21                        3 METODOLOGI PENELITIAN3.1 Waktu dan Tempat Penelitian       Sampel diambil dari perairan Andai,...
223.2 Bahan dan Alat       Bahan baku yang digunakan dalam penelitian ini adalah tambelo yangberasal dari perairan Andai, ...
23proksimat yang meliputi kadar air, kadar abu, kadar protein, kadar lemak, dankarbohidrat, analisis asam amino, serta asa...
24air (H2O) dan karbondioksida (CO2) tetapi zat anorganik tidak terbakar. Zatanorganik ini disebut abu.       Prosedur ana...
25destruksi. Sampel tersebut selanjutnya ditambahkan dua tablet katalis sertabeberapa butir batu didih.   Sampel ditambahk...
26dianalisis, maka disimpan dalam refrigerator sampai saatnya akan dianalisis.Sampel dikondisikan pada suhu ruang dan past...
27amino menggunakan HPLC disajikan Gambar 7. Kondisi alat HPLC saatberlangsungnya analisis asam amino:Temperatur          ...
28membandingkan waktu retensinya dengan standar pada kondisi analisis yangsama. Waktu retensi dihitung pada kertas rekorde...
29a. Preparasi contohd (hidrolisis dan esterifikasi)       Contoh lemak ditimbang sebanyak 20-30 mg, kemudia ditambahkan 1...
30Kondisi alat kromatografi gas pada saat dilakukan analisis :1. Kolom                      : cyanopropil methylsil (kolom...
31Larutan diukur absorbansi dengan SSA pada panjang gelombang 285,2 nm untukmagnesium dan 422,7 nm untuk kalsium.2). Anali...
32dinaikkan secara bertahap hingga mencapai 350 oC selama periode 1-2 jam. Halini bertujuan untuk mencegah terjadinya pros...
33Fase n-heksana dikumpulkan dan dipekatkan dan dihitung rendemennya. EkstrakMeOH setelah partisi n-heksana dipartisi kemb...
343.3.2.2 Uji fitokimia (Departemen Kesehatan RI 1995)a) Uji alkaloidSampel sebanyak 1 gram ekstrak ditambahkan 10 mL meta...
353.3.2.3 Uji aktivitas antioksidan (Yeh dan Cen 1995)       Pengujian aktivitas antioksidan dilakukan dengan menggunakan ...
36kromatografi lapis tipis (KLT).        Kombinasi yang digunakan adalah pelarutkloroform:metanol dengan perbandingan 9:1 ...
37 dengan aluminium foil untuk mencegah penguapan eluen yang terdapat dalam kolom sehingga silika gel tetap dalam kondisi ...
383.3.2.5 Identifikasi senyawa antioksidan (Willard et al. 1988)       Fraksi terpilih dengan nilai aktivitas antioksidan ...
Upcoming SlideShare
Loading in …5
×

Bab iii metodologi penelitian

6,125 views

Published on

0 Comments
0 Likes
Statistics
Notes
  • Be the first to comment

  • Be the first to like this

No Downloads
Views
Total views
6,125
On SlideShare
0
From Embeds
0
Number of Embeds
2
Actions
Shares
0
Downloads
132
Comments
0
Likes
0
Embeds 0
No embeds

No notes for slide

Bab iii metodologi penelitian

  1. 1. 21 3 METODOLOGI PENELITIAN3.1 Waktu dan Tempat Penelitian Sampel diambil dari perairan Andai, Kabupaten Manokwari, ProvinsiPapua Barat. Ekstraksi dan uji aktivitas antioksidan dilakukan di LaboratoriumBioteknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan,Laboratorium Kimia Analitik, FMIPA, Institut Pertanian Bogor, dan PusatLaboratorium Terpadu IPB-Bogor. Identifikasi senyawa antioksidan dilakukan diBalai Pengkajian Bioteknologi (Biotech Center-BPPT), Serpong. Penelitiandilaksanakan dari bulan Agustus 2010 – Maret 2011. Gambar 6 menunjukkandiagram alir penelitian komposisi kimia dan senyawa antiokksidan dari ekstraktambelo (Bactronophorus thoracites). Tambelo kering Maserasi dengan MeOH Analisis kimia : - uji proksimat - uji asam amino Ekstraksi dengan MeOH - uji asam lemak - uji mineral Partisi dengan pelarut n-heksan, dan etil asetat Ekstrak n-heksan, ekstrak etil asetat, dan ekstrak metanol Uji Fitokima Uji antioksidan Ekstrak terplilih KLT Kromatografi kolom Eluen terbaik Uji Fitokima Uji antioksidan Fraksi terpilih Identifikasi dengan LC-MCGambar 6 Diagram alir penelitian komposisi kimia dan senyawa antioksidan dari ekstrak tambelo (Bactronophorus thoracites).
