Successfully reported this slideshow.
We use your LinkedIn profile and activity data to personalize ads and to show you more relevant ads. You can change your ad preferences anytime.

DNA en medicijnen (1)

1,512 views

Published on

  • Be the first to comment

DNA en medicijnen (1)

  1. 1. DNA EN MEDICIJNEN Hoe kun je met behulp van DNA een medicijn maken? Chiara Glen Cosmicus College, 5HA
  2. 2. 1
  3. 3. 2 Inhoud 1. Inleiding 3 2. Hoe zit DNA in elkaar? 5 3. Welke mogelijkheden zijn er binnen de wetenschap om met behulp van DNA een medicijn te maken? 8 3.1 DNA vaccinaties 3.2 Moderne biotechnologie 3.3 Gentherapie 3.4 Epigenetica 3.5 Optogenetica 8 10 12 14 15 4. Practica 16 4.1 Elektroforese met appels 4.2 DNA isoleren 16 30 5. Conclusie 32 6. Nawoord 35 7. Geraadpleegde literatuur 36 Bijlage 38 Tirumalai Kamala’s answer to: What is a DNA vaccine? 38
  4. 4. 3 1. Inleiding Keuze van het onderwerp Omdat ik al heel lang geïnteresseerd ben in de medische wereld, en vooral DNA, heb ik voor dit onderwerp gekozen. Toen ik keek naar een aflevering van de serie ‘Brave new World’ met Stephen Hawkings. Dacht ik: “laat ik me hier in verdiepen.” De aflevering ging over DNA en hoe menselijk DNA met elkaar vergeleken kon worden, om uit te vinden waarom twee hele verschillende personen heel lang en gezond konden leven; en hoe ze daarmee medicijnen konden maken. Werkwijze Ik besloot om uit te vinden welke technieken worden gebruikt om met behulp van DNA medicijnen te maken en hoe dat dan werkte. Hierbij gebruikte ik de kennis die ik al had opgedaan op school en bij mijn stage op de afdeling Pathologie in het Erasmus MC. Maar om me verder te verdiepen moest ik bronnenonderzoek doen. Ik begon bij mijn favoriete website: Quora, een forum waar je elk onderwerp kunt vinden dat je zoekt. Ok volg daar alle onderwerpen die ik leuk en interessant vindt, waaronder de onderwerpen die bij dit profielwerkstuk horen. Je kunt op dit forum vragen stellen, beantwoorden en lezen. Er zitten ook wetenschappers op dit forum, dus ik dacht, laat ik hier mijn vragen stelleen. Maar voordat ik dat deed keek ik of er andere mensen waren die mijn vragen of soortgelijke vragen al hadden gesteld. Op die manier vond ik een aantal Engelse sites die ik heb gebruikt voor mijn profielwerkstuk. Zelf heb ik ook een vraag gesteld waar ik uitgebreid antwoord op heb gekregen, wat ik in mijn profielwerkstuk heb verwerkt. Ik wilde ook weten hoe die technieken dan werkte en het leek mij wijs om daarbij een practicum te doen, natuurlijk was het ook geweldig om uit te voeren. De twee practica die ik gedaan heb, hebben mij veel geleerd over een bepaalde techniek, namelijk de ‘elektroforese’. Onderzoeksvraag De hoofdvraag die ik mijzelf stelde bij dit werkstuk was: “Hoe kun je met behulp van DNA medicijnen maken?” Om deze vraag te beantwoorden stelde ik de volgende drie deelvragen: 1. Hoe zit het DNA in elkaar? 2. Welke mogelijkheden hebben we binnen de wetenschap om met behulp van DNA medicijnen te maken? 3. Hoe kunnen we DNA vergelijken en zo zien welke genen de eigenschappen hebben die we willen in een medicijn?
  5. 5. 4 Opbouw van het verslag Om meer te weten te komen over DNA, besloot ik uit te zoeken hoe het in elkaar zat en schreef ik alles wat ik al wist op. Omdat DNA een groot onderwerp is en mijn werkstuk gaat over hoe je er medicijnen mee kan maken, heb ik alleen de belangrijkste dingen in mijn profielwerkstuk opgenomen. De tweede vraag gaat over de technieken en hoe die technieken gebruik maken van DNA om er medicijnen van te maken. Deze vraag is noodzakelijk om de hoofdvraag te kunnen beantwoorden. Als laatste heb ik met behulp van het practicum ‘elektroforese’ antwoord gegeven op de derde deelvraag. Deze vraag was meer een toevoeging aan de theorie dat was uitgelegd in deelvraag 2. Hier heb ik dus rekening mee gehouden bij de hoofdstukindeling. Met dit profielwerkstuk hoop ik jullie te kunnen informeren over hoe je met behulp van DNA medicijnen maakt.
  6. 6. 5 2. Hoe zit DNA in elkaar? DNA bestaat uit 2 strengen, een coderende streng (deze maakt de code die door het RNA wordt vertaald naar de structuren van de verschillende eiwitten) die wordt ook wel ‘sense’ genoemd, en een niet coderende streng, ook wel ‘antisense’. Het DNA bestaat uit heel veel genen, die weer bestaan uit een aantal nucleotiden, en die nucleotiden bestaan weer uit 3 dingen: - Een suikergroep - Een fosfaatgroep - Een stikstofbasen Er zijn vier verschillende stikstofbasen, Adenine, Thymine (wordt door het RNA vertaald naar Uracil), Guanine en Cytosine. Adenine en Thymine vormen een binding en Guanine en Cytosine vormen een binding. De binding tussen de basenparen zijn waterstofbruggen gevormd tussen en NH-groep en een OH- groep. Adenine en Thymine hebben 2 waterstofbruggen die ze bijeenhouden, Guanine en Cytosine hebben er 3.
