideo: Departamento de Laboratorio Clínico. Hospital de Clínicas. Facultad de Medicina. Mendoza M. 2005. Importancia de la identificación de levaduras. Rev. Soc. Ven. Microbiol. 25: ISSN 1315-2556. 38
  39. 39. Practica No.7. Aislamiento del agente causal de mucormicosis (cigomicosis). Objetivo Aislar e identificar a hongos causantes de mucormicosis a partir de sustratos orgánicos colonizados usualmente por estos hongos. Introducción La cigomicosis se caracteriza por un cuadro agudo rinocerebral o pulmonar que se asocia con invasión vascular, trombosis e infartos. Ocurre principalmente en pacientes diabéticos descompensados y en individuos inmunocomprometidos, como aquellos con trasplante de órganos. Es una enfermedad causada por hongos oportunistas de la clase Zygomycetes, orden Mucorales de los géneros Mucor, Rhizopus, Rhizomucor y Absidia. El diagnóstico de laboratorio se hace con el examen directo y/o estudio histopatológico donde se observan hifas cenocíticas. Los hongos involucrados en esta enfermedad crecen rápidamente (48-72 horas) en el medio Saboraud dando lugar a colonias características. Su identificación como zigomicetos es relativamente fácil, por su micelio ancho no tabicado y presencia de esporas asexuadas internas; pero su adscripción precisa a un género y aun más a una especie es en ocasiones muy difícil. Las muestras biológicas útiles son: secreción nasal, bucal, ocular, expectoración, lavado bronquial y fragmentos de tejido. 39
  40. 40. Material Microscopio compuesto Placas con medio de Saboraud Pinzas Aguja de inocular en forma de “L” Lámpara de alcohol Portaobjetos y cubreobjetos Botellas de azul lactofenol Papel toalla (papel absorbente) Desinfectante (Lysol®) Asa bacteriológica Procedimiento Traer pan y fruta en procesos de colonización por hongos (dejar 8-10 en proceso de descomposición). Realizar una preparación con azul de lactofenol mediante la técnica de cinta adhesiva, en las regiones de micelio oscuro que ha invadido el pan. Observe primero bajo el microscopio. Al mismo tiempo tomar un fragmento de micelio de la región donde se realizo la preparación anterior, e inocular en placas con agar de Saboraud. Incubar a temperatura ambiente hasta observar la presencia de colonias. Etiquetar. Las preparaciones con caracteres taxonómicos correspondientes a Rhizopus, analizar la morfología colonial en el cultivo y describirla. 40
  41. 41. Cuestionario 1. Observe ahora la laminilla preparada de Rhizopus y compárela con la que usted preparó. Localice e identifique de nuevo las hifas, el micelio y los esporangios. 2. Observe también la laminilla preparada de conjugación de Rhizopus y trate de encontrar diferentes etapas de formación de una cigoespora. 3. ¿Cómo se forma una cigoespora?. ¿Estás esporas son de reproducción sexual o asexual Bibliografía Torres T., Araiza J., Sánchez V. y Arellano A.2007. Mucormicosis por Rhizopus azygosporus en paciente con diabetes mellitus tipo 2 y bocio tóxico difuso. Reporte de 1 caso. Revista de Endocrinología y Nutrición. 15:109-114. Carrada T. 2007. Mucormicosis rinorbital: relación clínico-radiológica, histopatología y tratamiento. Med Int Mex. 23:256-60. Torres-Narbona M., Guinea J. Muñoz P. y Bouza E. 2007. Zigomicetos y zigomicosis en la era de las nuevas terapias antifúngicas. Rev Esp Quimioterap, 20: 375-386. 41
