1.propiedades fisicoquimicas del dna

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  • Human Genomic DNA
  • 1.propiedades fisicoquimicas del dna

    1. 1. DNADNA
    2. 2. DNA ESTRUCTURADNA ESTRUCTURALALAESTRUCTURAESTRUCTURADEL ADN ESTADEL ADN ESTADEFINIDA PORDEFINIDA PORLA SECUENCIALA SECUENCIADE LAS BASESDE LAS BASESNITROGENADANITROGENADAS EN LAS EN LACADENA DECADENA DENUCLEOTIDOSNUCLEOTIDOS
    3. 3. ESTRUCTURA DE BASES NITROGENADASESTRUCTURA DE BASES NITROGENADASDEL DNA Y RNADEL DNA Y RNA
    4. 4. A G C THombre, H.sapiens 0.29 0.18 0.18 0.31Bovino, Bos taurus 0.26 0.24 0.23 0.27Levadura, S.cerevisiae 0.30 0.18 0.15 0.29Mycobacterium sp. 0.12 0.28 0.26 0.11Composición en bases del DNA en algunas especies
    5. 5. 1. La relación purinas/pirimidinas es igual a 1Es decir, A+G = C+T2. En todos los DNA estudiados, la proporción molarde A es igual a la de T, y la de G igual a la de C.Es decir, A = T y G = CReglas de Chargaff
    6. 6. 1. El DNA es una doble héliceplectonémica y dextrógira,con un paso de rosca de 3.4 nm3.4 nmModelo de Watson - Crick, A
    7. 7. Modelo de Watson-Crick, B2. Cada una de las dos hélices es un polinucleótido entrelazado conel otro de manera que su polaridad es opuesta (es decir, corren ensentido antiparalelo)5’3’ 5’3’
    8. 8. 3. El eje ribosa-fosfato se sitúahacia el exterior de la doble hélice,en contacto con el solvente4. Mientras que las bases nitrogenadas(anillos planares) se sitúan, apiladas,hacia el interior de la estructura, en unentorno hidrofóbicoModelo de Watson-Crick, C
    9. 9. 5. Las bases están situadas en planos aproximadamenteperpendiculares al eje mayor de la doble hélice. La distanciaentre planos es de 0.34 nmModelo de Watson-Crick, D0.34 nm
    10. 10. Modelo de Watson-Crick, ENNNNNHHN NOOCH3HAT6. Cada base interaccionacon su opuesta a través deenlaces de hidrógeno, y demanera que:(a) Adenina (A) sólo puedeinteraccionar con timina (T)(y viceversa), a través de dospuentes de hidrógeno, y
    11. 11. NNNNOHNHHN NONHHGC(b) Guanina (G) sólopuede interaccionar concitosina (C) (y viceversa),a través de tres puentesde hidrógeno
    12. 12. 3’2’1’5’4’7. La base está situadaen posición anti-8. La desoxirribosaen forma furanósica9. El anillo furanósico estáen conformación endo-2’Modelo de Watson-Crick, F
    13. 13. 10. El eje de la doble héliceno pasa por el centro geométricodel par de bases. Esto determinaque la hélice presente un surcoancho y un surco estrechoSurcoanchoSurcoestrechoModelo de Watson-Crick, G
    14. 14. Paso de rosca 3.4 nmDistancia entre 0.34 nmplanos de basesPares de bases/vuelta 10Anchura 2.4 nmGeometría de la doble hélice (DNA-B)0.343.42.4
    15. 15. Interacciones débiles que mantienen la estructura del DNA1. Enlaces de hidrógeno entrebases complementarias2. Interacciones hidrofóbicasentre planos de bases contiguos(int. de apilamiento, stacking)3. Interacciones iónicas del fosfatocon moléculas electropositivas(histonas, poliaminas, etc.)