  7. 7. 6 In totaal kan het DNA 20 aminozuren maken en het heeft een start- en stopcodon. De startcodon geeft aan wanneer de ribosoom moet beginnen met het aflezen van de mRNA. De stopcodon geeft aan wanneer de ribosomen daarmee moeten stoppen. Het aantal en de volgorde van de aminozurenreeks is bepalend voor wat voor eiwit/enzym er gevormd wordt. Dat kun je zien nadat het RNA door de ribosomen is afgelezen. De structuur van het DNA (volgorde van de verschillende eiwitten) geeft aan hoe de persoon eruit gaat zien, of hij/zij ergens allergisch voor is, erfelijke ziektes heeft, ergens aanleg voor heeft, etc. Niet alleen het DNA speelt een rol bij de persoon die je wordt en hoe je eruit gaat zien, maar ook het milieu speelt hierbij een rol. Dat heet het fenotype. Milieu houd niet alleen in de buurt waarin je opgroeit als kind, maar ook in de baarmoeder begint dit al. Als je moeder rookt of drinkt tijdens de zwangerschap heeft dit ook gevolgen voor hoe je eruit komt te zien, en het kan ook je gedrag beïnvloeden. Net als stress en eetgewoontes. Het DNA zit in de chromosomen, en elke cel heeft 46 chromosomen, op de geslachtscellen en de rode bloedcellen na. Rode bloedcellen hebben helemaal geen chromosomen en ook geen DNA, geslachtscellen hebben er 23. De mens heeft ± 3 ∙ 109 bp (basenparen) verdeeld over de chromosomen. Ook hebben DNA eiwitten eromheen zitten om het compact te houden. Elke cel bevat 2 meter aan DNA, en we hebben 75 triljoen cellen in ons lichaam. Als je dus al het DNA achter elkaar legt, uitgespreid, dan krijg je een afstand die gelijk is aan 500x de afstand van de aarde tot de zon en terug. De reden dat er 2 meter DNA in een cel kan zitten is omdat het
  8. 8. 7 DNA heel erg gedraaid is en daarnaast nog gespiraliseerd. Je kan dat uitproberen met een elastiekje, als je het blijft draaien zie je dat het elastiekje steeds kleiner wordt. Dat is dus ook gebeurd met het DNA. DNA kan ook muteren. Je hebt verschillende mutaties en mutaties kunnen verschillende dingen veroorzaken, zoals het ontstaan van tumorcellen. Een voorbeeld van een mutatie is de puntmutatie. Hierbij veranderd 1 base, waardoor zijn basepaar ook veranderd, maar hierdoor word een heel ander eiwit gemaakt. Omdat er een ander eiwit wordt gemaakt gaat de cel zich opeens anders gedragen, het kan niet meer goed doen wat hij hoort te doen, dit merkt het lichaamen die probeert dat te veranderen, maar dit is heel moeilijk en werkt niet altijd. Hieronder zie je andere types schade die het DNA kan oplopen, samen met wat voor soort reparatie ervoor nodig is en de bijzonderheden van de reparatie.
  9. 9. 8 3. Welke mogelijkhedenzijn er binnen de wetenschap om met behulpvan DNA medicijnente maken? Deze vraag heb ik beantwoord met behulp van Quora en de serie Brave New World, gepresenteerd door Stephen Hawking. 3.1 DNA vaccinaties Laat ik beginnen met Quora. Deze vraag had ik daar namelijk geplaatst (in het Engels want het is een internationaal Forum met letterlijk elk onderwerp wat je maar kan bedenken) en ik kreeg er antwoord op. De vrouw die mij antwoordde heet Tirumalai Kamala, en is een Immunologist. Ze heeft een PhD. in Mycobacteriologie. Zij schreef mij het volgende: DNA vaccinaties is er een. Voor meer details zie bijlage: Tirumalai Kamala's answer to What is a DNA vaccine? Een goedgekeurde gentherapie is die voor Groeihormoon Releasing-Hormoon in varkens, goedgekeurd voor gebruik in Australië in 2008 Waarbij ze me een link gaf naar een uitleg die ze had gegeven op een andere vraag, dit kan je vinden in de bijlagen. Dit is een samenvatting van waar haar artikel over gaat: Een DNA vaccinatie is een bacteriële plasmide met een of meer genen van een parasiet, bacterie, virus of tumorcel. Deze genen worden gekoppeld aan een promotor, die wordt verkregen van een zoogdier. Nadat het vaccin in het lichaamvan de mens is geplaatst worden de genen vertaald door het RNA naar eiwitten. Die eiwitten worden aangevallen door het immuunsysteem die er antistoffen tegen maakt. We zijn al vanaf 1950 bezig om met behulp van DNA medicijnen te maken. Bij het maken van vaccins moet je veel keuzes maken en daarbij moet je de wettelijk bepaalde richtlijnen volgen. De keuzes die je moet maken zijn belangrijk voor de uiteindelijke effectiviteit van het vaccin. Een aantal van deze keuzes zijn: “Wat voor antigenen moeten worden gebruikt? Hoe moet het worden afgeleverd? Welke dosis moeten we geven?” Hoe DNA vaccinaties worden afgeleverd is veranderd sinds 1950. In het begin werden ze direct in de spieren gespoten. Dit zorgde echter voor een minder goede opname en de werking was minder goed. Toen kwam er een uitvinding genaamd het gen pistool. Dit pistool schoot DNA in de huid met behulp van drukgas, en het DNA had een laag met microdeeltjes goud als bescherming. Hierdoor verbeterde de opname, maar die verbetering was gering. Daarna werd de elektroporatie uitgevonden, waarbij eenvoudige elektroden elektrische pulsen genereren