  2. 2. 223.2 Bahan dan Alat Bahan baku yang digunakan dalam penelitian ini adalah tambelo yangberasal dari perairan Andai, Kabupaten Manokwari, Propinsi Papua Barat.Tambelo diperoleh dari batang pohon mangrove Rhizopora yang sudah lapuk.Tambelo dibersihkan dengan melepaskan cangkang dan pallet kemudiandikeringkan dengan menggunakan freezer dry. Tambelo kering selanjutnyadigiling dengan menggunakan mortar dan disimpan pada suhu rendah (5-10 oC)sampai siap untuk dianalisis. Bahan kimia yang digunakan untuk ekstraksi adalah n-heksana, etil asetat,metanol, dan kertas saring Whatman 40. Bahan kimia yang digunakan untuk ujiantioksidan adalah DPPH (1,1-diphenyl-2-picrlhylhydrazyl), BHT dan vitaminsuper ester C sebagai standar. Bahan untuk uji fitokimia adalah H2SO4, akuades,kloroform p.a (pengenceran), anhidra asetat, asam sulfat pekat, HCl 2N, pereaksiDregendorff, pereaksi Wagner, pereaksi Meyer, serbuk magnesium, alkohol,HCl 37%, etanol 70%, FeCl3 5%, pereaksi Molish, pereaksi benedict, pereaksibiuret, dan larutan ninhidrin 0,1%. Peralatan utama yang digunakan adalah kromatografi lapis tipis (KLT),kromatografi kolom (KK), spektrofotometer UV-Vis JENWAY 6305,kromatografi cair (LC-MS) AGILENT TECHNOLOGIES, vacum rotaryevaporator Buchi Rotavapor R-205, dan Spektrofotometer serapan atom (SSA)Shimazu-7000.3.3 Prosedur Penelitian Penelitian ini terbagi atas dua tahap, yaitu 1) analisis komponen kimiatambelo, dan 2) Ekstraksi bahan aktif tambelo. Penelitian tahap pertama meliputianalisis rendemen, uji proksimat, asam lemak, asam amino, dan mineral. Tahapkedua meliputi ekstraksi bahan aktif dengan metode maserasi, partisi cair-cair, ujifitokimia, uji antioksidan dengan metode DPPH, dan identifikasi senyawaantioksidan dari bahan aktif yang dihasilkan.3.3.1 Penelitian tahap pertama Penelitian tahap pertama ini bertujuan untuk mendapatkan presentasebagian tubuh yang dapat dimanfaatkan dan memperoleh nilai kandungan gizi ataukomposisi kimia dari tambelo. Analisis kandungan gizi terdiri dari analisis
  3. 3. 23proksimat yang meliputi kadar air, kadar abu, kadar protein, kadar lemak, dankarbohidrat, analisis asam amino, serta asam lemak.3.3.1.1 Rendemen (Hustiany 2005) Tambelo dikeluarkan dari freezer, dicairkan kemudian ditimbang beratnyaselanjutnya dikeringkan dengan menggunakan freezer dry. Daging tembelo yangsudah kering ditimbang kembali untuk mengetahui penurunan berat setelahdikeringkan. Rendemen merupakan presentase perbandingan antara bagian yangdigunakan dengan berat utuh tambelo segar, dengan rumus :3.3.1.2 Uji proksimat (AOAC 2005) Analisis proksimat yang dilakukan meliputi uji kadar air dan abu denganmetode oven, uji kadar lemak menggunakan metode sokhlet, dan uji kadar proteinmenggunakan metode kjedahl.a) Analisis kadar air (AOAC 2005) Tahap pertama yang dilakukan untuk menganalisis kadar air adalah omengeringkan cawan porselen dalam oven pada suhu 102-105 C selama30 menit. Cawan tersebut diletakkan dalam desikator (kurang lebih 30 menit)hingga dingin kemudian ditimbang hingga beratnya konstan (A). Tambeloditimbang sebanyak 1-2 g (B), kemudian dimasukan kedalam cawan. Cawantersebut dimasukkan ke dalam oven dengan suhu 102-105 oC selama 6 jam.Cawan tersebut kemudian didinginkan dalam desikator dan ditimbang bobotnya(C). Kadar air ditentukan dengan rumus:Keterangan: A = berat cawan kosong (gram) B = berat sampel sebelum dioven (gram) C = berat cawan berisi sampel setelah dioven (gram)b) Analisis kadar abu (AOAC 2005) Analisis kadar abu dilakukan menggunakan metode oven. Prinsipnyaadalah pembakaran atau pengabuan bahan-bahan organik yang diuraikan menjadi
