Biocontrol de bacterias en procesos de fermentación láctea

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Biocontrol de bacterias en procesos de fermentación láctea. Presentación de resultados de este proyecto, en la II Jornada Técnica "Nuevas Tecnologías en Seguridad y Calidad de los Productos Lácteos". Cáceres, noviembre 2013

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Biocontrol de bacterias en procesos de fermentación láctea

  1. 1. José Emilio Rebollo Feria Cáceres, 14 de noviembre, 2013
  2. 2. Es clásico en el uso de insectos depredadores, parásitos o hervívoros para el control de plagas en agricultura Aunque surge en el campo de la Entomología, puede aplicarse a cualquier sistema depredador-presa, en el que se pretenda la eliminación controlada de ésta última Larva de la mariquita Harmonia axyridis depredando a los áfidos fitófagos Eriosoma lanigerum El Biocontrol es la eliminación o interferencia de especies biológicas parásitas, patogénicas o contaminantes mediante el uso de especies antagonistas
  3. 3. También aves o mamíferos pueden ser útiles en biocontrol
  4. 4. En el extremo opuesto de la escala biológica, los bacteriófagos o fagos son organismos acelulares que infectan y lisan bacterias de forma específica
  5. 5. La lisis bacteriana provocada por bacteriófagos es fácil de visualizar: • Se forman halos de lisis en un tapiz • Se interrumpe el crecimiento en estrías • Se clarifica un cultivo infectado
  6. 6. Biocontrol de bacterias en procesos de fermentación láctea: protección de la actividad de cultivos iniciadores y reducción de interferencias microbianas ÁREA DE GENÉTICA (Facultad de Ciencias, UEx) y DEPARTAMENTO DE LÁCTEOS (INTAEX, CICYTEX) Finca La Orden Valdesequera (CICYTEX) Área de Microbología (Facultad de Ciencas, UEx) QUESERÍAS ALMONTE SL (Deleitosa, Cáceres) QUESOS DEL CASAR SL (El Casar, Cáceres) HNOS. PAJUELO, S.A.T. (Almoharín, Cáceres) TENTUQUESO SL (Monesterio, Badajoz) LACTOCYEX SL (Malpartida, Cáceres) Consejo Regulador D.O.P. Torta del Casar Consejo Regulador D.O.P. Quesos de Ibores
  7. 7. La contaminación por Escherichia coli es una de las principales causas de hinchazón en quesos, provocando importantes pérdidas Con nuestro proyecto nos proponemos obtener bacteriófagos útiles para la eliminación de las cepas de Escherichia coli que interfieren la producción de Quesos de Ibores y Tortas del Casar
  8. 8. Diseño experimental del proyecto 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Aislamiento y caracterización de bacterias Aislamiento de bacteriófagos Selección de fagos líticos o bacteriostáticos Diseño de un cóctel de fagos Caracterización de los bacteriófagos útiles Pruebas del cóctel en laboratorio en medios líquidos Pruebas del cóctel en planta piloto Pruebas del cóctel en queserías Pruebas del cóctel en ganaderías estabuladas