  42. 42. Practica No. 8. Técnica de microcultivo para la identificación de hongos patógenos de humanos. Objetivo Observación de estructuras fúngicas de valor taxonómico necesarias para la identificación de hongos patógenos mediante la creación de laminillas. Introducción La técnica de microcultivo es un buen método que permite la identificación de hongos de importancia médica; mediante la observación de estructuras características presentes en las diferentes cepas fúngicas. Cuando el crecimiento ya está presente en el medio de cultivo primario, los fragmentos miceliales son transferidos a un microcultivo. El microcultivo permite observar al hongo mientras se está desarrollando, promueve la esporulación y nos permite observar al microscopio estructuras reproductoras asexuales (conidióforos) que son muy frágiles sin distorsionarlas ni destruirlas. Se recomiendan dos medios para el microcultivo: harina de maíz con 1% de glucosa, a fin de estimular la producción de pigmento de T. rubrum, y agar dextrosa de Saboraud (ADS) para poder ver la morfología normal de la disposición de los conidios y de los apéndices micélicos. El microcultivo de hongos filamentosos se realiza al inocular el hongo sobre los bordes de un cuadrito pequeño de agar. Luego se cubre con un cubreobjeto y se incuba dentro de una cámara húmeda a 25 ºC. La incubación dependerá del tiempo que demore el hongo en presentar sus estructuras reproductivas. Para realizar el microcultivo de hongos levaduriformes; la levadura es sembrada en estrías paralelas sobre agar maíz e incubado en cámara húmeda a 25 ºC, por lo general entre 2 a 3 días. Cada especie presenta características micromorfológicas particulares que permiten orientar y confirmar el diagnóstico a nivel de especie. Entretanto, no se debe emplear como única técnica de diagnóstico, generalmente se realiza en paralelo con las pruebas bioquímicas. 42
  43. 43. Material Papel filtro (Whatman No.1) Pinzas Mango de bisturí con hoja Placas de Saboraud Placa de agar de medio estandar (PDA) Mechero Barniz transparente de uñas Caja Petri de vidrio estéril Triangula de vidrio Asa bacteriológica Portaobjetos y cubreobjetos Matraz Erlenmeyer de 1000 ml Papel absorbente Pipetas Pasteur con bulbo de hule Reactivos Azul de lactofenol Glicerol al 10% Solución de lactofenol sin colorante Equipo Microscopio óptico 43
  44. 44. Procedimiento Parte 1. 1. En una caja Petri colocar un triángulo de vidrio con la ayuda de pinzas. 2. Sobre el triángulo colocar un portaobjetos 3. Sobre el portaobjetos, colocar un bloquecito de agar de medio estandar (PDA), previamente preparado, de 1 X 1 cm. 4. De cada cepa, sembrar por piquete en las cuatro caras iguales del bloquecito de agar. 5. Una vez inoculado, colocar un cubreobjetos sobre éste 6. Adicionar 10 ml de Glicerol al 10% a la base de la caja Petri, teniendo cuidado de no tocar el portaobjetos. 7. Tapar la caja e incubar a la temperatura y tiempo necesarios para su crecimiento Parte 2. Preparación de la muestra 1 .A partir de los microcultivo previamente obtenidos, se quita el cubreobjetos con unas pinzas y se lleva a tinción. 2.- Se desecha el bloquecito de agar y el portaobjetos usado se lleva también a tinción. Nota: Cuidando de no maltratar el crecimiento miceliar. Tinción de la muestra a).- Calentar 500 ml de agua destilada a ebullición en un matraz Erlenmeyer de 1000 ml para producir el vapor que fijará la tinción. b).- Colocar un papel filtro (Whatman No.1) sobre el micelio el cual deberá cubrir el área de crecimiento, tanto en el portaobjetos como en el cubreobjetos. c).- Adicionar solución de azul de lactofenol por goteo sobre el papel hasta sólo humedecer. 44
  45. 45. d).- Exponer al calor de vapor de agua el portaobjetos y cubreobjetos durante 5 minutos aproximadamente (hasta que se liberen los primeros vapores de color). e),- Se procede a hacer lavados con solución de lactofenol sin colorante, ésto con el objeto de desaparecer el exceso de colorante, el lavado se llevará a cabo hasta el momento en que no escurra colorante de la muestra. 9.- Cubrir la muestra teñida con un cubreobjetos o portaobjetos según sea el caso, evitando la formación de burbujas. g).