  4. 4. 24air (H2O) dan karbondioksida (CO2) tetapi zat anorganik tidak terbakar. Zatanorganik ini disebut abu. Prosedur analisis kadar abu dalam bahan panganadalah sebagai berikut: cawan abu porselin yang kosong dimasukkan ke dalamoven. Cawan abu porselin dikeluarkan dan didinginkan dalam desikator selama30 menit, kemudian cawan abu porselin kosong ditimbang untuk mengetahuibobot cawan kosong (A). Sampel yang telah dihomogenkan ditimbang 2 gramdan dimasukan ke dalam cawan abu porselin ditimbang (B), kemudian masukanke dalam oven bersuhu 550-600 oC selama 24 jam atau sampai pengabuansempurna, sehingga diperoleh abu berwarna putih, setelah selesai, suhu tungkupengabuan diturunkan hingga suhu 40 oC. Cawan porselin dikeluarkan denganmenggunakan penjepit dan masukan ke dalam desikator selama 30 menit. Apabila abu belum putih benar harus dilakukan pengabuan kembali. Abudibasahi (dilembabkan) dengan akuades secara bertahap, kemudian dikeringkanmenggunakan hot plate dan diabukan kembali pada suhu 550-600 oC sampaidiperoleh berat yang konstan. Suhu pengabuan diturunkan sampai ± 40 oC laludipindahkan cawan abu porselin ke dalam desikator selama 30 menit kemudianditimbang bobotnya (C) segera setelah dingin. Kadar abu dalam bahan pangandapat dihitung berdasarkan persamaan berikut :Keterangan:A = Berat cawan kosong (gram)B = Berat sampel sebelum pengabuan (gram)C = Berat cawan berisi sample setelah pengabuan (gram)c) Analisis kadar protein (AOAC 2005) Penentuan kadar protein dilakukan dengan metode total nitrogen yangdidasarkan pada reaksi penetralan asam basa. Kadar protein dihitung berdasarkankesetimbangan reaksi kimia. Tahap-tahap yang dilakukan dalam analisis proteinterdiri dari tiga tahap, yaitu destruksi, destilasi, dan titrasi. Tahapan destruksi adalah sebagai berikut: sampel dilumatkan denganblender hingga partikelnya dapat melewati saringan 20 mesh. Sampel dimasukandalam kantong plastik atau gelas yang bersih dan bertutup. Homogenat sampelditimbang 2 gram pada kertas timbang, kemudian dimasukan ke dalam labu
  5. 5. 25destruksi. Sampel tersebut selanjutnya ditambahkan dua tablet katalis sertabeberapa butir batu didih. Sampel ditambahkan 15 mL asam sulfat pekat(95-97%) dan 3 mL hidrogen peroksida secara perlahan dan didiamkan 10 menitdalam ruang asam. Destruksi dilakukan pada suhu 410 oC selama 2 jam atausampai larutan jernih. Sampel hasil destruksi didiamkan hingga mencapai suhukamar dan tambahkan 50-75 mL akuades. Tahap kedua adalah distilasi, posedur tahapan ini sebagai berikut:sebanyak 25 mL larutan H3BO3 4% yang mengandung indikator sebagaipenampung destilat dimasukan dalam erlenmeyer. Labu yang berisi hasildestruksi dipasang pada rangkaian alat destilasi uap, kemudian ditambahkan50-75 mL larutan natrium hidroksida dan natrium thiosulfat dan dilakukandestilasi, selanjutnya destilat ditampung ke dalam erlenmeyer tersebut hinggavolume mencapai minimal 150 mL (hasil destilasi akan berubah menjadi kuning). Tahap ketiga adalah titrasi hasil destilat dengan HCl 0.2 N, yang sudahdibakukan sampai warna berubah dari hijau menjadi abu-abu netral. Analisisstandar blanko dilakukan seperti tahapan sampel. Kadar protein dapat dihitungdengan persamaan berikut :Keterangan :KP = Kadar ProteinVa = mL HCl untuk titrasi sampelVb = mL HCl untuk titrasi blankoN = Normalitas HCl yang digunakanW = berat sampelc) Analisis kadar lemak (AOAC 2005). Prinsip analisis kadar lemak diawali dengan melakukan pengekstrakansampel dengan pelarut organik untuk mengeluarkan lemak dengan bantuanpemanasan pada suhu titik didih pelarut selama 8 jam. Pelarut organik yangmengikat lemak selanjutnya dipisahkan dengan proses penguapan (evaporasi),sehingga hasil lemak tertinggal dalam labu. Penetapan bobot lemak dihitungsecara gravimetri. Sampel dilumatkan hingga homogen dan dimasukan ke dalam wadahplastik atau gelas yang bersih dan bertutup. Apabila sampel tidak langsung