  9. 9. 1. Aislamiento y caracterización de bacterias • Determinación de niveles de mesófilos totales, enterobacterias, coliformes y E. coli. • Evolución microbiana a lo largo de la maduración • Aislamiento de coliformes • Aislamiento de cepas autóctonas de E. coli a partir de queserías y ganadería Análisis microbiológico Biolog
  10. 10. 1. Aislamiento y caracterización de bacterias SDS-PAGE fingerprinting
  11. 11. 1. Aislamiento y caracterización de bacterias OTU1-RT396 OTU2-RT1 OTU3-RT12 OTU4-RT381 OTU5-RT3 OTU6-RT472
  12. 12. 2. Aislamiento de bacteriófagos • SE HAN REALIZADO 39 AISLAMIENTOS DE BACTERIÓFAGOS A PARTIR DE 12 CEPAS DE Escherichia coli AUTÓCTONAS 1. Se indujo el ciclo líticos de los profagos residentes por tratamiento con mitomicina C 2. Se prepararon suspensiones purificadas de fagos sobre MG1665 • SE HAN OBTENIDO 8 DERIVADOS CLAROS A PARTIR DE TRES DE LOS NUEVOS BACTERIÓFAGOS ASÍ COMO DERIVADOS CLAROS Y VIRULENTOS DEL FAGO LAMBDA 1. Se trataron con UV (dosis bajas) las suspensiones de fagossilvestres 2. Se localizaron los halos de lisis claros sobre MG1665 para los mutantes claros o sobre MG1665 (λ+) para aislar derivados virulentos 3. Se prepararon suspensiones purificadas de fagos sobre MG1665 Inducción de profagos y derivados claros y virulentos
  13. 13. 2. Aislamiento de bacteriófagos • SE HAN REALIZADO 44 AISLAMIENTOS DE BACTERIÓFAGOS A PARTIR DE HECES DE OVEJA: 1. Detección por el método de la gota (picar agar con virus a partir de zonas de lisis) 2. Obtención de una suspensión de fagos sobre cepas autóctonas 3. Titulación sobre la misma cepa y sobre MG1665 4. Puriricación de halos aislados y obtención de suspensiones de bacteriófagos • ENCONTRAMOS FAGOS TURBIOS Y CLAROS CON DIVERSOS TAMAÑOS Y MORFOLOGÍA Aislamiento de fagos a partir de heces de oveja
  14. 14. 3. Selección de fagos líticos o bacteriostáticos FAGOS DE LABORATORIO Lambda (λ) λvir* λcI60 λindλcI ind-(ts)857 λimm434 λimm21 T2 T4 T6 P1vir φ80 φ80 c• Cepa obtenida en este trabajo Cruce de estrías
  15. 15. 3. Selección de fagos líticos o bacteriostáticos Cruce de estrías
  16. 16. 3. Selección de fagos líticos o bacteriostáticos Fagos: 1: Hof13; 2: Homg3; 3: Homg514; 4: Homg565.1; 5: Homg565.2 1 2 3 4 5 Cruce de estrías
  17. 17. 4. Diseño de un cóctel de fagos Hof13 Homg3 Homg514 Homg565.1 Homg565.2 CÓCTEL 3 CÓCTEL 5
  18. 18. 5. Caracterización de bacteriófagos útiles Hort394 Homg97 Homg565.2 Homg511 Homg3 Hof13 Hof13 Halos de lisis: forma y tamaño
  19. 19. 5. Caracterización de bacteriófagos útiles Hort394 Homg97 Homg565.2 Homg511 Homg3 Hof13 Halos de lisis: forma y tamaño
  20. 20. 5. Caracterización de bacteriófagos útiles Bacteriófagos del Orden Caudovirales. Constituyen más del 95% de los fagos existentes. Tienen cola y ADN bicatenario. A: Mioviridales, con cola contráctil y placa basal. B: Siphoviridales, con cola larga y flexible. C: Podoviridales, con cola casi inexistente y placa con fibras.