  10. 10. 9 over het celmembraan, dit vergrootte tijdelijk de poriën in het celmembraan, wat de opname van DNA bevorderde. Een andere verbetering voor de opname van het DNA was een variant van het gen pistool, het deeltje-bemiddelde epidermale levering (PMED). Hier werd het DNA in de huid afgeleverd, in de keratinocyten. Verder is er nog de DNA tatoeage, dit is een nieuwere lever methode. Het zorgt voor een sterke immuunrespons doordat de tatoeage naalden de huid beschadigen. DNA vaccins hebben voordelen, maar ook nadelen. De voordelen zijn dat het makkelijker, goedkoper en veiliger is omdat er wordt gekozen voor gewone microbiële- of tumorgenen die waarschijnlijk sterke en specifieke immuun responsen veroorzaken en die zich in de plasmiden klonen. Verder is het natuurlijker omdat onze eigen lichamelijke cellen eiwitten maken die nodig zijn voor bescherming tegen de ziektes waarvoor je wordt ingeënt, en dit doen ze met behulp van de DNA vaccins. Ook is het makkelijker om deze vaccins te veranderen als het nodig is. Griep kan bijvoorbeeld snel muteren, waardoor je ook de samenstelling van het vaccin moet veranderen, dit kan gemakkelijk met de DNA vaccins. De laatste voordeel van DNA vaccins is dat ze praktischer en realistischer zijn. Plasmide DNA kan bij kamertemperatuur worden bewaard wat enorm veel kosten bespaard bij opslag en transport omdat ze geen koelkasten en gekoelde wagens hoeven te gebruiken. De nadelen zijn dat plasmide DNA zich kan integreren in het DNA van de cel. Dit heeft op zijn minst drie negatieve gevolgen, wat afhankelijk is van de plaats waar de DNA plasmide wordt ingebracht. Het kan een oncogene aanzetten, het kan een tumor supressor gen uitzetten of het kan de chromosomale instabiliteit op gang brengen. Verder is het niet bruikbaar voor polysacharide vaccins, dus er zijn geen DNA vaccins voor ziektes zoals pneumokokken en meningokokken, waar immuun responsen noodzakelijk zijn om deze ziektes te voorkomen. De laatste nadeel van DNA vaccins is dat er een risico is van auto-immuniteit. Dit kan gebeuren als ons eigen DNA gemeenschappelijke elementen heeft met het DNA van het vaccin, het is gelukkig nog niet gezien bij de mens. Tot nu toe werken DNA vaccinaties vooral goed bij muizen, maar hebben ze niet het gewenste resultaat bij de mens. Desondanks zijn er vier vaccinaties die wettelijk zijn toegestaan voor gebruik op mensen, dit zijn: 1. West-Nijl virus, paarden, USA 2. Besmettelijke hematopoietische necrose virus, zalm, Canada 3. Melanoma, honden, USA 4. Groeihormoon Releasing-Hormoon, varkens, Australië Om het gewenste resultaat van een DNA vaccin bij de mens te krijgen is nog een lange weg te gaan maar er is zeker progressie.
  11. 11. 10 Verder weet ik van de serie Brave New World, gepresenteerd door Stephen Hawking, dat er een aantal andere technieken zijn. Deze zijn bijvoorbeeld: - Moderne Biotechnologie - Gentherapie - Epigenetica - Optogenetica Die onderwerpen ga ik ook behandelen in dit deel. 3.2 Moderne biotechnologie Moderne biotechnologie is een techniek die heel recent is en door de meeste mensen nog niet helemaal wordt goedgekeurd. Het is ook een techniek die op meerdere vlakke kan worden gebruikt, namelijk: geneeskunde, landbouw, forensisch onderzoek, bioremediatie, bio-control en bio-veiligheid. Er wordt voor deze technologie gebruik gemaakt van recombinant-DNA techniek. Hierbij wordt een gen overgeplaatst in een andere cel. Dat doen ze omdat het gen een eiwit aanmaakt die zorgt voor een bepaalde eigenschap. Om dit te kunnen doen moet je DNA knippen en plakken. Je knipt DNA met behulp van restrictie-enzymen en DNA-ligase plakt het deel wat je hebt geknipt in het DNA waar je het in wilt hebben. Het wordt dan in een bacterie-, gist- of hamstercel geplaatst en dat wordt dan op de juiste plek in het organisme (plant, dier of mens) gebracht. DNA-ligase werkt als het volgt: er is een breuk in beide strengen van het DNA (hier betekend dat dus de plekken waar het DNA wordt samengevoegd), de DNA- ligase maakt daar een covalente fosfodi-esterbinding tussen te breuk. Er zijn 2 soorten breuken, een schuine breuk en een rechte breuk. Een rechte breuk heeft een hogere concentratie van het enzym nodig omdat het moeilijker is te repareren. Daarnaast zijn de reactieomstandigheden heel anders. Bij biotechnologie wordt het DNA van meerdere soorten gecombineerd. Zo kun je bij planten ervoor zorgen dat ze resistent worden tegen bepaalde ziektes die veel voorkomen bij planten. Er wordt hier gekeken naar het DNA van een plant die resistent is tegen de
  12. 12. 11 bepaalde ziekte, en er wordt onderzocht welke genen hiervoor verantwoordelijk zijn. Die genen worden geknipt uit het DNA en in een vector geplaatst, die vector wordt in een plantencel geplaatst van de plant die je resistent wilt maken. En uit eindelijk krijg je de resistente plant die je wilde. Op deze manier hoeven er minder gifstoffen te worden gebruikt en wordt het eten automatisch iets gezonder. Bij forensisch onderzoek wordt DNA-profiling gebruikt. Op deze manier kunnen ze DNA van een plaats delict onderzoeken om zo makkelijker de dader te kunnen vinden. Bij bioremediatie wordt gebruikt gemaakt van organismen, of delen van een organisme, om vervuiling in de bodem, het water of de lucht weg te werken. Bij bio-control en bio-veiligheid wordt met één organisme de niveaus van andere bestuurd. In Nieuw-Zeeland wordt dit gebruikt om uitheemse planten en insecten te besturen. Daarnaast willen ze het ook gaan gebruiken om het aantal buidelratten te controleren ter voorkoming van een plaag. Bij medicijnen wordt genetische modificatie, gentherapie en xenotransplantatie gebruikt. Genetische modificatie of transgenese wordt gebruikt bij het produceren van therapeutische menselijke eiwitten in cellen of hele organismen, dat hangt af van de grootte en complexheid van het eiwit. Insuline is zo bijvoorbeeld gemaakt in een genetisch gemanipuleerde bacterie omdat het eiwit klein is. Terwijl de complexere eiwitten zoals hormonen of antilichamen worden gemaakt in cellen van zoogdieren. Een ander voorbeeld is een vaccin of antibiotica, voor die uitleg: zie het deel over vaccins. Gentherapie wordt gebruikt om technologieën te ontwikkelen tegen genetische ziekten, voor verdere uitleg: zie het deel gentherapie. Xenotransplantatie is de transplantatie van cellen, weefsels of organen van de ene soort in de andere. Zo kun je van een virus-vrije populatie varkens medicijnen maken om mensen met type-1 diabetes te kunnen behandelen. Dit wordt al gedaan in Nieuw-Zeeland.