  6. 6. 26dianalisis, maka disimpan dalam refrigerator sampai saatnya akan dianalisis.Sampel dikondisikan pada suhu ruang dan pastikan sampel masih homogensebelum ditimbang. Apabila terjadi pemisahan cairan dan sampel, maka dilakukanpengadukan ulangan dengan blender sebelum dilakukan pengamatan. Proseduranalisis lemak adalah sebagai berikut : labu alas bulat ditimbang dalam keadaankosong (A). Homogenat sampel ditimbang sebanyak 2 gram (B) dan masukan kedalam selongsong lemak (ekstraction timbles). Berturut-turut dimasukan 150 mLn-heksana ke dalam labu alas bulat, selongsong lemak ke dalam ekstractorsoxhlet, dan pasang rangkaian sokhlet dipasang dengan benar. Ekstraksidilakukan pada suhu 60 oC selama 8 jam. Campuran lemak dan heksana dalamlabu alas bulat dievaporasi sampai kering. Labu alas bulat yang berisi lemakdimasukan ke dalam oven bersuhu 105 oC selama ± 2 jam untuk menghilangkansisa n-heksana dan air. Labu dan lemak didinginkan dalam desikator selama30 menit. Labu alas bulat yang berisi lemak ditimbang (C) sampai berat konstan.Kadar lemak dalam bahan pangan dapat dihitung berdasarkan persamaan berikut :Keterangan:KL = kadar lemakA = bobot contohB = bobot labu lemak dan labu didihC = bobot labu lemak, batu didih dan lemakd) Analisis kadar karbohidrat (AOAC 2005) Perhitungan kadar karbohidrat dilakukan menggunakan metode bydifference yaitu pengurangan 100 % dengan jumlah dari hasil empat komponenyaitu kadar air, protein, lemak dan abu. Perhitungannya sebagai berikut: % Karbohidrat = 100 % - ( % air + % lemak + % protein + % abu )3.3.1.3 Analisis asam amino (AOAC 1994) Komposisi asam amino ditentukan dengan High Performance LiquidChromatography (HPLC). Perangkat HPLC sebelum digunakan harus dibilasdengan eluen yang akan digunakan selama 2-3 jam. Begitu pula dengan syringeyang akan digunakan juga harus dibilas dengan akuades. Prosedur analisis asam
  7. 7. 27amino menggunakan HPLC disajikan Gambar 7. Kondisi alat HPLC saatberlangsungnya analisis asam amino:Temperatur : 27 oC (suhu ruang)Jenis kolom : pico tag 3,9x150 μmKecepatan alir eluen : 1 ml/menitTekanan : 3000 psiFasa gerak : - Asetoniril 60% - Buffer fosfat 0,1 MDetektor : UVPanjang gelombang : 256 nmDerivatisasi : derivatisasi pre-kolomTipe injeksi : on column injection tanpa septumProgram : isokratik (kecepatan aliran eluen konstan)Kandungan masing-masing asam amino pada bahan dapat dihitung dengan rumus:Keterangan : C = konsentrasi standar asam amino (2,5 μg) FB = faktor pengenceran ( 133,1 mL) BM = bobot molekul dari masing-masing asam amino (g/mol)3.3.1.4 Analisis asam lemak (AOAC 1984) Kandungan asam lemak dapat ditentukan dengan metode gas kromatografididasarkan pada partisi komponen-komponen dari suatu cairan di antara fasagerak berupa gas dan fasa diam berupa zat padat atau cairan yang tidak mudahmenguap yang melekat pada bahan pendukung inert. Komponen-komponen yangdipisahkan harus mudah menguap pada suhu pemisahan yang dilakukan, sehinggasuhu operasi biasanya lebih tinggi dari suhu kamar dan biasanya dilakukanderivatisasi untuk contoh yang sulit menguap. Tahapan analisis asam lemakdiawali dengan menghidrolisis lemak/minyak dalam sampel menjadi asam lemak,kemudian ditransformasi menjadi bentuk esternya yang bersifat lebih mudahmenguap. Transformasi dilakukan dengan cara metilasi sehingga diperoleh metilester asam lemak (FAME). Metil ester asam lemak (FAME) ini dianalisis denganalat kromatografi gas. Identifikasi tiap komponen dilakukan dengan
  8. 8. 28membandingkan waktu retensinya dengan standar pada kondisi analisis yangsama. Waktu retensi dihitung pada kertas rekorder sebagai jarak dari garis padasaat muncul puncak pelarut sampai ke tengah puncak komponen yangdipertimbangkan. Tambelo kering 0,75 g 0,75 g Penambahan 5-10 ml HCl 6N Pemanasan dalam oven pada suhu 100 oC selama 24 jam Hidrolisat Protein Penyaringan dengan milipore berukuran 45 mikron Filtrat hidrolisat Penambahan 30 μL larutan pengering (campuran antara metanol, natrium asetat, dan trietilamim dengan perbandingan 2:2:1) Pengeringan dengan gas N2 Hidrolisat protein kering Penambahan 30 μL larutan derivatisasi ( campuran antara metanol, pikoiotisianat, dan trietilamin dengan perbandingan 3:3:4) Pengenceran dengan buffer asetat sebanyak 200 μL lalu dibiarkan selama 20 menit Penyaringan dengan milipore berukuran 0,45 mikron Injeksi ke alat HPLC Kromatogram Gambar 7 Prosedur analisis asam amino menggunakan HPLC.
