Citogenética chapulín Universidad Autónoma de Madrid

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Práctica de Citogenética de Insectos.
Universidad Autónoma de Madrid.

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Citogenética chapulín Universidad Autónoma de Madrid

  1. 1. http://www.uam.es/departamentos/ciencias/biologia/citologia/practica1.htm 1/10 Espermatogénesis en invertebrados (ortópteros). Aplastados y secciones histológicas de testículo de ortóptero. Espermatogénesis. Existe un proceso celular destinado a producir células idénticas genéticamente: la mitosis. Por el contrario, la mayoría de los organismos vivos utilizan parte de su vida o tejidos especializados para producir células esencialmente diferentes de las progenitoras en cuanto a las combinaciones posibles de su material hereditario. Este mecanismo celular está enclavado en un proceso especial de división celular: la meiosis. En organismos superiores la meiosis tiene lugar en los órganos sexuales tanto masculinos como femeninos, dentro de un proceso general que se denomina respectivamente espermatogénesis y ovogénesis. Tanto uno como otro no sólo producen células diferentes genéticamente, sino que reducen el número de cromosomas de las células a la mitad y las modifica para poder ser fecundadas o fecundar dependiendo del sexo donde se realice. ESPERMATOGÉNESIS Ham, discípulo de Leuwenhoek, observa por primera vez en 1677 en el semen humano la presencia de unos "animáculos" móviles que muchos científicos de la época consideraron como parásitos o simbiontes. En 1780 Spallanzani comprueba que si del semen eran eliminados estos cuerpos móviles, éste perdía su capacidad fertilizante. Pero fue en la segunda mitad del siglo XIX cuando se concluyó que estos "animáculos" eran los gametos masculinos, y se les denominó espermatozoides. De esta forma se estableció que los espermatozoides se originaban en los testículos y que poseían núcleo y citoplasma: eran células. Desde este momento y hasta nuestros días la morfología de los espermatozoides y de las células que les dan origen ha sido ampliamente estudiada. En una primera etapa de la citología clásica, empleando cortes en parafina, no sólo se describen gran cantidad de formas distintas de espermatozoides, sino que también se pone gran interés en el estudio de los tejidos en los que se originan. Posteriormente, con el avance de la técnica y la aparición del microscopio electrónico, se determina la ultraestructura de los espermatozoides y de las células intermedias en su formación. Figura 2. Reconstrucción fotográfica de una sección de un túbulo seminífero de saltamontes en el que se observa la disposición secuencial de las células que cursan la espermatogénesis. Figura 1. El señor y la señora de Eyprepocnemis plorans.
  2. 2. Práctica 1. Espermatogénesis en invertebrados http://www.uam.es/departamentos/ciencias/biologia/citologia/practica1.htm 2/10 La introducción de nuevas técnicas de estudio como pueden ser las citoquímicas para microscopía óptica y electrónica, la aplicación de microscopía de barrido, el empleo de anticuerpos marcados a nivel morfológico y ultraestructural, la microscopía confocal o metodologías puramente bioquímicas han ayudado a un mejor conocimiento del proceso de formación de los gametos masculinos, la espermatogénesis. Desde antiguo recibió gran atención el proceso de cómo se formaban estas células, ya que a partir de una célula prácticamente indiferenciada, la espermatogonia, se produce una complicada y a veces dramática serie de cambios morfofuncionales que desembocan en la formación del espermatozoide: la espermatogénesis. Podríamos definir la espermatogénesis como el conjunto de cambios que ocurren en una célula prácticamente indiferenciada, espermatogonia, y que tienen como final la formación de una célula altamente especializada, con un número “n” de cromosomas recombinados, una carga “c” de ADN y que es capaz de fecundar: el espermatozoide. Teniendo en cuenta los cambios que se producen en la espermatogonia, y por tanto los nuevos tipos celulares y los procesos en los que participan, podemos dividir a la espermatogénesis como proceso en las siguientes etapas: a) Proliferación. b) Crecimiento y meiosis: recombinación, división y reducción. c) Espermiogénesis o histodiferenciación. a) Proliferación. Este período comprende el desarrollo de las espermatogonias, las cuales se dividen no sólo aumentando la población celular sino manteniendo la población troncal existente. Las divisiones de población espermatogonial llegan en algunas especies hasta ocho. Así, partiendo de una espermatogonia inicial, van surgiendo por divisiones sucesivas grupos de ellas que, normalmente, se encuentran interconectadas por sus citoplasmas. El número final de gonias presentes en un cisto, indicará por lo tanto las veces que se han dividido a partir de la espermatogonia primordial. De esta forma un cisto con doscientas cincuenta y seis gonias revela la existencia previa de ocho divisiones mitóticas. En esta fase de divisiones rápidas y continuas es fácil observar el cariotipo de la especie. b) Crecimiento y meiosis. La meiosis se caracteriza por presentar dos divisiones sucesivas del material hereditario (División I y División II) precedidas por un único período S (de síntesis de ADN). La profase de la primera división meiótica es extremadamente larga pudiendo durar desde días (en machos) hasta años (generalmente en hembras). Para su estudio, se ha dividido en base a la morfología del núcleo celular en varias etapas: leptotene, cigotene, paquitene, diplotene y diacinesis. PRIMERA DIVISIÓN MEIÓTICA INTERCINESIS SEGUNDA DIVISIÓN MEIÓTICA PROFASE I: PROFASE II - LEPTOTENE PROMETAFASE II - CIGOTENE METAFASE II - PAQUITENE ANAFASE II - DIPLOTENE TELOFASE II - DIACINESIS PROMETAFASE I METAFASE I ANAFASE I TELOFASE I