  13. 13. 12 3.3 Gentherapie Gentherapie is een manier om een genetisch probleem op te lossen bij de bron. Dit wordt gedaan door een gecorrigeerde kopie van een defect gen toe te voegen. Gentherapie maakt vooral gebruikt van een vector, meestal een virus om het aangepaste gen in de cellen te brengen waar het nodig is. Eenmaal binnen wordt het RNA van de gen gelezen en omgezet in eiwitmoleculen, die daarna hun werk doen in de cellen. Maar niet alle genetische aandoeningen kunnen worden behandeld met behulp van gentherapie. Om te kunnen besluiten welke aandoeningen behandeld kunnen worden met gentherapie, worden de volgende vragen gesteld:  Kan de toestand worden gecorrigeerd door één of enkele functionele genen toe te voegen? Voordat je over gentherapie gaat nadenken moet het antwoord op deze vraag “ja” zijn. Zo zijn genetische aandoeningen met een mutatie in enkele genen goede kandidaten voor gentherapie. Maar aandoeningen waar veel genen en omgevingsfactoren een rol spelen zijn juist hele slechte kandidaten voor gentherapie.  Weet je welke genen erbij zijn betrokken? Om de genetische aandoening te behandelen moet je dit weten, en je moet een kopie hebben van het DNA met het defecte gen.  Begrijp je de biologie van de aandoening? Om de beste aanpak te bedenken moet je zo veel mogelijk kunnen begrijpen van wat er gebeurd in de cellen. Je moet weten welke factoren een rol spelen in de aandoening en welke rol eiwitten spelen die worden vertaald door de defecte genen. Daarnaast moet je begrijpen welke invloed de mutaties in het gen hebben op de functie van het eiwit.  Zal de toevoeging van een verbeterde kopie van het gen het probleem in het aangetaste weefsel oplossen? Of zal het wegwerken van het defecte gen een betere oplossing zijn? Deze vraag is een toevoeging aan de vorige vraag en ook heel belangrijk om te weten of gentherapie de juiste oplossing is. Er zijn namelijk een paar mogelijkheden. Soms is het gen defect en wordt er geen functioneel eiwit van gemaakt. Wanneer dit het geval is, kun je gentherapie gebruiken om de persoon beter de maken. Maar er zijn ook gevallen waar defecte genen eiwitten maken die niet doen wat ze horen te doen, of de defecte genen verhinderen dat andere eiwitten hun werk doen. In dit geval is gentherapie geen optie en moet je het defecte gen kwijt zien te raken.  Kun je het gecorrigeerde gen in de cellen van het aangetaste weefsel brengen? Dit is de belangrijkste vraag als je antwoord hebt kunnen geven op de vorige vragen. Want je kan gentherapie wel als mogelijkheid hebben, maar hoe kun je het toepassen als het gecorrigeerde gen niet in de cel van het aangetaste weefsel kan brengen. Om antwoord te kunnen geven op deze vraag moet worden gekeken naar de bereikbaarheid van het weefsel en het moleculaire signatuur.
  14. 14. 13 Er zijn ook andere mogelijkheden binnen de gentherapie om iemand te kunnen genezen. Dit doen ze met behulp van het repareren van genen, gen silencing en met behulp van genetisch gemodificeerde cellen die immuun zijn en specifieke moleculen aanvallen. Het repareren van genen wordt gedaan met behulp van een techniek genaamd SMaRT™, wat “Spliceosome-Mediated RNA Trans-splicing” heet. Deze techniek valt het mRNA aan wat gekopieerd is van het gemuteerde gen en repareert het. Deze techniek repareert alleen het defecte gedeelte waardoor er geen poging gewaagd hoeft te worden om het hele gen te vervangen. Deze techniek maakt gebruik van enzymen de speciaal zijn gemaakt om specifieke DNA sequenties aan te vallen. De enzymen knippen het gemuteerde gen en vervangen het met een functionele kopie. Genetisch gemodificeerde cellen die immuun zijn en specifieke moleculen aanvallen. Om dit voor elkaar te krijgen maken wetenschappers gebruik van de natuurlijke functie van het immuunsysteem. Onderzoekers hebben uitgevonden hoe je iemands immuun cellen kan isoleren en genetisch kan modificeren met behulp van gentherapie. Je kan er zo voor zorgen dat ze een specifiek antigen kunnen herkennen zoals het eiwit aan het oppervlakte van een kankercel. Als deze gemodificeerde cel dan teruggeplaatst wordt in het lichaam zal het die specifieke cellen vinden en vernietigen. Verder, om deze techniek uit te breiden, kunnen wetenschappers de witte bloedcellen zo aanpassen dat ze een product maken, zoals een medicijn, een gifstof of een signaal. Zo kunnen ze, als ze teruggeplaatst worden in het lichaam, naast het vechten en vernietigen van de specifieke cellen, ook een product loslaten die tegen de ziekte vecht. Voor gen silencing: zie mijn uitleg bij epigenetica.
