Tecnología del ADN Recombinante

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Tecnología del ADN Recombinante

  1. 1. ADN Recombinante<br />ADN recombinantees una molécula que proviene de la unión artificial de dosfragmentos de ADN. <br />Por lo tanto, la tecnología de ADN recombinantees el conjunto de técnicas que permiten aislar un gen de un organismo, para su posterior manipulación e inserción en otro diferente. <br />De esta manera podemos hacer que un organismo (animal, vegetal, bacteria, hongo) o un virus produzca una proteína que le sea totalmente extraña<br />
  2. 2. ADN Recombinante<br />Estas técnicas se emplean normalmente para la producción de proteínas en gran escala, ya que podemos hacer que una bacteria produzca una proteína humana y lograr una superproducción, como en el caso de la insulina humana, que actualmente es producida por bacterias en grandes recipientes de cultivo, denominados biorreactores. Como las bacterias se multiplican muy rápidamente y pueden expresar grandes cantidades de proteínas, es posible lograr una sobreproducción de la proteína deseada. <br />A esto justamente se dedica la biotecnología, es decir a la utilización de organismos vivos o de sus productos con fines prácticos. <br />
  3. 3. El desarrollo de la tecnología del ADN recombinante fue posible gracias a varias líneas de investigación:<br />El conocimiento de las enzimas de restricción <br />La replicación y reparación de ADN<br />La replicación de virus y plásmidos <br />La síntesis química de secuencias de nucleótidos<br />
  4. 4. Tijeras moleculares: enzimas de restricción<br />En 1975 Daniel Nathans y Hamilton O. Smith descubrieron un tipo de proteínas –las enzimas endonucleasas o enzimas de restricción- que actúan como “tijeras moleculares”, cortando la doble cadena de ADN a través del esqueleto de fosfatos sin dañar las bases. El descubrimiento de estas enzimas condujo a dichos microbiólogos al Nobel en 1978 y dio origen a la ingeniería genética.<br />Daniel Nathans Hamilton O. Smith<br />
  5. 5. Tijeras moleculares: enzimas de restricción<br />Las enzimas de restricción son producidas por bacterias como método de defensa contra virus y degradan el ADN extraño. <br />A su vez, el propio genoma bacteriano está protegido contra sus enzimas de restricción mediante metilaciones (es decir, el agregado de un grupo metilo [-CH3)]) en un átomo específico de ciertos nucleótidos.<br />Estas moléculas son indispensables para la ingeniería genética, ya que producen fragmentos que se pueden unir entre sí fácilmente (con la ayuda de la enzima ligasa). <br />Las enzimas de restricción cortan dejando extremos cohesivos . Generados cuando la enzima corta las dos hebras asimétricamente, dejando los extremos de cada hebra de simple cadena complementarios entre sí. <br />
  6. 6. Veámoslo gráficamente para hacernos una idea más clara:<br />
  7. 7. ¿Cómo introducir ADN recombinante en las bacterias?<br />Una vez que se supo cómo fabricar ADN recombinante usando enzimas de restricción y ligasas, el desafío siguiente fue cómo producir grandes cantidades de genes y cómo introducirlos en bacterias u otras células huésped.<br />El primer problema fue solucionado con el uso de plásmidos, pequeñas moléculas de ADN circular presente en muchas bacterias. <br />Los plásmidos contienen uno o más genes de resistencia a antibióticos y son capaces de autorreplicarse, ya que contienen una secuencia de iniciación. Esto les permite replicarse de manera independiente del ADN genómico<br />
  8. 8. ¿Cómo introducir ADN recombinante en las bacterias?<br />Cortamos el ADN circular del plásmido con enzimas de restricción, para generar extremos cohesivos.<br />Cortamos el ADN que queremos multiplicar. Debemos asegurarnos de que los extremos del plásmido y los del ADN a insertar sean complementarios y puedan unirse.<br />Unimos el gen que queremos introducir (inserto) por medio de la enzima ADN-ligasa y luego introducimos el plásmido con inserto en bacterias.<br />Seleccionamos las bacterias que hayan introducido el plásmido con la ayuda de antibióticos. Dado que los plásmidos contienen un gen de resistencia a antibiótico, al exponer las bacterias a ese antibiótico, sólo las que hayan incorporado el plásmido (y con él la resistencia) sobrevivirán, mientras que las que no lo tengan morirán.<br />
