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Cultivos Iniciadores en Quesería:
Tradición y Modernidad
T di ió M d id d
Ana Rodríguez González y Beatriz Martínez Fernán...
INSTITUTO DE PRODUCTOS
LÁCTEOS DE ASTURIAS
CSIC

Tecnología y Biotecnología de P.L.
Microbiología molecular
Fermentos láct...
FERMENTOS LÁCTICOS Y BIOCONSERVACIÓN
(DairySafe)

CALIDAD Y SEGURIDAD DE
PRODUCTOS LÁCTEOS

Líneas de Investigación
Diseño...
Introducción
• Reseña histórica
• Cultivos iniciadores
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Composición
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Tipos
Funciones
Propagación

• Fermentos aut...
Introducción

Friso de la Lechería
(bajorrelieve sumerio del III milenio a.C.)

Descubrimiento accidental hace unos 8.000 ...
Introducción

(Ácidos grasos y C 14)
C-14)

Neolítico
Hace 7000 años en Europa
Introducción
Uso de una pequeña porción de leche
Back-slopping coagulada como inóculo
S. XIX: identificación de las
bacter...
Cultivos iniciadores
Una o más cepas de una o más especies bacterianas que se utilizan
para i
inocular un producto crudo o...
Cultivos iniciadores
BACTERIAS LÁCTICAS
Microorganismos Gram +
Inmóviles no esporulados
Inmóviles,
Anaerobios aerotolerant...
Cultivos iniciadores
Las bacterias lácticas utilizan rutas homo y heterofermentativas
para transformar los carbohidratos e...
Cultivos iniciadores
PROTEOLISIS

Caseína

Caseína
Oligopéptidos
Aminoácidos
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Cultivos iniciadores
FUNCIONES
Metabolismo del citrato:
diacetilo, acetaldehido

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Cultivos iniciadores
TIPOS

Según la función

Primarios: producción de ácido láctico a partir de la lactosa
Secundarios: d...
Cultivos iniciadores
Primarios mesófilos definidos
Lactococcus lastis ssp. lactis
L. lactis ssp. cremoris

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Cultivos iniciadores
Primarios termófilos
Streptococcus thermophilus
L(+) lactato, acetaldehido
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Cultivos iniciadores
Cultivos naturales o artesanales
Mezcla no definida de especies y cepas distintas
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Cultivos iniciadores
Propagación
Condiciones asépticas
GMP
Medios y condiciones
“personalizados”
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Fermentos autóctonos
Uso de fermentos comerciales
Inconvenientes

Ventajas

Control de la fermentación
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Fermentos autóctonos
Mezcla de cepas lácticas seleccionadas en función
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Fermentos autóctonos
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Fermentos autóctonos
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Fermentos autóctonos
Lactococos
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Fermentos autóctonos
180

Lactococcus

Capacidad acidificante : >0.65-0.98%
Actividad proteolítica
Producción de compuesto...
Fermentos autóctonos
Leuconostoc citreum
(8 cepas)
25%
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L lactis subsp lactis
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(6 cepas)...
Fermentos autóctonos
Medio de cultivo de bajo coste
Cultivo individual de cepas en biorreactor
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Genómica
Proteómica
Metabolómica
Fenómica…
Muchas gracias
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Cultivos Iniciadores en Quesería: Tradición y Modernidad

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Cultivos Iniciadores en Quesería: Tradición y Modernidad. Beatriz Martínez (IPLA-CSIC). En las II Jornadas Teécnicas "Nuevas Tecnologías en Seguridad y Calidad de los Productos Lácteos". Cáceres, noviembre 2013

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Cultivos Iniciadores en Quesería: Tradición y Modernidad