  15. 15. 14 3.4 Epigenetica Epigenetica is het deel in de cellen die bepaalde genen uitschakelen. Elke cel heeft het zelfde DNA, maar toch hebben alle cellen een andere functie. Epigenetica zorgt dus dat elke cel hun eigen functies kunnen hebben. Wetenschappers hebben ontdekt hoe dat werkt en kunnen dat nu kunstmatig. Eén manier om dat voor elkaar te krijgen word ook wel epigenetische silencing genoemd. Deze techniek verklaard ook, gedeeltelijk, waarom eeneiige tweelingen niet dezelfde fenotypen hebben. Binnen de cellen zijn er drie systemen die met elkaar communiceren om genen uit te kunnen schakelen, dit zijn DNA methylering, histon modificaties en RNA-geassocieerde silencing. DNA methylering is een chemisch proces die een methyl groep toevoegt aan het DNA. Het is zeer specifiek en gebeurd altijd in een gebied waar een cytosine nucleotide naast een guanine nucleotide ligt en die gelinkt is met een fosfaat. Dit wordt een CpG gebied genoemd. Deze gebieden kunnen alleen worden gemethyleerd met behulp van één van de drie enzymen genaamd DNA methyltransferases (DNMTs). Door dit te doen veranderd de structuur van het DNA waardoor de genen anders communiceren met de nucleus van de cel, wat nodig is voor het maken van eiwitten. Dit wordt ook door sommige cellen gebruikt om te besluiten welke genen worden overgenomen van de moeder en welke genen worden overgenomen van de vader, dit wordt inprenting genoemd. Een histon is een eiwit en het belangrijkste deel van chromatine, en hoort zo tot het DNA en de eiwitten die de chromosomen maken. Histonen zijn de zogenaamde “spoel” waar het DNA omheen draait om het zijn sterke structuur te geven. Op het moment dat histonen worden gemodificeerd nadat ze zijn veranderd in eiwitten, kunnen ze beïnvloeden hoe chromatine wordt aangebracht. En dat bepaald weer welk deel van het DNA in de chromosomen wordt vertaald. Als chromatine niet compact is, is het actief en betekend dat dus dat het DNA waaraan het zit wordt vertaald. Is het echter heel compact, dan krijgt het ook een andere naam, namelijk heterochromatine, dan is het inactief en word het DNA waar het aan zit niet vertaald. Histonen kunnen op twee manieren worden gemodificeerd, namelijk met behulp van acetylering en met behulp van methylering. Deze chemische reacties voegen een acetyl of methyl groep toe aan het aminozuur lysine die in de histon ligt. Bij actieve chromatine is de chemische reactie acetylering, terwijl bij inactieve chromatine het tegenovergestelde wordt gedaan met behulp van de-acetylering. Methylering kan bij allebei de soorten chromatine worden gebruikt. Genen kunnen ook uitgezet worden door RNA. Dit kan alleen als het RNA in de vorm is van antisense transcripten, niet-coderende RNA’s or RNA interferentie. RNA kan genexpressie beïnvloeden door ervoor te zorgen dat heterochromatine wordt gevormd, of door histon modificaties en DNA methylering teweeg te brengen.
  16. 16. 15 3.5 Optogenetica De hersenen zijn een zeer dicht bekabelde computer, gemaakt van honderden miljarden individuele cellen genaamd neuronen. Neuronen communiceren met elkaar door middel van chemische en elektrische signalen. Als een neuron wordt geactiveerd door een chemische boodschapper, produceert hij een elektrische puls. Hierdoor word de chemische reactie naar andere neuronen getransporteerd die ermee verbonden zijn. Er zijn duizenden, zo niet tienduizenden verschillende soorten neuronen. Elke verschillende soort heeft een unieke vorm en moleculaire samenstelling en een uniek patroon met connecties in de hersenen. Als we kunnen uitvinden wat de rol is van elke celtype in de hersenen, dan kunnen we begrijpen hoe ze samenwerken bij het creëren van gedachten, emoties en gedrag. En hoe fouten in specifieke celtypes kunnen lijden tot ernstige aandoeningen in de hersenen zoals schizofrenie, Parkinson en depressie. Nu is MIT bezig om apparaten te ontwerpen die dat kunnen doen en ze kunnen bepaalde specifieke neuronen precies controleren, waardoor ze kunnen begrijpen hoe iedere neuron deelneemt aan de functie van de hersenen. De Hightech apparaten die ze daarvoor gebruiken komen van micro-organismen zoals Chlamydomonas. Deze organismen reageren op een bepaalde manier tegenover licht. Het beweegt namelijk met behulp van licht want dit micro-organisme heeft licht nodig voor de fotosynthese die hij maakt. De reden dat dit micro-organisme zo goed achter het licht aan kan gaan is omdat hij gebruik maakt van een eiwit dat gevoelig is voor licht namelijk channelrhodopsin. Dit eiwit zit op de grens van het oogachtige structuur van de algen, die we een oogvlek noemen. Op het moment dat het eiwit wordt getroffen door licht gaat het zich gedragen als een zonnepaneel en zet het licht om in elektrische stroom. Dit doet hij door middel van het veranderen van zijn vorm, zodat het een kanaal vormt door de begrenzing van de oogvlek. Dit kanaal maakt het mogelijk positief geladen deeltjes door het grensgebied te leiden en de oogvlek binnen te gaan. De verkregen stroom van geladen deeltjes produceert een elektrische stroom die, via een waterval van gebeurtenissen, de algen naar het licht toe stuurt. Wetenschappers hebben met behulp van gentherapie DNA van de Chlamydomonas bij kleine dieren in de neuronen aangebracht, waardoor ze op dezelfde manier reageren op licht. De neuronen reageren bij blauw licht, wat ervoor zorgt dat er elektrische pulsen worden gemaakt. Op deze manier kunnen wetenschappers de effecten observeren van bepaalde typen neuroncellen. Ze doen dit niet bij elke soort neuroncellen, ze doen dit maar bij één soort cel, bijvoorbeeld de basket cellen waardoor alleen die cellen worden geactiveerd door licht. Er zijn ook eiwitten gevoelig voor oranje licht, en die zorgen ervoor dat de cellen geen elektrische pulsen versturen. Met behulp van deze technieken kunnen wetenschappers de hersenen besturen en zo meer uitvinden over de verschillende ziektes die de hersenen beïnvloeden.