  9. 9. 29a. Preparasi contohd (hidrolisis dan esterifikasi) Contoh lemak ditimbang sebanyak 20-30 mg, kemudia ditambahkan 1 mLlarutan NaOH 0,5 N ke dalam metanol dan dipanaskan dalam penangas air selama20 menit. Sebanyak 2 mL BF3 16% dan 5 mg/mL standar internal ditambahkanpada sampel tersebut, lalu dipanaskan lagi selama 20 menit dan selanjutnyadidinginkan. Sampel kemudian ditambahkan 2 mL NaCl jenuh dan 1 mLn-heksana, lalu dikocok dengan baik. Lapisan heksana dipindahkan denganbantuan pipet tetes ke dalam tabung yang berisi 0,1 gram Na2SO4 anhidrat,dibiarkan 15 menit. Fasa cair dipisahkan dan selanjutnya diinjeksikan kekromatografi gas.b. Analisis komponen asam lemak dengan kromatografi gas Pelarut sebanyak 1 µL diinjeksikan ke dalam kolom. Bila aliran gaspembawa dan sistem pemanasan sempurna, puncak pelarut akan nampak dalamkurang dari 1 menit. Sebanyak 5 µL campuran standar FAME diinjeksikansetelah pena kembali ke nol (baseline). Jika semua puncak sudah keluar,diinjeksikan 5 µL sampel yang telah dipreparasi (A). Waktu retensi dan puncakmasing-masing komponen tersebut kemudian diukur. Jika rekorder dilengkapidengan integrator, waktu retensi dan luas puncak langsung diperoleh dariintegrator dan membandingkan waktu retensinya dengan standar untukmendapatkan informasi mengenai jenis dari komponen-komponen dalam contoh.Jumlah dari masing-masing komponen dalam sampel dihitung menggunakanmetode internal standar, dengan cara sebagai berikut :Keterangan :Cx = kosentrasi komponen xCs = kosentrasi standar internalAx = luas puncak komponen xAs = luas puncak standar internalR = respon detektor terhadap komponen x relatif terhadap standar
  10. 10. 30Kondisi alat kromatografi gas pada saat dilakukan analisis :1. Kolom : cyanopropil methylsil (kolom kapiler)2. Dimensi kolom : p=60m,ø dalam = 0.25 mm, 025 µm film tickness3. Laju alir n2 : 20 ml/menit4. Laju alir h2 : 30 ml/menit5. Laju alir udara : 200 – 250 ml/menit6. Suhu injektor : 200 oc7. Suhu detektor : 230 oc8. Suhu kolom : program temperatur - Kolom temperatur : awal 190 oC diam 15 menit akhir 230 oC diam 20 menit9. Ratio : 1:810. Injeksi volum : 1 µl11. Linier velocity : 20 cm.sec3.3.1.5 Analisis mineral Mineral yang dianalisis pada sampel tambelo meliputi mineral kalsium(Ca), kalium (K), magnesium (Mg), besi, (Fe), natrium (Na), mangan (Mn),klorida (Cl), seng (Zn), fospat, dan tembaga (Cu), dianalisis dengan metodespektrofotometer serapan atom (SSA).a. Analisis mineral kalsium (Ca), kalium (K), dan seng (Zn) (Yosida et al. 1972). Prinsip penentuan kadar kalsium, kalium dan seng adalah proses pelarutansampel dengan asam klorida, kemudian absorbansinya diukur denganmenggunakan SSA. Prosedur analisis mineral kalsium, kalium dan seng adalahsebagai berikut: Sampel yang telah kering ditimbang sebanyak 1-2 gram,kemudian dihancurkan dan dimasukkan ke dalam gelas piala yang telah dibilasdengan HCl 1 N. Sampel ditambahkan dengan 25 mL HCl 1 N dan disimpanselama 24 jam. Setelah penyimpanan, sampel dikocok dengan shaker dandisaring dengan kertas Whatman No.1.1). Analisis mineral kalsium (Ca) Ekstrak sampel dipipet sebanyak 1 mL, ditambahkan 2 mL larutanlantanum oksida dan ditambahkan HCl 1 N sampai volume menjadi 10 mL,kemudian ditera dengan penambahan akuades sampai volume menjadi 50 mL.