- Limpiar el exceso de solución con papel absorbente y aplicar una capa de barniz de uñas en la orilla de los portaobjetos con el fin de fijar la muestra y no dañar las estructuras. h).- Una vez seco el barniz se procede a observar al microscopio óptico las diferentes estructuras de la cepa correspondiente y así identificar a qué género pertenece. Cuestionario 1. ¿Qué es un microcultivo? 2. ¿Qué ventajas nos proporciona la técnica de microcultivo en el diagnostico de micosis? 3. ¿Consideras que el empleo de esta técnica es suficiente para identificar al agente infeccioso que este causando enfermedad en el paciente? ¿Por qué? 4. ¿Qué modificación harías en esta técnica para hacerla más eficiente en la identificación de hongos patógenos causantes de micosis? Bibliografía Rippon J. 1998. Micología Médica. Hongo y Actinomicetos Patógenos. 3ª edición. Interamericana Mc Graw-Gill. México. Pág.259-261. López-Martínez R., Méndez-Tovar L., Hernández- Hernández F., Castañón- Olivares R. 2004. Micología Médica. Procedimientos para el diagnostico de laboratorio. 2ª edición. Trillas. México. 45
  46. 46. ANEXOS MEDIOS DE CULTIVO Agar dextrososa de Sabouraud (ADS). Composición: Dextrosa 40.0 Peptona de Caseína 5.0 Digerido Pancreático de Tejido Animal 5.0 Agar Bacteriológico 15.0 pH 5.6 ± 0.2 Método: Suspender 65 g del medio en un litro de agua purificada. Calentar con agitación suave hasta su completa disolución y hervir durante un minuto. Evitar el sobrecalentamiento. Esterilizar en autoclave a 121°C (15 libras de presión) durante 15 minutos. Dejar enfriar a una temperatura entre 45-50°C y vaciar en placas Petri estériles. Sabouraud más antibiótico (mycosel). Composición: Dextrosa 40.0 gr Peptona de Caseína 5.0 gr Digerido Pancreático de Tejido Animal 5.0 gr Agar Bacteriológico 15.0 gr pH 5.6 ± 0.2 Estreptomicina (0,5 gr/l) Cicloheximida (0,5 gr/l). 46
  47. 47. Procedimiento: Se prepara de igual forma al medio de Agar Dextrosa de Saboraud (ADS), con la diferencia que después de esterilizarse y dejar enfriar se añaden soluciones de antibióticos para hacerlos más selectivos, tales como estreptomicina (0,5 gr/l) y cicloheximida (0,5 gr/l). Almacenar a 4 ºC. Total a utilizar para los dos medios de cultivo anterior: Frasco con 450 gr de medio de ADS Almacenamiento: 2-30° C. Caducidad: 5 años en frasco cerrado. Placa de agar de medio estandar (PDA) Composición: Papa 200 gr Dextrosa 10 gr Agar 20 gr Agua destilada 1000 ml Procedimiento: Pelar y cortar la papa en trozos pequeños. Disolver la dextrosa en agua y agregar los demás ingredientes. Hervir 30 minutos y filtrar con gasa. Completar el volumen. Esterilizar a 121 ºC por 15 minutos. Repartir. Total a utilizar: 2 papas medianas para preparar un litro. Almacenamiento: 2-30° C. Caducidad: 15 días. 47
  48. 48. Placas de agar malta Composición: Glucosa 10 gr Extracto de malta 3 gr Peptona 5 gr Agar 20 gr Agua destilada 1000 ml Preparación: Mezclar todos los ingredientes y calentar a fuego lento hasta hervir. Esterilizar la mezcla a 120 ºC durante 15 minutos. Total a utilizar: preparar un litro. Almacenamiento: 2-30° C. Caducidad: 15-20 días. Agar harina de maíz Composición: Harina de maíz 62,5 gr Agua destilada 1500 ml Tween 80 15 gr Agar 19 ml 48
  49. 49. Procedimiento: Disolver la harina de maíz en el agua destilada. Dejar reposar a temperatura ambiente durante 15 minutos. Filtrar a través de papel filtro y reconstituir el anterior volumen. Añadir el agar. Añadir el tween 80. Esterilizar a 120 ºC durante 20 minutos. Total a utilizar: preparar un litro. Almacenamiento: 2-30° C. Caducidad: 20-30 días. Agar Lactrimel de Borelli Composición: Harina de arroz 14 gr. Leche esbeltes 14 gr. Miel de abeja 7 gr. Agar 14 gr. Agua destilada 1000 ml Procedimiento: Mezclar todos los ingredientes y calentar a fuego lento hasta hervir. Esterilizar la mezcla a 120 ºC durante 15 minutos. Total a utilizar: preparar 500 ml. Almacenamiento: 2-30° C. Caducidad: 20-30 días. 49