  17. 17. 16 4. Practicum 4.1 Elektroforese met appels Bij dit practicum heb ik gebruik gemaakt van een practicumopzet uit de NLT module ‘Door de ZOETE appel heen bijten!’. Ik heb met behulp van dit experiment antwoord geprobeerd te krijgen op de onderzoeksvraag, en de onderzoeksvraag is: Hoe kunnen we DNA vergelijken en zo zien welke genen de eigenschappen hebben die we willen in een medicijn? Van het practicum was al wat voorbereid door de docenten, zij hadden al agarosegel gemaakt en het DNA geknipt. Met foto’s heb ik mijn resultaten vastgelegd. Zelf heb ik bij het proefstuderen ook DNA geknipt dus dat practicumverslag zit er ook bij. Vind de juiste appel! (Bron: BioRad Laboratories,Inc.) Inleiding Via de milieuorganisatie Greenpeace is bij de Voedsel en Waren Autoriteit (VWA) een appel terecht gekomen uit een supermarkt. Greenpeace vermoed dat deze appel afkomstigisvaneenappelboomdie genetischgemanipuleerdis.Dezeappelzouuiteen bedrijf komen dat geen vergunning van het ministerie van VROMheeft gekregen om met GGO’s (genetisch gemodificeerde organismen) te werken. Van het verlenenvan vergunningenbestaanEuropeserichtlijnen. Het DNA is bij iederindividuverschillend.WanneerDNA geïsoleerdis(hoofdstuk7) en eventueel vermeerderd is (hoofdstuk 10), kan het daarna met behulp van enzymen in stukjes worden geknipt. De enzymenknippen hetDNA door op bepaalde plaatsen, dit is een bepaalde volgorde van de lettersA, T, C en G. Omdat het DNA dus bij iedereen verschillend is,zullen de stukjes DNA ook een verschillende lengte hebben. Door deze stukjes met verschillende lengte op een bepaalde manier zichtbaar te maken kan men iets over het DNA van een persoon te weten komen. Dit principe noemt men DNA- fingerprint; omdat het geknipte DNA voor ieder individu net zo uniek is als zijn vingerafdruk. Aan jou de taak om met behulp van een DNA-fingerprint er achter te komen tot welk appelrasde bij de VWA terechtgekomenappel behoortengenetischgemodificeerdis. Practicum Dit practicumbestaatuit5 onderdelen:  agarosegel maken  knippenvande DNA-monsters  gelelektroforese  kleurenvanDNA  analyse vande resultaten.
  18. 18. 17 Bepaalde onderdelenkunnenvantevorenal voorbereidzijndoordocenten/of TOA. Wanneerdat gedaanishoevenjullie deze onderdelendusnietmeerzelfte doen. Agarosegelmaken Inleiding De aanbevolen concentratie agarose in de gels is 1%. Deze agaroseconcentratie heeft een voldoende resolutie en een minimale looptijd voor de scheiding van de DNA- fragmententijdensde elektroforese.Brengde gel aan in eenlaag van 0,75-1,0 cm dik, zodat de monstersgemakkelijkgeladenkunnenwordenende gel goedhanteerbaaris. Let opdat de elektroforesebuffer,endusgeenwater,wordtgebruiktbij hetmaken van de gels. Benodigdheden  elektroforesebakken,gietvormen(=gelhouder) engelkammen  elektroforesebuffer(50x TAE)  agarosepoeder  8 doorzichtige reageerbuisjes  3 litergedestilleerdwater. Werkwijze a. Elektroforesebuffermaken De TAE (Tris-acetaat-EDTA)-elektroforesebufferwordtgeleverdineen50x geconcentreerdeoplossing.Behalve voorde agarosegel,iserooknog ongeveer275 ml 1x TAE-buffer nodig in de elektroforesebakjes. Drie liter 1x TAE buffer zou voldoende moetenzijnomachtelektroforesebakjeste laten“lopen”enachtagarosegelste maken. Verdun60ml van het50x-concentraatmet2,94litergedestilleerdwatertotde drie liter 1x TAE. Om de elektroforesebakjes te vullen (zie: ‘Gelelektroforese’ stap 4) kun je ook 0,5x elektroforesebuffer gebruiken. Dus je kan de buffer nog 1:1 (v/v) verdunnen. De elektroforesekandanbij 150 voltwordengedaanenis in20 minutengereed. b. Agarose maken Deze handelingenkunnen1of 2 dagenvan tevorenwordenverrichtof tijdenshet practicumdoor de afzonderlijke werkgroepjes. Let opwanneerje mettwee groepje éénelektroforesebakjegebruikt,door halverwegenogeenkammetjete zetten,hoeftdusnietiedere groepditte maken. Gebruik1 gram agarose voor elke 100 ml 1x TAE elektroforesebuffer,omeen1% agaroseoplossingte maken.Letopdat je geenwatergebruikt,maar elektroforesebuffer. Alser te weinigelektroforesebakjeszijn,kanerookeen7 x 10 cm houderworden gebruiktmettwee 8-tandige kammen.Hierkanééngel inwordengegoten,waartwee werkgroepjestegelijkgebruikvankunnenmaken. Gebruikde tabel infiguur35 omde juiste hoeveelhedengel te bepalen. Volume 1%agarose voor:
  19. 19. 18 aantal gels 7 x 7 cm houder 7 x 10 cm houder 1 40 ml 50 ml 2 80 ml 100 ml 4 160 ml 200 ml 8 320 ml 400 ml Figuur 35: hoeveelheden per gel. Doe het agarosepoederineengeschiktvat(een500ml Erlenmeyerisbijvoorbeeld geschiktvoormaximaal 200 ml).Voegde juiste hoeveelheid1x TAE- elektroforesebuffertoe en schud,zodatde agarose inde bufferoplost.Alsergebruik wordtgemaaktvan Erlenmeyers,kanhethandigzijnomeen25 ml Erlenmeyer omgekeerdinde openingvande 500 ml Erlenmeyermetde agarose te zetten.Op deze manierkande oplossingwordengekookt zonderdaterveel vloeistof verloren gaat door verdamping.Gebruikeenkookplaat,eenwarmwaterbadof eenmagnetron om de agarose “te smelten”. Waarschuwing Draag altijd een veiligheidsbril, beschermende handschoenen en een laboratoriumjas