  11. 11. 31Larutan diukur absorbansi dengan SSA pada panjang gelombang 285,2 nm untukmagnesium dan 422,7 nm untuk kalsium.2). Analisis mineral kalium (K) dan seng (Zn) Ekstrak sampel dipipet sebanyak 2 mL dan ditambahkan HCl 1 N sampaivolume menjadi 40 mL, kemudian ditera dengan penambahan akuades sampaivolume menjadi 50 mL. Larutan diukur absorbansi dengan AAS pada panjanggelombang 766,5 nm untuk kalium dan 213,9 nm untuk seng.b. Analisis mineral besi (Fe) Prinsip penentuan kadar besi adalah proses pelarutan bahan dengan larutanasam campur yang terdiri dari asam nitrat, asam sulfat dan asam perklorat,kemudian dilanjutkan dengan proses pemanasan. Prosedur analisis mineral besiadalah sebagai berikut: sampel yang telah kering ditimbang sebanyak 1-2 gram,kemudian dihancurkan. Larutan asam campuran disiapkan yang dibuat dariHNO3, H2SO4, dan HClO4 dengan perbandingan 5:1:2. Sampel yang telahhancur ditambah 10 mL larutan asam campur lalu dipanaskan di dalam ruangasam menggunakan api kecil selama 2 jam. Api dibesarkan sampai larutanmenjadi jernih. Kemudian didinginkan. Larutan ditambahkan akuades sampaivolume 50 mL dan disaring dengan kertas saring pencucian asam Whatman No.1(acid-washed filter paper whatman No.1). Sebanyak 10 mL ekstrak sampel ditambahkan 1 mL hidroquinon dan 1 mLorto-fenantrolin, kemudian ditambahkan sodium sitrat sampai pH menjadi 3,5.Larutan diencerkan dengan akuades sampai volume 50 mL dan dipanaskan dalamwater bath selama 1 jam. Larutan deret standar diperlakukan dengan pereaksiyang sama dengan ekstrak sampel. Absorbansi diukur dengan SSA pada panjanggelombang 248,3 nm.c. Analisis mineral tembaga (Cu) dan mangan (Mn) (SNI 01-2362-1991) Prinsip dari penentuan kadar tembaga dan mangan adalah prosespengabuan dengan suhu 450 oC dengan penambahan asam nitrat (HNO3).Prosedur analisis sebagai berikut: sampel ditimbang sebanyak 25 gram dalamgelas piala 250 mL yang terdahulu dicuci dengan HNO3 6N. Sampel dikeringkandi dalam oven pengering pada suhu 110-125 oC selama 8-24 jam. Sample keringkemudian dipindahkan ke dalam tungku, dan atur suhu pada 250 oC. Suhu tunggu
  12. 12. 32dinaikkan secara bertahap hingga mencapai 350 oC selama periode 1-2 jam. Halini bertujuan untuk mencegah terjadinya proses pembakaran secara cepat yangmenyebabkan contoh dapat terhambur keluar. Kondisi pada suhu ini dibiarkansesaat untuk memberikan kesempatan sebagian besar lemak terbakar habis.Kenaikkan suhu kemudian dilanjutkan hingga 450 oC, dan dibiarkan selamasemalam (16-24 jam). Jika proses sampel abu belum putih sempurna, sampeldikeluarkan dari tungku dan dinginkan. Sampel tersebut kemudian ditambahkan0,25-1 mL HNO3 pekat. Sampel diletakkan diatas hot plate untuk menguapkanHNO3. Sampel kemudian dipanaskan kembali pada suhu 450 oC di dalam tungkuselama 30-60 menit. Abu yang dihasilkan harus benar-benar putih, apabila tidakproses penambahan asam nitrat harus diulangi. Abu dilarutkan ke dalam 2 mL HNO3 pekat, kemudian diencerkan denganakuades hingga 25 mL dan didihkan di atas hot plate. Larutan disaring dengankertas saring Whatman No.42 yang sebelumnya telah dicuci dengan HNO3 10%dan akuades. Filtrat yang diperoleh kemudian diencerkan dengan akuades hingga50 mL. Larutan standar, blanko dan contoh dialirkan ke dalam SSA. Absorbansimineral Cu dan Mn masing-masing diukur dengan SSA pada panjang gelombang324,7 nm dan Mn 285,2 nm.3.3.2 Penelitian tahap kedua Penelitian yang dilakukan pada penelitian tahap kedua adalah ekstraksibahan aktif, uji fitokimia, uji aktivitas antioksidan, serta uji fraksinasi danidentifikasi senyawa antioksidan.3.3.2.1 Ekstraksi bahan aktif Pelarut yang digunakan untuk ekstraksi tambelo yaitu tiga macampelarut berdasarkan tingkat kepolarannya, yaitu heksana (non polar), etil asetat(semi polar), dan metanol (polar). Tahapan proses ekstraksi tambelo meliputipenghancuran sampel, maserasi, partisi, dan evaporasi. Sampel kering ditimbangsebanyak 500 gram, kemudian dimaserasi dengan pelarut metanol (MeOH)sebanyak 2500 mL, perbandingan 1:5 pada suhu ruang selama 3x24 jam. Setiap1 x 24 jam dilakukan penyaringan, kemudian filtrat yang dihasilkan digabungkandan dipekat dengan menggunakan rotary evaporator. Ekstrak MeOH pekatdipartisi dengan n-heksana menggunakan corong pisah diulang sebanyak 3 kali.
  13. 13. 33Fase n-heksana dikumpulkan dan dipekatkan dan dihitung rendemennya. EkstrakMeOH setelah partisi n-heksana dipartisi kembali dengan etil asetat, diulangsebanyak 3 kali. Fase etil asetat dikumpulkan dan dipekatkan, lalu dihitungrendemennya. Ekstrak metanol sisa partisi dipekatkan kembali dan dihitungrendemen. Semua ekstrak diuji fitokimia dan uji antioksidan(Miyaoka et al. 1998; Ebada et al. 2008). Diagram alir proses ekstraksi bahanaktif tambelo disajikan pada Gambar 8. Sampel (500 g) Maserasi 3x24 jam dengan MeOH perbandingan 1:5 Penyaringan Filtrat Residu Evaporasi Ekstrak MeOH Dipartisi dengan n-Heksana Fase n-heksana Fase MeOH Evaporasi Dipartisi dengan etil asetat Fase etil asetat Fase MeOH Ekstrak n-Heksana Evaporasi Evaporasi Ekstrak Ekstrak etil asetat MeOHGambar 8 Diagram alir proses ekstraksi bahan aktif tambelo (Ebada et al. 2008).
