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Seminario Bio Mol

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Estudiantes Medicina UPB Colombia

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Seminario Bio Mol

  1. 1. Cloning and Expression of Randomly Mutated Bacillus subtilis α -Amylase Genes in HB101 Mohammed Rabbani, Hamid MirMohammad Sadeghi, Fatemeh Moazen, Mehran Rahimi adn Golnaz Salehi Daniel Mejía Arrieta Jesús David Marulanda Uribe Medicine Students III Semester UPB 2011
  2. 2. Introduction and Majorities <ul><li>Bacillus </li></ul><ul><li>Its a grampositive bacillus (4-10 µm) </li></ul><ul><li>They have rod form with straigth edges forming chains </li></ul><ul><li>It can be strict aerobic or facultative anaerobic </li></ul><ul><li>They can create extremely resistent spores to the enviromental changes </li></ul>
  3. 3. <ul><li>The colouring used for the endospores is the Wirtz-Conklin tecnique </li></ul>Introduction and Majorities
  4. 4. <ul><li>Subtilis </li></ul><ul><li>It’s an ubiquitous bacterium commonly recovered from water, soil, air, and decomposing plant residue </li></ul><ul><li>As a specie of the Bacillus , it can form an endospore providing protection against heat and dessication of the environment. </li></ul><ul><li>It produces a variety of proteases and other enzymes that enable it to degrade a variety of natural substrates. </li></ul>Introduction and Majorities
  5. 5. <ul><li>Amylase </li></ul><ul><li>It´s a proteic hydrolytic enzime that allows the catabolism of the starch and others carbohidrates. </li></ul><ul><li>Catalyzes the rupture of the glycosidics bonds α 1-4 producing dextrines and a mix of maltose, isomaltose and glucose. </li></ul><ul><li>Three different forms: α , β and γ with a similar function </li></ul>Introduction and Majorities
  6. 6. <ul><li>Amylase Genes </li></ul><ul><li>Two types of amylase: Pancreatic and salivary. </li></ul><ul><li>All genes in 1p21, which means are positioned in subregion 21 of short arm, chromosome 21 </li></ul><ul><li>Pancreatic genes: Type A: AMY2A Type B: AMY2B </li></ul><ul><li>Salivary Genes: α type: AMY1A β type: AMY1B </li></ul><ul><li>γ type: AMY1C </li></ul>Introduction and Majorities
  7. 7. <ul><li>HB101 </li></ul><ul><li>HB101 competent Escherichia coli is a classic strain for general cloning purposes </li></ul><ul><li>It contains the rec A13 mutation that minimizes recombination and aids in insert stability. </li></ul><ul><li>It carries too the hsd S20(r B - m B - ) restriction to prevent the cleavage of cloned DNA by restriction enzymes </li></ul>Introduction and Majorities
  8. 8. Introduction and Majorities Research Correlation
  9. 9. Introduction and Majorities
  10. 10. General Objective <ul><li>Isolate the amylase genes from B. subtilis to mutate the DNA sequence with the PCR error prone and determine a more functional and effective enzyme for industrial and economic proposes </li></ul>
  11. 11. Materiales y Métodos
  12. 12. Materiales y Métodos
  13. 13. Materiales y Métodos <ul><li>Cultivo </li></ul><ul><li>Todas las cepas fueron cultivadas en medio de Luria-Bertani (LB): </li></ul><ul><li>pH 7.2 ajustado con NaOH </li></ul><ul><li>37 C° </li></ul><ul><li>Centrifuga a 220 rpm </li></ul><ul><li>Ampicilina 50 μ g/ml a concentraciones finales idénticas en todos los platos. </li></ul>
  14. 14. <ul><li>Aplicación del Cultivo </li></ul><ul><li>Son empleados para el aislamiento y mantenimiento de cultivos puros de bacterias y también son utilizados para la identificación de bacterias de acuerdo a sus propiedades bioquímicas y fisiológicas. </li></ul><ul><li>Permiten la proliferación como tal de la cepa y de la mutación a realizar para facilitar el estudio y el análisis de los resultados obtenidos. Cimenta la base de crecimiento para el B. Subtilis </li></ul>Materiales y Métodos
  15. 15. Materiales y Métodos <ul><li>Extracción de DNA </li></ul><ul><li>Kit de preparación de alta pureza para PCR (roche): </li></ul><ul><li>Las células se cosecharon en fase de crecimiento mediante centrifugación y suspendidas en el amortiguador PBS. </li></ul><ul><li>Las células fueron tratadas con Lisozimas durante 30 minutos a 37 grados y luego con proteinasa K a 72 grados durante 10 minutos. </li></ul><ul><li>El DNA fue precipitado con 0.6 volúmenes de isopropanol y cosechados por centrifugación </li></ul>
  16. 16. <ul><li>Aplicación de la Extracción del DNA </li></ul><ul><li>La purificación del DNA mediante su extracción permitió identificar el gen de la amilasa del B. Subtilis y aislarlo para lograr su mutación y determinar nuevamente su acción catalítica como tal, a apartir de los cambio logrados por la técnica del PCR. </li></ul>Materiales y Métodos
  17. 17. <ul><li>PCR </li></ul>Materiales y Métodos