    16. 16. 1. Compatible con los datos cristalográficos2. El modelo predice una determinada densidad lineal que secumple para todos los DNAs conocidos3. El DNA rico en GC debe ser más difícil de desnaturalizar queel rico en AT. Esta predicción se cumple perfectamente.4. El estudio de frecuencias de vecino más próximo (A.Kornberg)sólo es compatible con un modelo complementario y antiparalelop.e.: el par AG tiene la misma frecuencia que el par CT; AT tienela misma frecuencia que TA, y así sucesivamente.Pruebas experimentales de la estructura del DNA
    17. 17. A B ZGrosor 2.6 2.4 1.8Giro Dextro Dextro LevoBases/vuelta 11 10.4 12P.de rosca 2.5 3.4 4.5Inclinación 19º 1º 9ºplano basesDistintas formas del DNA
    18. 18. DNA-A1.Doble hélice plectonémica y dextró-gira2. Planos de bases oblicuos respectoal eje de la doble hélica3. Propio de RNAs en doble hélice, ode híbridos DNA-RNA4. Más ancha y corta que DNA-B
    19. 19. DNA-Z1. Doble hélice plectonémica y levógira2. Zonas de secuencia alternante -GCGC-3. Conformación de G es syn- en lugar deanti-4. Más estrecha y larga que DNA-B
    20. 20. Desnaturalización del DNAT, ºC% IncrementoAbsorbancia a260 nmLa desnaturalizacióntérmica del DNA sigueuna curva sigmoide. Elpunto medio, Tm, estárelacionado con el conte-nido en G+C. Así, la muestraB tiene un mayor contenidoen G+C que A.
    21. 21. La temperatura de fusión (Tm) necesaria paradesnaturalizar la mitad del ADN de una mezcla (puntomedio de la reacción ADN doble hélice → ADN hélicesencilla) esta directamente relacionada con el contenido enG+C, a mayor contenido en G+C mayor temperatura defusión (Tm).
    22. 22. El estado físico de los ácidos nucleicos está relacionadocon su capacidad de absorción de la luz ultravioleta(UV) a 2.600 . El menor grado de absorción se produceen estado de doble hélice, la absorción aumenta cuandose produce la desnaturalización pasando a estado dehélice sencilla (efecto hipercrómico, aumento de laabsorbancia) y, por último, si degradamos este ADN dehélice sencilla a nivel de nucleótidos libres, de nuevoaumenta la absorbancia.Efecto Hipo crómico del DNA
    23. 23. EFECTO HIPOCROMICOEFECTO HIPOCROMICO
    24. 24. ¿Para qué purificar DNA?¿Para qué purificar DNA?Aplicaciones
    25. 25. AplicacionesAplicacionesForenseForenseDx enfermedades infecciosasDx enfermedades infecciosasDx enfermedades congénitasDx enfermedades congénitasClonación de GenesClonación de GenesGenómicaGenómicaControl de calidad microbiológicoControl de calidad microbiológicoBiodiversidadBiodiversidadIdentificación de especiesIdentificación de especies
    26. 26. ¿Cómo purificar DNA?¿Cómo purificar DNA?
    27. 27. Los 3 pasos básicos para purificar DNALos 3 pasos básicos para purificar DNALisis celularFraccionamiento de los ácidos nucleicosConcentración de los ácidos nucleicos1.1.2.2.3.3.
    28. 28. 1. Lisis celular1. Lisis celularLisis enzimática de tejidos animalesTampón de lisis con detergente. Algunos protocolosCon proteinasa K.Lisis de bacterias o levaduras.Lisozima (Bacterias Gram-positivas)liticasa (levaduras).Detergente y pH alcalino para plásmidos.Homogenizadores mecánicosAgitador mecánico, a la muestra se adicionan esferas.Congelación descongelaciónSe usa nitrógeno liquido.
    29. 29. 2. Fraccionamiento de los ácidos nucleicos2. Fraccionamiento de los ácidos nucleicosPreparación de lisados crudosNo se purificaSalting-out methodsSe precipitan las proteinas ycontaminantes con sales de acetato deamonio o potasioFraccionamiento con solventesorgánicosFenol/cloroformo/alcohol isoamílico
    30. 30. 3. Concentración de ácidos nucleicos3. Concentración de ácidos nucleicosPrecipitación con:EtanolIsopropanolEn presencia de sales
    31. 31. 2. SEPARACION DE FRAGMENTOS DE2. SEPARACION DE FRAGMENTOS DEDNADNAElectroforesis
    32. 32. ¿Cómo hacer una electroforesis de¿Cómo hacer una electroforesis deDNA?DNA?