  3. 3. Práctica 1. Espermatogénesis en invertebrados http://www.uam.es/departamentos/ciencias/biologia/citologia/practica1.htm 3/10 Durante la prometafase los bivalentes experimentan movimientos de congresión hasta alinearse finalmente en placa en la metafase. En la primera anafase meiótica los cromosomas homólogos, que previamente se han recombinado, migran completos a polos opuestos. Tras una interfase muy corta y a veces inexistente denominada intercinesis, se efectúa la segunda división meiótica. Ésta es esencialmente igual que una división mitótica convencional con la excepción de que cada célula solamente posee un complemento cromosómico de la especie ya recombinado. El resultado final es la formación, por cada una de las células que entró en la profase I, de cuatro células con “n” cromosomas y una carga "c" de ADN: las espermátidas. Figura 3. Espermatogénesis de Locusta migratoria en cortes de testículo teñidos con tricrómico de Masson (I). A.- Detalle de un túbulo seminífero en el que se aprecia la estructura celular en cistos. B.- Espermatogonia. El cromosoma sexual aparece marcado (X). C.- Espermatocito en división (telofase I) en el que se observa el huso de microtúbulos (cabeza de flecha).
  4. 4. Práctica 1. Espermatogénesis en invertebrados http://www.uam.es/departamentos/ciencias/biologia/citologia/practica1.htm 4/10 Figura 4. Espermatogénesis de Locusta migratoria en cortes de testículo teñidos con tricrómico de Masson (II). Espermátidas en distintos estados de maduración. Obsérvese la paulatina condensación de la cromatina y modificación del núcleo y los adjuntos centriolares (cabezas de flecha). A.- Espermátidas tempranas, en las que aún no se detecta el adjunto centriolar. La que se encuentra a la derecha es diploide, aberrante. B.- Espermátida aberrante, poliploide, con dos adjuntos centriolares. C y D.-Espermátidas redondas y lanceoladas en las que se observa el adjunto centriolar en la base de la cabeza (cabezas de flecha). Con esta técnica de tinción se aprecian los flagelos (flechas). c) Espermiogénesis. Se conoce con este nombre a toda la serie de cambios tanto citoplásmicos como nucleares que sufren las espermátidas hasta convertirse en espermatozoides. Estos cambios morfofuncionales son muy variables y dependen de la especie estudiada. No obstante, y como rasgos generales, podemos decir que se centran en
  5. 5. Práctica 1. Espermatogénesis en invertebrados http://www.uam.es/departamentos/ciencias/biologia/citologia/practica1.htm 5/10 la compactación de la cromatina en el núcleo, la pérdida de casi la totalidad del citoplasma, la génesis de una vesícula acrosómica y la adquisición de un aparato locomotor por parte de la célula. Figura 5. Espermatóforos de Locusta migratoria en aplastados teñidos con la técnica de Feulgen. A.- Campo claro, donde únicamente se ven teñidos los núcleos. B.- Contraste de fase, que permite ver los flagelos de las espermátidas (cabezas de flecha). DESARROLLO DE LA PRÁCTICA En esta práctica se utilizarán dos tipos diferentes de material de trabajo así como dos metodologías completamente distintas. Por una parte se analizarán las diferentes fases de la espermiogénesis en preparaciones obtenidas mediante la técnica de aplastado a partir de testículos de ortópteros fijados en etanol y ácido acético en proporción 3:1. Por otra, estudiaremos la organización de las células que cursan la espermatogénesis y el túbulo seminífero en cortes de testículo de saltamontes fijado con Bouin e incluido en parafina. 1.- Aplastados de testículo de ortóptero teñidos con Feulgen. Seleccionamos testículos de ortópteros fijados en etanol y ácido acético 3:1 al menos con una semana de antelación y los colocamos en agua destilada para su hidratación durante 10 minutos. A partir de este momento conviene realizar todo el proceso en el mismo recipiente, preferiblemente plástico y no vidrio. No utilizar ningún elemento metálico. Hidrolizar los testículos en HCl 5N durante 30 min. Transcurrido este tiempo se lavan abundantemente en agua destilada. Posteriormente se introducen en reactivo de Schiff durante 30 minutos a temperatura ambiente. Este proceso es preferible realizarlo
  6. 6. Práctica 1. Espermatogénesis en invertebrados http://www.uam.es/departamentos/ciencias/biologia/citologia/practica1.htm 6/10 en oscuridad. Se lavan los testículos, que tendrán un color fucsia, en agua sulfurosa y posteriormente en agua del grifo, donde se almacenarán hasta la confección de los aplastados. Separamos un par de túbulos seminíferos del testículo y los colocamos sobre un portaobjetos. Sobre ellos se coloca inmediatamente una gota de ácido acético al 50% en agua destilada y se deja un par de minutos (¡Cuidado, no dejar secar el material!). Se coloca sobre el túbulo un cubreobjetos y utilizando la punta de un lápiz y con presión muy suave se dispersa el material. Con un trozo de papel de filtro se elimina el acético que ha rebosado por los laterales del cubreobjetos y, con cuidado de no moverlo, se realiza el aplastado presionando fuertemente con el dedo pulgar sobre una superficie completamente plana. Observar los aplastados en el microscopio tratando de determinar las diferentes etapas del proceso meiótico, así como las espermátidas en los diferentes estadíos de la espermiogénesis. 2.- Secciones de testículo de ortóptero teñido con tricrómico de Masson. El análisis de cortes de parafina supone la realización de tres procesos: la inclusión del material en un medio sólido, el corte y desparafinado del mismo y la tinción de los cortes (ver el anexo). Las secciones de testículo se observarán en el microscopio determinando la disposición de los túbulos seminíferos en el conjunto, así como las zonas apicales y basales de los túbulos.