tijdenshetpreparerenengietenvande agarosegel.De kokende agarose ende buisjes zijnergheetenkunnennare brandwondenveroorzaken. Magnetronmethode Gebruik de magnetron. Het oplossen van agarose gaat het snelst enhet veiligst in een magnetron. Plaats het mengsel in de magnetron. ZORG DAT DE FLES OF BEKER NIET LUCHTDICHT AFGESLOTEN IS. Stel de magnetron in op 3 minuten op half vermogen. Neem de agarose elke 30 seconden evenuit de magnetronom te zwenken,zodat alle klontjes oplossen. Kook en zwenk de oplossing net zo vaak totdat alle stukjes agarose opgelost zijn. Zet de oplossing weg en laat tot 55–60°C afkoelen voordat kan worden begonnenmetgieten. Magnetische-kookplaatmethode Plaatseenroerboon(roervlo) inhetagarosemengsel.Verwarmhetmengsel al roerend op de magnetische kookplaat en breng het aan de kook. Laat de vloeistof niet tot de overde rand schuimen.Kookhetmengsel totalle agarosedeeltjeszijnopgelost.Zetde oplossing weg en laat tot 55–60 °C afkoelen voordat er kan worden begonnen met gieten. c. Gelsgieten In deze handleidinggaanwe ervanuitdat elke gel minstens7gaatjesheeft.Volg bovenstaande instructiesomde agarose te bereidenende juistehoeveelheid1% agarose te bepalen.Gietvoldoende agarose inde houderomde tandenvande kam te bedekkenof totereenlaagvan 0,6-0,8 cm ligt.Verplaatsde houdernietvoordatde gel hard isgeworden.Vaste gelskunneneendagwordenbewaardbij kamertemperatuurineenafgeslotenzakje (of Tupperware bakje).Inde koelkastzijn ze eenweekhoudbaar.Zorgdat je je zakje (bakje) metgel hebtgemerkt.Eenhele klas isongeveer30 minutenbezigmethetgietenvande gels.Gietzomogelijkeenof twee
  20. 20. 19 extragelsvoorhetgeval er ietsmisgaat.Hierbehandelenwe alleende plakbandmethode voorhetgietenvande gels. 1. Sluitde uiteindenvande gelhouderzorgvuldigaf metlaboratoriumplakband (schilderstape kanook,maargeengewoonplakband,datisniethittebestendigen waterdichtgenoeg).Drukde tape stevigaan,zodater geenvloeistof meerlangs kan lopen. 2. Zorg dat de houderwaterpasstaat.Gebruikbijvoorbeeldhetbijgeleverde waterpasje. 3. Maak de gewenste concentratie enhoeveelheidagarose ineen1x TAE elektroforesebuffer. 4. Laat de agarose afkoelenminstenstot60 °C voordater kanwordenbegonnenmet gieten.Hitte beschadigtde dure gelhouder. 5. Plaatsondertussende kaminde daarvoorbedoelde gleuveninde gelhouder.De kam moetietsmeerdaneencentimetervande korte kantwordengeplaatstalsje éénkamin een7 x 7 cm-bakje gebruikt.Wordtergewerktmeteen7x 10 cm- bakje en2-kammen,plaatsdan1 kamaan eenuiteinde en1kam inhetmidden van hetbakje.De kammenzullende gaatjesinde gel vormenwaarinde DNA- monsterswordengeladen. 6. Laat de gel in10 tot 20 minutenbij kamertemperatuurhardworden.De gel is geschiktvoorgebruikalshij troebel enondoorzichtigisgeworden. 7. Haal de kam rechtstandigenvoorzichtiguitde gestolde gel. 8. Haal hetplakbandweg. 9. Er zijnnutwee mogelijkheden: Mogelijkheid1 Er isnietgenoegtijdomdoorte gaan methetpracticum.Stopde gelsdanin afsluitbare plasticzakjesenzorgdatde gelsgemerktzijn.De gelszijneendag houdbaarbij kamertemperatuurenbij 4 °C kunnenze zelfseenweekworden bewaard. Mogelijkheid2 Er is wel genoeg tijd om door te gaan. Plaats de houder in de waterpas elektroforese bak. Zorg ervoor dat de gaatjes waar de DNA-monsters in moeten, aan de zwarte (kathode) zijde van de bak zitten. De DNA-monsters zullen in de richting van de rode (anode) zijde bewegentijdensde elektroforese. Knippen van de DNA-monsters Inleiding Tijdensditpracticumkrijgtjouw werkgroepjezesDNA-monsters.Jouw taakisomsamen metje groepje te bepalenof dezezesmonstersvanverschillendeappelrassenafkomstig zijnof dat er twee identiekzijn.OmverschilleninhetDNA van verschillende appelste vinden moeten worden gekeken naar DNA profielen. De profielenkrijgen we door het DNA vande appelsinstukkente “knippen”metenzymen.Hetprofieldatontstaatnade elektroforese van de verkregen DNA-fragmenten noemt men ook wel een “DNA- fingerprint”.
  21. 21. 20 Figuur 37: restrictie- enzymenmix. Benodigdheden  elektroforese-systeem(elektroforesebak,gietvorm, gelkammet8tandjes)  opgeloste restrictie-enzymenEcoRI/PstI(1buisje van80μl)  pipetpuntjes,2–200 μl (15 stuks)  micropipet,2–20 μl  gekleurde reageerbuisjes(epjes):groen,blauw,oranje,paars,rood,geel (1vanelk)  watervaste stift  afvalbakje  schuimrubberreageerbuishouder(epjes)  DNA van de verdachte appel,opgelost(1buisje)  DNA van Golden Delicious,opgelost(1buisje)  DNA van Royal Gala, opgelost(1buisje)  DNA van Elstar,opgelost(1buisje)  DNA van Granny Smith,opgelost(1buisje)  DNA van JonaGold, opgelost(1buisje)  gesmolten1%agarose in1x TAE (zie 11.2.1) 70–80 ml pergel  37 °C waterbadof broedstoof (1per klas)  microcentrifuge(1perklas). Werkwijze Label reageerbuisjes. Zorg dat je van elkvande volgende gekleurde reageerbuisjeseréénhebt.Label de 5 buisjesalsvolgt:  hetgroene buisje VA(verdachte appel)  hetblauwe buisje GD(GoldenDelicious)  hetoranje buisje RG (Royal Gala)  hetpaarse buisje EL (Elstar)  hetrode buisje GS(GrannySmith)  hetgele buisje JG (JonaGold). Zetverdernog je (groeps)naamendatumopde buisjes.Hetknippenvande DNA- monstersgaatin deze buisjesplaatsvinden.Zetde reageerbuisjesinde schuimrubberenreageerbuishouder.Zie figuur36. Figuur 36: reageerbuisjes in reageerbuishouders. Pak hetdoorzichtige reageerbuisje metde restrictie-enzymenmix. Dit buisje isgelabeldmet“ENZ”(figuur37). Je DNA-monstershalen. VA GD RG EL GS JG