    33. 33. Electroforesis de DNAElectroforesis de DNA
    34. 34. Electroforesis de DNAElectroforesis de DNA
    35. 35. ¿Cómo se ve una electroforesis de DNA en geles de Agarosa?
    36. 36. Electroforesis de DNAElectroforesis de DNA
    37. 37. 1235467
    38. 38. Propiedades estructurales del DNAPropiedades estructurales del DNA5’p OH3’3’OH p5’Las hebras de una molecula de DNA sonAntiparalelas y complementarias
    39. 39. Complementaridad del DNAComplementaridad del DNATA CG TATACG TACG CGTA5’pp 5’OH3’3’ OHPuentesHidrógeno
    40. 40. 95°C95°CT G T T C A G CAA C A A G T C GTTA CG TATACG TACG CGTADesnaturalización/reasociación del DNADesnaturalización/reasociación del DNA
    41. 41. T G T T C A G CAAC AAG T CG TReasociación solo con cadenas complementariasReasociación solo con cadenas complementarias
    42. 42. HibridaciónHibridaciónEs la unión de dos cadenas de ácidos nucleicosEs la unión de dos cadenas de ácidos nucleicoscomplementarias para formar un duplex ocomplementarias para formar un duplex omolécula de cadena doble.molécula de cadena doble.• Posibles híbridacionesDNA-DNADNA-RNA
    43. 43. dsDNA ssDNA apareamientoinicialdsDNADesnaturalizaciónDesnaturalizaciónReasociaciónReasociaciónRenaturalizaciónRenaturalizaciónT° T°
    44. 44. Molécula de DNAcs oRNA homóloga a unasecuencia de DNAcs oRNA con la que sehibrida de formaestable y específica porasociación de basescomplementarias.
    45. 45. SondasSondasUnaUna sondasonda es un fragmento de DNA que:es un fragmento de DNA que:– Se puede marcar para ser identificado y medidoSe puede marcar para ser identificado y medido– Se hibrida a un DNA gracias a su complementaridadSe hibrida a un DNA gracias a su complementaridadTipo de marcajesTipo de marcajes– Radioactivo (Radioactivo (3232P,P, 3535S,S, 1414C,C, 33H)H)– FluorescenteFluorescente– Biotinilación (avidina-streptavidina)Biotinilación (avidina-streptavidina)
    46. 46. Hibridación de DNAHibridación de DNAinmobilizado en soportes deinmobilizado en soportes dehibridacion:hibridacion:NitrocelulosaNitrocelulosaMembranas de nylonMembranas de nylonSouthern BlotSouthern Blot
    47. 47. NucleasasNucleasasEndonucleasa5’ Exonucleasa 3’ Exonucleasa
    48. 48. Southern BlotSouthern BlotEnzimas de retricciónDNA de variostamañosElectroforesis en gel de agarosagelDenaturación y transferencia a NCblot
    49. 49. Hibridación de la sondaVisualización
    50. 50. Southern (and Northern) blot:Southern (and Northern) blot:1. electrophoresis1. electrophoresis
    51. 51. Southern (and Northern) blot:Southern (and Northern) blot:2. transfer to a filter/membrane2. transfer to a filter/membrane
    52. 52. Southern (and Northern) blot:Southern (and Northern) blot:3. hybridization to a labeled unique probe3. hybridization to a labeled unique probe
    53. 53. TestigopositivoTestigonegativomuestraMUESTRACélulas,microorganismosautoradiografíahibridacíónlavadosondasGel de agarosaEctracción yDenaturalización del ADNFiltro denitrocelulosatransferenciaSeparación defilamentosde ADNELECTROFORESIS
    54. 54. Southern Blot
    55. 55. FILTRO DENITROCELULOSACOLONIAS REPLICA ENPLACA CON FILTROFILTRO CON COLONIASCOLONIASADN DE LAS COLONIASEN EL FILTROAUTORADIOGRAFÍACOLONIA- Réplica en placa con filtro- Lisis- Secado- Hibridación con sonda radioactiva
    56. 56. HibridacionHibridacion in situin situ por fluorescenciapor fluorescencia
    57. 57. HibridacionHibridacion in situin situ por fluorescenciapor fluorescencia

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