  18. 18. <ul><li>Aplicación del PCR </li></ul><ul><li>A partir del aislamiento del gen de la amilasa, su mutación aleatoria se dio por la técnica del PCR permitiendo la transformación a las cepas de E.coli. </li></ul><ul><li>Los plásmidos que fueron digeridos Nco I/ BamH I permitió el aislamiento y la inserción del gen en el vector pET-15b para luego transformarse como tal en el E.coli HB101 para su propagación y posterior reconocimiento. </li></ul>Materiales y Métodos
  19. 19. Materiales y Métodos Ensayo Enzimático
  20. 20. <ul><li>Aplicación del Ensayo Enzimático </li></ul><ul><li>La comparación de la acción catalítica de ambos genes mediante el método del ácido dinitrosalicílico y las diversas condiciones de temperatura y concentraciones de carbohidratos. </li></ul><ul><li>La evaluación de un minuto para la liberación de almidón permite determinar la potencia catalítica de la amilasa antes y después de su mutación, con las deliberadas conclusiones. </li></ul>Materiales y Métodos
  21. 21. Materiales y Métodos Enzimas de Restricción <ul><li>Enzimas que reconocen y cortan secuencias especificas de nucleótidos en el DNA. </li></ul><ul><li>Esciden los enlaces fosfodiester del material genético a partir de una secuencia que reconocen. </li></ul><ul><li>Eco RI  E = género Escherichia </li></ul><ul><li>                    co = especie coli </li></ul><ul><li>                    R = cepa RV 13 </li></ul><ul><li>                     I = primera endonucleasa aislada de esta cepa </li></ul><ul><li>Pueden producir cortes romos y pegajosos </li></ul><ul><li>Su sitio típido de restricción, es un palíndrome exacto de 4,5,6,7 u 8 bases, en donde se da la variación del tamaño del corte. Ej: Sitio reconocimiento de Eco RI es GAATTC </li></ul>
  22. 22. <ul><li>Aplicación de Enzimas de Restricción </li></ul><ul><li>Resultan vitales para la localización del gen mutado y que su funcionalidad no se altere al insertarlo correctamente, generando varias bandas de agarosa en tal caso. </li></ul><ul><li>Los cortes dados por las Nco I/ BamH I permitió el aislamiento del gen y su posterior inserción en las cepas. </li></ul>Materiales y Métodos
  23. 23. Resultados
  24. 24. Resultados <ul><li>Figura 1 </li></ul><ul><li>Amplificación gen </li></ul><ul><li>de la α -amilasa BS168 </li></ul><ul><li>A: Amplificación gen α -amilasa </li></ul><ul><li>Línea 1: Marcador peso molecular DNA </li></ul><ul><li>Línea 3: Producto PCR </li></ul><ul><li>B: Producto error-prone PCR del gene α -amilasa </li></ul><ul><li>Línea 1: Marcador peso molecular DNA </li></ul><ul><li>Línea 2-3: Productos </li></ul><ul><li>error-prone PCR </li></ul>A B
  25. 25. Resultados <ul><li>Figura 2 </li></ul><ul><li>Digestión del plásmido pET-15b que contenía la α -amilasa, por la enzima de restricción Eco RI </li></ul><ul><li>Línea 1: Marcador peso molecular </li></ul><ul><li>Línea 2,3,4,5,6 y 7: Plásmido pET-15b digerido abarcando el gen de la α -amilasa con la enzima de restricción Eco RI </li></ul>
  26. 26. B Discussions
  27. 27. Reference Statement Accomplished y/n 11. D. Hanahan The recombinant plasmids were transformed into E. coli XL1Blue and HB101, using the Hanahan protocol   Yes 12. K. A. Laderman, K. Asada, T. Uemori et al. The presence of -amylase gene was determined at 92°C using the 12/KI method as described previously   Yes 14. M. Simonen and I. Palva At present, about 60% of the commercially available enzymes are produced by Bacillus species, mostly being homologous proteins that are naturally secreted in the growth medium such as alkaline proteases as washing agent or amylases for the starch industry   No 15. F. Kunst, N. Ogasawara, I. Moszer et al. The advantage of B. subtilis 168 over other bacterial strains has been increased even more by the availability of the complete sequence of the B. subtilis 168 genome   Yes
  28. 28. Final Conclusions <ul><li>We have concluded that different strains of diverse species like B. Subtilis in this case, provides more power and effectiveness in enzymatic process like the catabolism of the starch, according to the amylase. </li></ul><ul><li>Proteing engineering techniques can improve the scientific research manipulating the DNA sequence for a better improvement in the proteic function of an enzyme, looking for different purposes. </li></ul>
  29. 29. <ul><li>The error-prone PCR method could allow a benign mutagenesis of a target protein for clinical uses like medical treatments in diverse afectations, for example enzymatics mutations because of chromosomics defects. </li></ul><ul><li>The correct use of the transformation vector HB101 and the restriction enzymes fulfill the objective of the improvement in an catalytic function to develop new methods and techniques in the scientific research for clinical purposes, leaving behind commercial and economics interestings. </li></ul>Final Conclusions
  30. 30. Mapas Conceptuales <ul><li>Daniel Mejía </li></ul><ul><li>Jesús David Marulanda </li></ul>
  31. 33. GRACIAS

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