  1. 1. Cultivos Iniciadores en Quesería: Tradición y Modernidad T di ió M d id d Ana Rodríguez González y Beatriz Martínez Fernández Grupo DairySafe, IPLA‐CSIC II Jornadas Técnicas Nuevas Tecnologías en Seguridad y Calidad de los Productos Lácteos Cáceres, 14 de Noviembre de 2013
  2. 2. INSTITUTO DE PRODUCTOS LÁCTEOS DE ASTURIAS CSIC Tecnología y Biotecnología de P.L. Microbiología molecular Fermentos lácticos y bioconservación Físico-química Microbiología y Bioquímica de P.L. Probióticos, prebióticos y exopolisacáridos Cultivos lácteos funcionales WWW. IPLA.CSIC.ES Quesos de España
  3. 3. FERMENTOS LÁCTICOS Y BIOCONSERVACIÓN (DairySafe) CALIDAD Y SEGURIDAD DE PRODUCTOS LÁCTEOS Líneas de Investigación Diseño de cultivos iniciadores Bacteriocinas Bacteriófagos y endolisinas
  4. 4. Introducción • Reseña histórica • Cultivos iniciadores – – – – Composición p Tipos Funciones Propagación • Fermentos autóctonos – Afuega´l Pitu • Perspectivas – Seguridad – Calidad
  5. 5. Introducción Friso de la Lechería (bajorrelieve sumerio del III milenio a.C.) Descubrimiento accidental hace unos 8.000 años en el Fertile Crescent (Valle del Trigris y Eúfrates (antigua Mesopotamia) Microbiota contaminante Leche acidificación Almacenada en bolsas fabricadas con estómagos de animales Cuajada ácida queso fresco Coagulación enzimática á queso
  6. 6. Introducción (Ácidos grasos y C 14) C-14) Neolítico Hace 7000 años en Europa
  7. 7. Introducción Uso de una pequeña porción de leche Back-slopping coagulada como inóculo S. XIX: identificación de las bacterias lácticas de la leche 1890 Storch (Dinamarca) Conn (EEUU) Weigmann (Alemania) Fermentos Cultivos iniciadores Starters nata Streptococcus lactis p St. cremoris bacterias acidificantes Mantequilla de mejor calidad
  8. 8. Cultivos iniciadores Una o más cepas de una o más especies bacterianas que se utilizan para i inocular un producto crudo o pasterizado con el fin de iniciar l d t d t i d l fi d i i i su fermentación Ingredientes alimenticios Actividad metabólica Sabor Aroma Textura Nutrientes Salud Vida útil Seguridad
  9. 9. Cultivos iniciadores BACTERIAS LÁCTICAS Microorganismos Gram + Inmóviles no esporulados Inmóviles, Anaerobios aerotolerantes g En general carecen de catalasa Phylum Firmicutes (G+C < 50%) Streptococcus Lactococcus Oenococcus Enterococcus Lactobacillus Leuconostoc Pediococcus GRAS: generally regarded as safe (FDA, 2001) QPS: Qualified Presumption of Safe (EFSA, (EFSA 2007)
  10. 10. Cultivos iniciadores Las bacterias lácticas utilizan rutas homo y heterofermentativas para transformar los carbohidratos en ácido láctico Lactosa: azúcar mayoritario de la leche (4-5% g/100 mL) Galactosa Vía Homofermentativa Vía Heterofermentativa Lactococcus Streptococcus Enterococcus Leuconostoc Lactobacillus (Grupo III) Pediococcus Lactobacillus (Grupo I y II) LACTICO >85% 85% Fórmico Acético Etanol β (1,4) pH Láctico Acético Etanol CO2 Glucosa
  11. 11. Cultivos iniciadores PROTEOLISIS Caseína Caseína Oligopéptidos Aminoácidos Transaminación Deshidrogenación g Decarboxilación Reducción (www.rug.nl) α-ceto-acidos Aldehídos Alcoholes ésteres