  7. 7. Práctica 1. Espermatogénesis en invertebrados http://www.uam.es/departamentos/ciencias/biologia/citologia/practica1.htm 7/10 Figura 6. Células del testículo del saltamontes Chorthippus jucundus teñidas con orceína lacto-propiónica. A.- Núcleo de una espermatogonia en interfase. El cromosoma sexual ha sido señalado con una X. B.- Metafase espermatogonial. C.- Núcleo prepaquiténico. Posiblemente corresponde a un núcleo en leptotene. D.- Paquitene medio. E.- Paquitene tardío. F.- Diplotene. Se ha señalado la posición de los quiasmas (cabezas de flecha) en un bivalente monoquiasmático (M7), en uno con dos quiasmas (M4) y en un tercero que presenta cuatro (L1).
  8. 8. Práctica 1. Espermatogénesis en invertebrados http://www.uam.es/departamentos/ciencias/biologia/citologia/practica1.htm 8/10 Figura 7. Espermatocitos de Chorthippus jucundus teñidos con orceína lacto-propiónica. A.- Diplotene tardío-diacinesis. B.- Metafase-I. C.- Anafase-I. El cromosoma sexual X migra completo al polo superior de esta célula. D.- Telofase-I. E.- Intercinesis/Profase-II. La célula de la parte superior de la fotografía posee el cromosoma X, mientras que la de la parte inferior carece de él.
  9. 9. Práctica 1. Espermatogénesis en invertebrados http://www.uam.es/departamentos/ciencias/biologia/citologia/practica1.htm 9/10 Figura 8. Células del testículo de Chorthippus jucundus teñidas con orceína lacto-propiónica. A.- Metafase-II. Se observa la disposición radial de los cromosomas. B.- Anafase-II. Las cromátidas están comenzando a separarse. C.- Anafase-II. D.- Telofase-II. E.- Espermátidas tempranas. La situada en la parte superior de la fotografía posee el cromosoma sexual (X), mientras que la de la parte inferior carece de él. F,G,H- Espermátidas en diferentes estados de maduración: redondeada, lanceolada, alargada…
  10. 10. Práctica 1. Espermatogénesis en invertebrados http://www.uam.es/departamentos/ciencias/biologia/citologia/practica1.htm 10/10 Cuestiones. 1.- ¿Qué es una espermatogonia? ¿Dónde se localiza y qué dotación genética presenta? ¿Qué carga de ADN tiene? 2.- Realizar el dibujo de una espermatogonia de saltamontes e indicar cuál es la característica morfológica que la diferencia del resto de células en un aplastado de testículo de ortóptero en el que se ha teñido preferencialmente el núcleo. Dibuja una espermatogonia en un corte de túbulo seminífero de ortóptero. ¿Cuál es su posición en el túbulo? 3.- Dibujar los núcleos de espermátidas de saltamontes en distintas etapas de maduración tal y como se observan en un aplastado de testículo teñido con la técnica de “Feulgen”. Explica los cambios morfológicos que observas experimentan y cómo eres capaz de determinar cuál es más madura y cuál menos. 4.- Dibujar y rotular un túbulo seminífero completo de saltamontes indicando las diferencias entre los extremos proximal y distal. 5.- ¿Qué es un cisto? Dibujar uno y determinar en qué etapa se encuentran los espermatocitos que lo integran. ¿Cómo has llegado a esa conclusión? 6.- A partir de un corte de testículo de saltamontes, dibujar un cisto en el que estén presentes espermátidas tanto normales como aberrantes. ¿Por qué eres capaz de determinar que no son normales? 7.- ¿Qué es un espermatóforo? Dibuja uno de saltamontes.

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