  50. 50. PREPARACIÓN DE SOLUCIONES Hidróxido de potasio Composición Hidróxido de potasio 10 gr Agua destilada 100 ml Procedimiento: Mezclar para disolver totalmente el KOH. Guardar a temperatura ambiente en frasco de color ámbar. Se puede agregar glicerina al 10% para tener preparaciones de mayor duración reduciendo la evaporación. También se puede agregar dimetilsulfóxido (DMSO) al 40% para reducir o eliminar la necesidad de calentar el preparado. Solución de lactofenol Composición: Solución A: • Fenol (cristales) 20 gr • Acido láctico al 87 % 20 gr • Glicerina 40 ml • Mezclar. Solución B: • Azul de algodón 0,05 gr • Agua destilada 20 ml 50
  51. 51. Preparación: 1. Se calienta el agua y se añade el fenol previamente fundido, seguido del Acido láctico y de la glicerina. 2.- Solución azul de lactofenol Se añade 0.05 % de azul de algodón (azul de metilo) a la solución de lactofenol, previamente preparada. Mezclar las soluciones A y B. Conservar a temperatura ambiente hasta por seis meses. Antibióticos Stock: solución a) disolver cloranfenicol concentración 0.25 gr/ml en 10 ml de alcohol etílico 96 °C. Solución b) disolver cicloheximida concentración 0.5 gr/ml en 10 ml de agua destilada estéril. Mezclar a y b. COLORACION Ó TINCIÓN DE GRAM Solución de cristal violeta Solución A Cristal violeta 4,0 gr Etanol 20,0 ml Procedimiento: Disolver el colorante en etanol y diluir la solución al 1:10 en agua destilada. Solución B Oxalato de amonio 0,8 gr Agua destilada 80,0 ml 51
  52. 52. Procedimiento: Disolver el oxalato en el agua destilada. Mezclar una parte de la solución A con cuatro partes de la solución B. Solución de yodo (lugol). Yodo 1 gr Yoduro de potasio 2 gr Procedimiento: Disolver el yodo y el yoduro en 5 ml de agua destilada y completar a un volumen de 240 ml con agua destilada. Glicerol al 10% REQUERIMIENTOS DE MATERIAL DE LABORATORIO Cajas Petri de vidrio estéril 150 x 15 mm (20 piezas). Cajas Petri de plástico 150 x 15 mm (200 piezas). Rollos de cinta transparente adhesiva de 1 cm de ancho y de bollo pequeño (6 piezas). Tijeras pequeñas (6 piezas). Portaobjetos (una caja). Cubreobjetos (una caja). Gotero (6 piezas). Mechero (6 piezas). Papel filtro (Wtatman No1) 1 pliego de 50X50 cm Magitel (1 paquete) Mangos de bisturí con hoja (5 piezas). Asas micológicas (6 piezas). Cuadros de alfombra “moqueta” estéril de 5 cm por lado (15 piezas). Micropipetas de 100 y 1000 microlitros (1 pieza de cada capacidad) 52
  53. 53. Puntas para ambas micropipetas (100 piezas) Papel toalla (papel absorbente) (2 rollos). Desinfectante (Lysol®) (2 frascos de 1 litro o 900 ml). Gradilla para tubos eppendorf (1pieza). Tubos eppendorf (100 piezas). Parafil (1 rollo). Lupa (5 piezas). Bolsas de plástico de cierra fácil (Ziploc) 15X30cm aproximadamente (50 piezas). Micropipetas de 100 y 1000 microlitros (1 pieza de cada medida). Puntas para ambas micropipetas (100 piezas de cada medida). Gradilla para tubos eppendorf (2 piezas). Mechero (5 piezas). Pinzas estériles (5 piezas). Triangula de vidrio (6 piezas). Matraz Erlenmeyer de 1000 ml (6 piezas). Pipetas Pasteur con bulbo de hule (10 piezas con sus tapones respectivos) Azul de lactofenol (6 frascos de 25 ml cada frasco). Solución de lactofenol sin colorante (un frasco de 20 ml). Glicerol al 10% 53
  54. 54. Anexo de practica No.4. 54
  55. 55. Anexos de la práctica No.6 55
  56. 56. 56
  57. 57. 57
  • walteruretahilario

    Oct. 1, 2016

Es un manual de practicas de micología, en este se describen algunas técnicas para la identificación de hongos causantes de micosis en los seres humanos, la identificación de hongos levaduriformes y filamentosos.

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