  12. 12. Cultivos iniciadores FUNCIONES Metabolismo del citrato: diacetilo, acetaldehido Aumenta actividad del cuajo, sinéresis del coágulo y desuerado (c. enzimática) Producción de aromas Producción de acido láctico Precipitación de las caseínas ( (coagulación ácida) g ) MADURACIÓN (Ojos) Producción de gas P d ió d Actividad proteolítica Producción de P d ió d sustancias antimicrobianas CONSERVACIÓN Ó pH Bacteriocinas… Producción de exopolisacáridos TEXTURA Y AROMA
  13. 13. Cultivos iniciadores TIPOS Según la función Primarios: producción de ácido láctico a partir de la lactosa Secundarios: desarrollo y control del sabor, aroma y textura Según la tª óptima de crecimiento Mesófilos: Tª óptima 30ºC p Termófilos: Tª óptima 42ºC Según la composición g p Indefinidos Definidos Cultivos naturales de leche Cultivos naturales de suero Cepa única Múltiples Mixtos
  14. 14. Cultivos iniciadores Primarios mesófilos definidos Lactococcus lastis ssp. lactis L. lactis ssp. cremoris L(+) lactato L(+) lactato L. Lactis ssp. lactis biovar. diacetylactis L(+) lactato y diacetilo Leuconostoc mesenteroides ssp. cremoris D(+) lactato, diacetilo, euco ostoc ese te o des ssp c e o s ( ) actato, d acet o, etanol y CO2 Quesos: Gouda, Cheddar, Cottage, Camembert, Feta Leches fermentadas nórdicas: Langfil (Suecia, Noruega) Viilli (Finlandia)
  15. 15. Cultivos iniciadores Primarios termófilos Streptococcus thermophilus L(+) lactato, acetaldehido Lactobacillus delbruekii ssp. bulgaricus D(+) lactato, acetaldehido DL-lactato Lb. acidophilus, Lb. helveticus Quesos de pasta cocida: Gruyere, Emmental, Grana, Mozarella Sinergismo Yogur Caseína Aminoácidos Lactobacillus péptidos L t b ill é tid Ácido fórmico Streptococcus
  16. 16. Cultivos iniciadores Cultivos naturales o artesanales Mezcla no definida de especies y cepas distintas Producción diaria (temperatura y pH controlado) Selección de cepas mejor adaptadas Suero a 45ºC hasta pH 3,3 (fermentos naturales de suero) Quesos de pasta dura: Parmiggiano Reggiano y Grana Padano Quesos de pasta hilada: Mozzarella Lb. Lb helveticus Lb. delbrueckii ssp. lactis Lb. fermentum St. thermophilus p Leche a 65ºC, 10-15 min, y enfriar a 37-45ºC (fermentos naturales de leche) Quesos italianos t di i Q it li tradicionales l St. thermophilus Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus Lb. casei Lb. Lb helveticus Enterococcus faecalis Ent. faecium
  17. 17. Cultivos iniciadores Propagación Condiciones asépticas GMP Medios y condiciones “personalizados” personalizados Concentración: Centrifugación Ultrafiltración DVS (Cárcoba, Tesis Doctoral)
  18. 18. Fermentos autóctonos Uso de fermentos comerciales Inconvenientes Ventajas Control de la fermentación Estandarización del producto Cierta “pérdida “ d características Ci “ é did de í i organolépticas singulares Fermentos autóctonos Quesos con identidad propia (sabor y aroma diferenciales) - Respetan la microbiota autóctona y sus proporciones relativas - Adaptadas al crecimiento rápido en el tipo de leche tili d l h utilizado - Equilibrio con los fagos endémicos de la zona