  21. 21. 5. Caracterización de bacteriófagos útiles fRT59c Hof13 Hort380 Homg519.2 Homg518 Homg518 Homg478.1 Homg478.1 Microscopía electrónica de transmisión
  22. 22. 5. Caracterización de bacteriófagos útiles En progreso: • Caracterización molecular de los genomas virales o Electroforesis en campo pulsante o Patrones de restricción • Secuenciación completa de los bacteriófagos útiles en cócteles • Diseño de sistemas de detección específica de bacteriófagos en medios sólidos y líquidos
  23. 23. 6. Pruebas del cóctel en medios líquidos • ANÁLISIS DE LA LISIS EN MEDIOS DE LABORATORIO • Composición de los primeros cócteles de fagos Cóctel 1 FAGOS STANDAR: - Lambda vir - T4 - P1 Cóctel 2 FAGOS AISLADOS DE CEPAS DE E.coli PROCEDENTES DE QUESERÍAS: - 6RT97 - fRT3c -fRT12c
  24. 24. 6. Pruebas de cócteles en medio LB RT472 10 1 10 10 1 1 D.O 472 0,1 0,1 D.O 472 +COCTEL1y2 1ml 0,1 0,01 0,01 0,01 0 100 200 m.o.i. < 1 300 0,001 0 100 200 m.o.i. ≈ 10 300 0 100 200 300 m.o.i. ≥ 100 El umbral de m.o.i. que determina la lisis varía de unas cepas a otras
  25. 25. 6. Pruebas de cócteles en medio LB Fagos cóctel 2 (m.o.i. < 1) 10 10 10 1 1 1 0,1 0,1 0,1 0,01 0,01 0,01 0 50 100 150 200 0 RT1 100 0 200 50 100 150 200 RT12 RT3 10 10 10 1 1 1 0,1 0,1 0,1 0,01 0,01 0,01 0,001 0 100 200 300 0,001 0,001 0 100 200 300 Fagos cóctel 2 (m.o.i. 10) 0 100 200 300
  26. 26. 6. Pruebas de cócteles en medio LB CÓCTEL 1 m.o.i. < 1 CÓCTEL 2 m.o.i. < 1 CÓCTEL1 m.o.i. 100 CÓCTEL 2 m.o.i. ≥ 10 10 10 1 1 0,1 0,1 0,01 0 50 100 150 0,01 MG1655 200 0 10 10 10 1 1 0,1 0,1 150 200 1 0,1 100 10 1 50 0,1 0,01 0,01 0 100 200 300 0,01 0,01 0 100 200 300 RT381 0 50 100 150 200 0 100 200 300
  27. 27. 6. Pruebas de cócteles en leche CÓCTEL DE 3 FAGOS m.o.i. ≈ 10
  28. 28. 7. Pruebas del cóctel 5 en planta piloto Evolución de los recuentos de E. coli (RT1) a m.o.i. 10 y 30
  29. 29. 7. Pruebas del cóctel 5 en planta piloto Desarrollo de un sistema informático de análisis cuantitativo de los “ojos” o “burbujas”
  30. 30. 7. Pruebas del cóctel 5 en planta piloto Evolución de los “ojos” en quesos a m.o.i. 10 y 30
  31. 31. 7. Pruebas del cóctel 5 en planta piloto 1D 4D Control m.o.i. 10 Control m.o.i. 30 m.o.i. 10 m.o.i. 30 28D 7D Control m.o.i. 10 m.o.i. 30 Control m.o.i. 10 m.o.i. 30
  32. 32. 8. Pruebas del cóctel 5 en queserías
  33. 33. 8. Pruebas del cóctel 5 en queserías
  34. 34. 8. Pruebas del cóctel 5 en queserías 8 7 6 Leche Queso 24h 5 4 3 Control Ec Ec+Fago Evolución del número de bacterias E. coli (RT144) por mL
  35. 35. 9. Pruebas de cóctel en ganadería estabulada Finca La Orden - Valdesequera
  36. 36. En progreso: • Ensayos en ganadería estabulada • Altas presiones: eliminación de fagos en el queso Otras acciones del grupo: • Análisis de la infección de bacterias autóctonas por los fagos autóctonos • Búsqueda y caracterización de fagos frente a Klebsiella oxytoca, Enterobacter cloacae y Citrobacter braaki • Selección de fagos para un cóctel de amplio espectro • Nuevo sistema de detección de enterobacterias en alimentos • Evolución de poblaciones bacterianas durante la maduración • Valoración de la capacidad productora de gas de diferentes especies bacterianas en los quesos extremeños
  37. 37. F. Molina N. Balas E. López E. Ferrera R. Tabla A. Gómez I. Roa J.E. Rebollo M. Pacheco

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