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[DDBJing33] ゲノムワイド多型を利用した遺伝解析の実際

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ゲノムワイド多型を利用した遺伝解析の実際
講師:白澤 健太(かずさDNA研究所 先端研究部 植物ゲノム・遺伝学研究室 主任研究員)
2015年11月11日「第33回 DDBJing 講習会 in 東京」
@国立研究開発法人 科学技術振興機構 東京本部別館
YouTube:https://youtu.be/AL8gkTCLj_w
DDBJing 講習会:http://www.ddbj.nig.ac.jp/ddbjing/ddbjing.html

Published in: Education
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[DDBJing33] ゲノムワイド多型を利用した遺伝解析の実際

  1. 1. ゲノムワイド多型を利用した 遺伝解析の実際 白澤 健太 かずさDNA研究所
  2. 2. なぜ、ゲノムワイド多型データが必要か? • マーカー数:少 • 解像度:低MAS QTL GWAS • マーカー数:多 • 解像度:高GS
  3. 3. ゲノムワイド多型データの集め方 • RFLP – サザンブロット分析 • RAPD, AFLP – PCR→電気泳動 • SSR (microsatellite) – PCR→電気泳動 • SNP – PCR→電気泳動 – qPCR – チップ – NGS
  4. 4. NGSを利用したゲノムワイド多型分析 • 全ゲノム解読 • トランスクリプトーム • エキソンキャプチャ • ターゲットアンプリコン シークエンス • Reduced-representationラ イブラリ – RAD-Seq – GBS – ddRAD-Seq Davy et al. (2011) Nat Rev Genet 12, 499-510
  5. 5. WGS RAD-Seq Digestion Adapter ligation PCR amplification Sequencing RAD-Seq in Kazusa 100PE 250PE
  6. 6. RAD-Seqワークフロー 1日目 2日目 3日目 4日目 5日目 9:00 PCR・精製 シークエンス シークエンス 10:00 情報処理 11:00 サイズ セレクション12:00 13:00 サンプリング 精製・定量 14:00 DNA抽出 15:00 シークエンス 16:00 制限酵素 処理 アダプター 付加17:00 SNPリスト DNA調整からSNPリストまで最短で5日
  7. 7. 情報処理 FastQ Bowtie2 SAM BAM BCF VCF Filtering CNV-seq CNVs SNPs Indels SAMtools BCFtools VCFtools SAMtools ファイ ル ソフト 結果 手作業 Reference FASTX- toolkit
  8. 8. RAD-Seqの成功のポイント 1. 制限酵素選び 2. ゲノム中のSNP密度 3. ゲノム中のSNP分布
  9. 9. トマトゲノム中の制限酵素サイト数 制限酵素サイト数 0 50,000 100,000 150,000 200,000 250,000 300,000 350,000 400,000 450,000 500,000 SalI PstI EcoRI HindIII MspI Numberofrestrictionsites 制限酵素断片数(300-900 bp) 0 10,000 20,000 30,000 40,000 50,000 60,000 70,000 80,000 SalI - PstI PstI - EcoRI EcoRI - HindIII PstI - MspI Numberofrestrictionfragments
  10. 10. RAD-SNP数と制限酵素断片数との関係 SalI - PstI PstI - EcoRI EcoRI - HindIII PstI - MspI y = 0.281x - 2129.8 R² = 0.995 0 2,000 4,000 6,000 8,000 10,000 12,000 14,000 16,000 18,000 20,000 0 10,000 20,000 30,000 40,000 50,000 60,000 70,000 80,000 #RAD-SNPs No. of fragments (300-900 bp)
  11. 11. RAD-SNPのゲノム中の位置 0% 20% 40% 60% 80% 100% WGS SalI - PstI PstI - EcoRI EcoRi - HindIII PstI - MspI Intergenic SNPs Genic SNPs
  12. 12. 6品種における全ゲノムSNP数 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 SNPs/10kb
  13. 13. RAD-SNP数と全ゲノムSNP数との関係 Regina Micro-Tom M82 Moneymaker San Marzano Ailsa Craig y = 0.0237x - 1849.3 R² = 0.7304 0 5,000 10,000 15,000 20,000 25,000 30,000 0 200,000 400,000 600,000 800,000 1,000,000 1,200,000 #RAD-SNPs #Genome-wide SNPs
  14. 14. F2集団からデータを取る 0 100 200 300 400 500 600 700 800 Numberofeads(k) F2 lines ゲノムの0.6%を15xの厚みでカバーする データが得られた。
  15. 15. RMF2-01 RMF2-02 RMF2-96 Micro-TomRegina x ↓ F1 … Index-01 Index-02 Index-96… MiSeq Fastq-01 Fastq-02 Fastq-96… BAM-01 BAM-02 BAM-96… F2-VCF Filtered VCF Imputed VCF Index-REG Index-MT Fastq-REG Fastq-MT BAM-REG BAM-MT P-VCF Filtered VCF Excluding identical loci 解析の流れ F2 lines Seq. library Sequencing Seq. data Mapping SNP calling Filtering Imputing Applications Cleaning
  16. 16. 欠失データの補間 補間前 補間後
  17. 17. 連鎖地図と物理地図の比較 1.2 M SNPs (WGS) vs 1.3 K SNPs (RAD-Seq)
  18. 18. まとめ • RAD-Seqの成功のポイント – 制限酵素選び – ゲノム中のSNP密度 – ゲノム中のSNP分布 • RAD-Seq・GBSの次にあるもの • 情報解析のことをよく知る(逆も然り) – 自分でできなくて良い – できても良い – 計算機でできること・できないことを知る – お互いの理解を深める

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