  19. 19. Fermentos autóctonos Mezcla de cepas lácticas seleccionadas en función de sus características fisiológicas, metabólicas y tecnológicas, tecnológicas aisladas de la microbiota del queso de leche cruda Estudio microbiota queso leche cruda Aislamiento Y caracterización Selección Producción INDUSTRIAL INDUSTRIA
  20. 20. Fermentos autóctonos Afuega´l Pitu DOP Los Beyos IGP Casín C í DOP Gamoneu DOP Cabrales DOP
  21. 21. Fermentos autóctonos Queso AFUEGA’L PITU Leche de vaca Coagulación ácida (pH 4,4±0,28) Consumo fresco 2-3 días; madurado 2-3 semanas) 100 80 % BAL B 60 40 20 C ua 60 30 15 7 3 ja da 0 días maduración queso (Cuesta et al., 1996) Lactobacillus Leuconostoc Lactococcus
  22. 22. Fermentos autóctonos Lactococos 7,5 % 33,3% 59,2% 59 2% 180 cepas L. L lactis subsp lactis subsp. L. lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis L. garviae 3,9% 11,7% 11,9% Leuconostoc 58,8% 13,7% Leuconostoc citreum Ln. Ln mesenteroides Ln. paramesenteroides Ln. mesenteroides subsp. mesenteroides Ln. mesenteroides 40 cepas
  23. 23. Fermentos autóctonos 180 Lactococcus Capacidad acidificante : >0.65-0.98% Actividad proteolítica Producción de compuestos aromáticos Resistentes a bacteriófagos Ausencia lisogenia Compatibilidad No producción de aminas biógenas 32 cepas Consumo de citrato 100,00 98,00 96,00 94,00 92,00 90,00 88,00 86,00 (J.I. Sánchez, Tesis doctoral) 40 Leuconostoc Producción de compuestos aromáticos Producción de dextrano Resistencia a la acidez Resistencia al NaCl No producción de aminas biógenas 11 cepas
  24. 24. Fermentos autóctonos Leuconostoc citreum (8 cepas) 25% 19% L. L lactis subsp lactis subsp. biovar. diacetylactis (6 cepas) Análisis comparativo A Microbiota Parámetros físico-químicos 56 % Lactococcus lactis subsp. lactis (8 cepas) Análisis sensorial MEZCLAS A B C D E F 7 2 3 5 2 2 6 2 3 4 2 3 4 2 2 4 3 2 Mezcla M l D Fermento IPLA 001 IPLA-001 IPLA 947 - IPLA 838 – IPLA 616
  25. 25. Fermentos autóctonos Medio de cultivo de bajo coste Cultivo individual de cepas en biorreactor (pH, pO2, fuente de carbono) Cultivo C lti continuo ti (individual, mixto) Concentración de biomasa (filtración tangencial) Liofilización (ensayo de crioprotectores)
  26. 26. Fermentos autóctonos bi io bio g es bi ges o o starters starters IPLA001 500 Fermento láctico congelado ,con centrado Ingredientes: Cultivo microbian o ( Lactococcus y Leuconostoc), leche en polvo. Lote: IPLA001 120710 IPLA 001 Cantidad neta: 105 ml para 500 L de leche Co nservar co ng elado (-20ºC) Modo de em pleo : D iluir co n leche atemperada y añ adir a l a cub a de cu ajad o. Usar preferentemente antes del fin de : 01/2011 Fermento autóctono para queso Afuega`l Pitu, elaborado por Bioges con cepas aisladas por el IPLA-CSIC Fabricado po r: Bio-Ges Starters, S.A. Avd a. Portugal, 41 24071 Leó n (ESPAÑA) Contiene lactosa. Antes de usar ver ficha tècnica. Tfn o.: 987 291813 Fax: 987 291947 o: CIF: A-24469249 RGSA: 31.02073/LE
  27. 27. Fermentos autóctonos