  14. 14. 343.3.2.2 Uji fitokimia (Departemen Kesehatan RI 1995)a) Uji alkaloidSampel sebanyak 1 gram ekstrak ditambahkan 10 mL metanol dan beberapa tetesamoniak. Fraksi metanol dipisahkan dan diasamkan dengan 10 tetes H2SO4 2M.Fraksi asam diambil kemudian ditambahkan pereaksi Dragendrof, Meyer, danWagner.b) Uji saponin Sebanyak 50 mg sampel ditambah dietil eter. Residu yang tidak larutdalam dietil eter diambil, dipisahkan dan ditambahkan 5 ml air kemudian dikocoksampai timbul busa yang stabil.c) Uji steroid/Triterpenoid Sampel sebanyak 1 gram ditambahkan 25 mL etanol 30% dipanaskan(50 oC) dan disaring. Filtratnya diuapkan kemudian ditambahkan eter. Lapisaneter yang terbentuk dipipet dan diletakkan papan uji (spot plate) denganmenambahkan pereaksi Liebermen Buchard (3 tetes asam asetat anhidrin dan1 tetes H2SO4 pekat), selanjutnya diamati warna yang terbentuk, jika terbentukwarna hijau adalah steroid dan warna merah adalah triterpenoid.d) Uji Flavonoid Sebanyak 1 gram sampel ditambah metanol 30% sampai terendamkemudian dipanaskan. Filtratnya ditaruh ke dalam spot plate (papan uji)kemudian ditambahkan H2SO4 pekat, adanya flavonoid ditunjukkan olehterbentuknya warna merah akibat penambahan H2SO4.e) Uji Tanin Sebanyak 50 mg sampel dilarutkan dalam 5 ml etanol ditambah denganbeberapa tetes pereaksi FeCl3 1 %. Adanya tannin ditunjukan denganterbentuknya warna hijau, biru atau ungu.f) Fenol hidrokuinon (pereaksi FeCl3) Sebanyak 1 g sampel diekstrak dengan 20 ml etanol 70%. Larutan yangdihasilkan diambil sebanyak 1 ml kemudian ditambahkan 2 teteslarutan FeCl3 5%. Terbentuknya warna hijau atau hijau biru menunjukkan adanyasenyawa fenol dalam bahan.
  15. 15. 353.3.2.3 Uji aktivitas antioksidan (Yeh dan Cen 1995) Pengujian aktivitas antioksidan dilakukan dengan menggunakan metodeperendaman radikal bebas DPPH (1,1-diphenyl-2-picrlhylhydrazyl)(Yeh dan Cen 1995). Prinsip kerjanya pada sampel (mengandung senyawabersifat antioksidan) yang dapat meredam radikal bebas DPPH. Uji ini dilakukanterhadap ekstrak tambelo. Ekstrak dilarutkan dalam metanol dan dibuat dalamberbagai konsentrasi ( 20, 40, 60, dan 80 ppm), kemudian dimasukkan ke dalamtabung reaksi. Ekstrak tersebut masing-masing ditambahkan 200 μl larutan DPPH1mM dalam metanol. Volume dicukupkan sampai 5 mL, kemudian diinkubasipada suhu kamar selama 30 menit. Serapan sampel tersebut diukur pada panjanggelombang 515 nm. Butylated hydroxytoluene (BHT) dan vitamin super ester Cdigunakan sebagai kontrol positif, dan untuk pembanding dengan masing-masingkosentrasi 4, 6, 8, dan 10 ppm. Hambatan dihitung dengan rumus. Nilai absorbansi sampel diperoleh persentase penghambatan aktivitasradikal bebas. Persamaan regresi diperoleh dari hubungan antara kosentrasisampel dan persentase penghambatan aktivitas radikal bebas. Nilai kosentrasi danhambatan ekstrak diplotkan masing-masing pada sumbu x dan y. Persamaanregresi yang diperoleh dalam bentuk y = bx + a. Persamaan ini digunakan untukmencari Inhibition Concentration 50 % (IC50) dengan memasukkan angka 50sebagai y sehingga didapatkan nilai x sebagai IC50. Pengujian ini dilakukansebanyak tiga kali ulangan.3.3.2.4 Fraksinasi senyawa antioksidan Fraksinasi terhadap ekstrak kasar tambelo dilakukan pada ekstrak yangmemiliki aktivitas antioksidan tertinggi (ekstrak terpilih). Metode yangdigunakan ada dua macam, yaitu kromatografi lapis tipis (KLT) dan kromatografikolom (KK).a) Kromatografi lapis tipis (KLT) Pada penelitian ini, pemilihan pelarut untuk fraksinasi dilakukan denganmencoba beberapa kombinasi untuk mengembangkan spot ekstrak terpilih pada