  9. 9. ¿Cómo introducir ADN recombinante en las bacterias?<br /> Esta es una manera relativamente eficaz de obtener millones de copias del ADN incorporado. Dado que todas las copias del gen provienen de una sola molécula multiplicada a partir de una única bacteria que dio origen a la colonia, esta técnica lleva el nombre de clonación. El término clon proviene de la jardinería; desde hace siglos los jardineros generan plantas nuevas a partir de gajos. Estas plantas son genéticamente idénticas y constituyen un clon. Un clon es un grupo de células u organismos genéticamente idénticas. El uso fragmentos de ADN como vectores cumple un rol fundamental en la ingeniería genética, ya que sirven para transferir material genético de un organismo a otro. Vector: cualquier organismo o virus capaz de mover genes de un organismo a otro<br />
  10. 10. ¿Cómo amplificar el ADN? Reacción en cadena de la polimerasa<br />Durante las décadas de 1970-1980, la manera más práctica de hacer múltiples copias de una secuencia particular de ADN era introduciendo una molécula de ADN recombinante (un plásmido más un gen) en una célula huésped. Esto podía resultar un poco engorroso, ya que muchas veces se disponía de una cantidad muy pequeña de m A mediados de la década de los 80, la invención de una técnica capaz de generar centenares de miles de copias de una secuencia sin la necesidad de clonarla en ningún tipo de vector resolvió este problema.<br />KaryMullis, un bioquímico americano que trabajaba sintetizando <br /> ADN, resolvió este problema con la invención de la reacción en cadena <br /> de la polimerasa moléculas de ADN para realizar pruebas<br />
  11. 11. ¿Cómo amplificar el ADN? Reacción en cadena de la Polimerasa<br />
  12. 12. ¿Cómo amplificar el ADN? Reacción en cadena de la polimerasa<br />Esto la convierte en una importante, si no imprescindible, herramienta para el análisis de filiación o de criminalística forense, ya que con sólo una pequeñísima muestra se pueden realizar diferentes estudios comparativos que nos permiten conocer el dueño de un “rastro” genético en particular.<br />También se usa para el desarrollo de nuevas estrategias de diagnóstico médico, como la detección de virus o de mutaciones que provocan enfermedades genéticas, a partir de una muestra de ADN tan pequeña como un cabello o una gota de sangre.<br />Otra aplicación de la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa es la transcripción inversa de ARNm. Mediante el uso de una enzima de origen viral denominada transcriptasa reversa puede usarse como molde una molécula de ARNm, transcribirla a una secuencia de ADN, y luego ser amplificada como cualquier otra secuencia por la reacción en cadena de la polimerasa, con lo que se obtiene una gran cantidad de ADN a partir de unas pocas moléculas de ARNm. Esta técnica es muy empleada para el estudio de expresión génica, así como para la producción de proteínas en diferentes organismos. <br />
  13. 13. ¿Cómo encontrar el gen adecuado? Imanes biológicos: sondas y anticuerpos<br />Hasta hace relativamente poco, encontrar un gen en un genoma era como encontrar una aguja en un pajar. Si tuviéramos que realizar dicha tarea, probablemente usaríamos un imán para atraer la aguja (siempre y cuando esta sea de metal y posea propiedades magnéticas). De manera análoga, hoy día podemos encontrar genes o proteínas usando, respectivamente, sondas y anticuerpos, que actúan como imanes moleculares.<br />Las sondas son fragmentos de ADN o ARN de simple cadena complementarias a la región de ADN o ARN que queremos encontrar. Contienen alguna “marca” que permite revelar su unión (hibridación) a la secuencia elegida y de esa manera revela presencia de la región buscada.<br />