  28. 28. Perspectivas p Nutritivo y  energético é Nutritivo N ii y  energético CALIDAD Sano, seguro S y  apetecible SEGURIDAD Nutritivo y  energético Sano, seguro Sano seguro y  apetecible Beneficioso para  la salud Nutritivo y  y energético Sano, seguro y  y apetecible Beneficioso para  para la salud Respetuoso  con el medio  con el medio ambiente Biodiversidad  Biodiversidad cultural
  29. 29. Perspectivas p CULTIVOS PROTECTORES INICIADORES/ADJUNTOS PROBIÓTICOS OBJETIVOS ↑ Vida útil ↑ Salubridad Cambios C bi organolépticos lé i ↑ Valor a ñadido ↑ Funcionalidad
  30. 30. Perspectivas: Seguridad p g BACTERIOCINAS Péptidos antimicrobianos Tecnológicamente aptas T ló i t t Amplio espectro de inhibición Historia de consumo seguro: BAL Leu Ala Gly Dha Ile Leu Ile Dhb Ala Ala Lys Pro Gly Nisina: E-234 Gly Abu S Ala Abu S Met Ala S S His Ala Asn Met Lys Abu Ala Ser Abu Ala S Ile His Val Dha Lys
  31. 31. Perspectivas: seguridad p g – Diseño de cultivos iniciadores protectores (nisina Z) activos en quesos de coagulación ácida y de pasta lavada. Fermento IPLAIPLA001 (Cárcoba, 2000) Fermento IPLA-001-nisZ IPLA-001(A) Fermento IPLA-001-nisZ IPLA-001(B) Fermento IPLA-001-nisZ IPLA-001(C) 28%28%- IPLA 729 28% - IPLA 947 19% - IPLA 838-1 83825% - IPLA 616 18% - IPLA 729 38% - IPLA 947 19% - IPLA 838-1 83825% - IPLA 616 56% - IPLA 729 19% - IPLA 838-1 83825% - IPLA 616 56% - IPLA 947 19% - IPLA 838 25% - IPLA 616 IPLA-001-nis+ (C) IPLA-001-nis+ (B) Evolución del fermento Afuega l Afuega´l pitu 2400 10 2000 8 1600 6 1200 4 800 2 400 0 0 3 6 9 12 15 0 3 6 9 12 15 0 3 6 Tiempo (días) 9 12 15 0 3 6 9 12 15 0 UA/g Log uf fc/g IPLA-001-nis+ (A) IPLA-001 12 Leuconostoc citreum IPLA 616 Lactococcus lactis IPLA 947 L. lactis IPLA 729 L. lactis biovar. diacetylactis IPLA 838 UA/g
  32. 32. Perspectivas: seguridad p g Rilla et al., 2003
  33. 33. Perspectivas: seguridad p g Fermento IPLA-001-nisZ+ 0,25 20 0,2 0,15 10 0,1 10 0,6 0,4 5 0,05 0 0 0,5 7 0,6 06 0,3 0,4 0,2 0,2 0 0 0,1 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30 Tiempo de maduración (días) 0 0 0,8 6 5 0,6 4 0,4 3 2 0,2 1 0 1 8 15 30 1 8 Tiempo de maduración (días) 15 30 0 3-M Metilbutanal* 0,4 0,2 Acetoin na* 0,8 Ácido but tírico (mg/g) 5 0 Ácido acétic (mg/g) co 1 0,8 Diacetilo* 15 1,2 15 Etanol* Fermento IPLA-001; Ácido pirúvico (mg/ /g) Á Ácido láctico (mg/g) Fermento comercial;
  34. 34. Perspectivas: calidad p Producción de cultivos iniciadores Congelación Liofilización Materia prima Bacteriófagos Compuestos antimicrobianos Fermentación en la industria láctea Acidez Temperaturas extremas Salinidad Bacteriófagos Compuestos antimicrobianos Producto lácteo fermentado Calidad higiénica Sabor Aroma Textura RESPUESTA AL ESTRÉS
  35. 35. Perspectivas: calidad p Presión selectiva GM17 Resistencia a bacteriófagos Cepas más robustas
  36. 36. Perspectivas: calidad p RIBOTIPADO RAPD RFLP PFGE RFLP-PFGE
  37. 37. Perspectivas: calidad p Tecnologías de alto rendimiento Genómica Proteómica Metabolómica Fenómica…
  38. 38. Muchas gracias g

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