  16. 16. 36kromatografi lapis tipis (KLT). Kombinasi yang digunakan adalah pelarutkloroform:metanol dengan perbandingan 9:1 mL, pelarut heksan : etil asetatdengan perbandingan 1:1 mL dan pelarut kloroform : metanol denganperbandingan 17:3 mL, pelarut heksan:etil asetat dengan perbandingan 8:2 dann-heksana:kloroform (3:2), untuk memilih eluen terbaik dicoba dengan berbagaieluen n-heksana, kloroform, etil asetat, dan metanol. Ekstrak terpilih sebanyak0,02 gram dilarutkan dalam 0,5 mL pelarutnya. Larutan ekstrak tersebutkemudian ditotolkan pada plat silika gel 60 F254 dengan panjang l0 cm.Kombinasi pelarut yang menghasilkan pengembangan spot terbaik digunakansebagai eluen untuk memfraksinasi ekstrak terpilih dengan kromatografi lapistipis maupun kromatografi kolom. Diagram alir fraksinasi dengan metode KLTdapat disajikan pada Gambar 9. Ekstrak aktif KLT (silika gel) CHCl3:MeOH Heksan:EtOH CHCl3:MeOH Heksan:EtOH Heksan :CHCl3 9:1ml 1:1ml 17:3 ml 8:2ml 3:2 ml terbentuknya spot terbanyak Gambar 9 Diagram alir fraksinasi dengan metode KLT.b) Kromatografi kolom (KK) (Gritter et al. l99l) Pelaksanaan kromatografi kolom dilakukan dengan memasang kolom padastatif secara tegak lurus. Kolom diberi glasswool pada bagian bawahnya.Diagram alir fraksinasi dengan metode kromatografi kolom dapat dilihat padaGambar 10. Pencucian kolom dilakukan dan pembuatan larutan silika gel (silikagel G40-63) yang akan dimasukkan ke dalam kolom sebelum ekstrak dimasukkanke dalam kolom. Silika gel sebanyak 13-15 gram dilarutkan pada eluennkloroform : metanol = 9:1 sehingga diperoleh larutan silika gel. Semua larutansilika gel masuk ke dalam kolom, lalu dilakukan penjenuhan silika gel dalamkolom selama 30-60 menit. Pada proses penjenuhan, bagian atas kolom ditutup
  17. 17. 37 dengan aluminium foil untuk mencegah penguapan eluen yang terdapat dalam kolom sehingga silika gel tetap dalam kondisi basah. Ekstrak yang akan difraksinasi adalah ekstrak terpilih sebesar 1 gram dan dilarutkan pada pelarut asal sebanyak 3 mL. Silika gel harus jenuh sebelum ekstrak dimasukkan dan setelah silika gel jenuh maka kran kolom dibagian bawah kolom dibuka kembali setelah semua ekstrak masuk ke dalam kolom. Ekstrak dibiarkan mengalir ke bagian penjerap kolom dan kolom terus diisi agar silika gel tidak kering. Larutan yang keluar dari kolom ditampung pada tabung reaksi dengan masing-masing tabung reaksi berisi ± 3 mL. Larutan dalam tabung reaksi kemudian dikeringkan untuk menghasilkan residu ekstrak. Fraksi hasil kromatografi Kolom (KK) dilakukan pengujian KLT untuk penggabungan fraksi dengan mengacu pada kesamaan pola kromatogram, dan setiap fraksi penggabungan yang terbentuk dikeringkan dengan aerator di ruang asam, dihitung rendamennya, serta diuji aktivitas antioksidan dengan menggunakan metode DPPH (Yeh dan Cen 1995). Larutan silica gel + eluen 1: 1 (w/v) Larutan silika gel dimasukkan ke dalam kolomPembuatan larutan ekstrak terpilih 1 g ekstrak terpilih + 3 ml eluen Dijenuhkan selama 30-60 menit Eluen dikeluarkan (silica gel tidak boleh kering) Larutan ektrak terpilih dimasukkan ke dalam kolom Kran dibuka Kolom terus dialiri eluen Larutan ditampung pada tabung reaksi (±10 ml) Ekstrak aktif Gambar 10 Diagram alir fraksinasi dengan kromatografi kolom.
  18. 18. 383.3.2.5 Identifikasi senyawa antioksidan (Willard et al. 1988) Fraksi terpilih dengan nilai aktivitas antioksidan yang tertinggidilanjutkan dengan mengidentifikasi senyawa antioksidan menggunakanLiquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) Agilent Technologiesdilakukan untuk mendapatkan bobot molekul dan rumus molekul yang sangatmembantu dalam elusidasi struktur molekul. Analisis yang dilakukan pada tahapidentifikasi senyawa aktif, yaitu memilih senyawa yang memiliki puncak tinggi,kemudian dicocokkan dengan senyawa yang ada pada database MarinLit(Blunt and Blunt 2008).

×