  14. 14. ¿Cómo se marcan esas sondas o fragmentos de ácidos nucleicos?<br />Una de las técnicas más empleadas para localizar fragmentos determinados del genoma (o la expresión de algún gen en particular por medio de la detección de la presencia de su correspondiente ARNm) es la hibridación in situ<br />
  15. 15. Durante este proceso se incuba el ADN con una sonda (de ADN o ARN) complementaria a la secuencia buscada, y marcada radiactiva o químicamente. <br />La sonda “navega” por el interior de la célula hasta encontrar una secuencia complementaria a ella. <br />Una vez que esto ocurra se formará una doble cadena que permitirá no sólo detectar la presencia de esta secuencia, sino indicar el lugar específico que ocupa dentro de la célula. Si se tratara de un fragmento de un cromosoma, nos permitiría saber su localización exacta o locus.<br />Para revelar la presencia de hibridación de la sonda, la muestra debe exponerse a una placa radiográfica; en el caso de las sondas marcadas químicamente se procede a su revelado mediante el uso de moléculas fluorescentes o que puedan ser detectadas por colorimetría (utilizando una enzima que provoque el cambio de color de un sustrato).<br />
  16. 16. ¿Cómo estudiar la expresión de diversos genes?<br />Si visitamos un laboratorio de biología molecular, probablemente encontraremos una cuba con un gel al cual se le aplica una corriente eléctrica. Este método, llamado electroforesis en gel, es muy usado para separar moléculas de diversos tamaños y es la base de las técnicas que describiremos para identificar ADN, ARN, y proteínas. En los párrafos siguientes describiremos entonces la electroforesis para poder comprender luego cómo funcionan las demás técnicas.<br />La electroforesis en gel es uno de los métodos más utilizados en los laboratorios para separar ácidos nucleicos o proteínas, de acuerdo con su tamaño. <br />
  17. 17. Electroforesis en gel<br />
  18. 18. ¿Cómo estudiar la expresión de diversos genes? Southern, Northern y Western Blot<br />Existen diferentes técnicas que emplean la separación en gel por electroforesis que acabamos de ver como primer paso para identificar la presencia de determinadas moléculas dentro de una muestra. Una de ellas fue inventada por Edward M. Southern en 1975 para la detección de ADN.<br />Como por ejemplo la NorthernBlot, que consiste en que una vez finalizada la corrida en el gel, se realiza la transferencia (o blotting) de las muestras a una membrana para su posterior revelado<br />
  19. 19. NorthernBlot<br />Luego se utilizo el mismo sistema para el ARN y se le denominó NorthernBlot<br />
  20. 20. Estas dos técnicas persiguen fines distintos: el SouthernBlot, que detecta la presencia de ciertas secuencias en el ADN, se usa, por ejemplo, para estudiar mutaciones en el genoma. El Northern, en cambio, permite detectar qué genes son transcriptos en determinadas condiciones. Hemos visto que dos células del mismo organismo se distinguen por los genes que expresan y no por su ADN. <br />
  21. 21. Si luego queremos detectar proteínas, usaremos otra técnica similar: el Western Blot, que deriva de la electroforesis en gel y separa proteínas mediante la utilización de anticuerpos específicos. <br />
  22. 22. ¿Cómo sacar fotos de genes activados? Microarreglos<br />Los ensayos con microarreglos son rápidos de realizar, pero muy engorrosos de analizar. Además, están muy limitados a los genes que ya se conocen. Permiten obtener un pantallazo rápido sobre qué está pasando en la célula en ese momento determinado, en cuanto a qué genes están encendidos y cuáles apagados. Sin embargo, los resultados obtenidos nunca deberían ser concluyentes, sino que tendrían que ser validados mediante otras técnicas (por ejemplo, NorthernBlot).<br />

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