  22. 22. 21  Gebruikvoorelkmonstereennieuw pipetpuntje.  Pipetteer10 μl vanelkDNA-monsterinhetcorresponderende gekleurde reageerbuisje (zelfdekleurbij zelfde kleur!).  De DNA-monstersvindje opde centrale werkplekingekleurde voorraadbuisjes. De docentof TOA beheertdeze. Figuur 38: DNA-monsters pipetteren. 4. Let op:Vergeetnietiedere keerpipetpuntjeste vervangenalsje meteen andere reagensaande slag gaat. Pakaltijdeenschoonpuntje alsje perongelukmet de punt de verkeerde vloeistofhebtgeraakt.Alsje twijfelt,vervanghetpipetpuntje! Doe altijd eerstDNA inde reageerbuisjesendanpasde enzymenmix. Figuur 39: enzymenmix pipetteren. Na hetpipetteren Je DNA-monsters zoudenuitde volgende componentenmoetenbestaannahet pipetteren,zie de tabel infiguur40. VA GD RG EL GS JG VA GD RG EL GS JG
  23. 23. 22 DNA-monsters EcoRI/PstI Totale (10 μl van elk genomen) Enzymenmix inhoud in buisje Verdachte appel [PD=VA] 10 μl 20 μl Golden Delicious [GD] 10 μl 20 μl Royal Gala [RG] 10 μl 20 μl Elstar [EL] 10 μl 20 μl Granny Smith [GS] 10 μl 20 μl Jona Gold [JG] 10 μl 20 μl_________ Figuur 40: componenten DNA-monsters. Meng de inhoudvande buisjes. Sluitde buisjeszorgvuldigaf.Mengde inhouddoorvoorzichtigmetje vingertegende buisjeste tikken.Alsereencentrifugeaanwezigis,centrifugeerde buisjesdaneen paar tellenzodatde inhoudzichhelemaal opde bodembevindt.(Zorgwel datje de buisjesopde juiste manierinde centrifuge plaatst!Doe ditsamenmetde docentof TOA).Alsergeencentrifuge inhetpracticumlokaalaanwezigis,schuddande buisjes, zoalsje eenthermometerschudt,metéénof twee krachtige bewegingen.Klopnog eenpaar keervoorzichtigmetde bodemvande reageerbuisjesopde tafel. De DNA-monstersincuberen. Zetde buisjesinde schuimrubberenhouderenincubeergedurende 45minutenbij 37 °C. De buisjeskunnenookineenbakmetwatervan37 °C wordengeplaatstdie langzaamnaar kamertemperatuurafkoelt.Laatde buisjesdanwel eennachtlangin hetbad drijven.Zetde buisjesnade incubatie inde koelkasttotde volgende practicumles.Alservoldoende tijdisomdoorte gaan, ga dan directdoormet de volgende stap. Gelelektroforese Inleiding DNA-fragmenten die door eenrestrictie-enzym zijngeknipt,kunnen op lengte worden gescheiden door een techniek genaamd agarose gelelektroforese. De term elektroforese betekent ‘gedragen door elektriciteit’. DNA-fragmenten worden aangebracht op een agarosegel. De gel bevindt zich in een bak gevuld met een geleidende buffervloeistof. Er wordt gelijkstroomop de bak gezet via twee elektroden aan de uiteindenvande bak.OmdatDNA-fragmentennegatief geladenzijn,zullenzijin een elektrisch veld richting de positieve pool worden getrokken. De structuur van de agarosegel werktalseensoort moleculaire zeef waardoorkleine DNA-fragmentenzich makkelijkerbewegendangrote fragmenten.De afstanddie eenDNA-fragmentdoorde gel aflegt,isdusomgekeerdevenredigmetzijnlengte.Fragmentenvandezelfdelengte zulleninbandjesbij elkaarblijven.AlshetDNA gekleurdis,kunje deze bandjeszien. Figuur 42: waterbad. Figuur 41: inhoud buisjes mengen. VA GD RG EL GS JG
  24. 24. 23 Benodigdheden  elektroforesesysteem  agarosegel  geknipte DNA-monsters(6pipetjes)  DNA-marker(HindIII-gekniptlambdaDNA)  laadkleurstofvoorDNA-monsters  watervaste stift  pipetpuntjes,2–20 μl (13 stuks)  micropipet,2–20 μl  afvalbakje  gel supportfilm(alsnodig)  Fast BlastDNA-kleurstof,1x of 100x (120 ml per2 plekken)  bakkenomkleurstof af te spoelen(1–3per2 plekken)  schuimrubberreageerbuishouder  voedingsbron  gelkleurbak(1per2 plekken)  elektroforesebuffer(1x TAE) 275 ml  microcentrifuge(1perklas)  schudplatform(optioneel;1per klas). Werkwijze Gebruikde agarosegel die je in‘Agarosegel maken’hebtgemaakt. Indienje de vorige lesgestoptbent,haal dan de geknipteDNA-monstersuitde koelkast. Let op. Gebruikbij hetpipettereneennieuw pipetpuntje vooriedermonster. Voegaan elkreageerbuisje 5μl vande laadkleurstof “LK”toe. DNA-monsters Laadkleurstof (blauw) Verdachte appel [VA=PD] 5 μl Golden Delicious [GD=V1] 5 μl Royal Gala [RG=V2] 5 μl Elstar [EL=V3] 5 μl Granny Smith [GS=V4] 5 μl Jona Gold [JG=V5] 5 μl Figuur 43: laadkleurstof DNA-monsters.
  25. 25. 24 Figuur 44: mengen laadkleurstof. Sluitde buisjesgoedaf.Mengde inhouddoorvoorzichtigmetje vingertegenhet buisje te tikken.Alsereencentrifugeaanwezigis,centrifugeerde buisjesdanzodatde inhoudzichopde bodemvanhetbuisje bevindt.Zoniet,klopdaneenaantal keer zachtjesmetde bodemvande reageerbuisjesopde tafel. Plaatsde houdermetde gestolde gel ophetplatforminde gelelektroforesebak.Zetde gel zo neerdatde gaatjeszichaan de zwarte (-) zijde vande bak bevinden.Trekde kam heel voorzichtigenrechtomhooguitde gel. Beschadiging van jegelslots (=gaatjes) geeftslechtereresultaten,debandjesworden nietmooirecht. Gietongeveer275 ml vande elektroforesebufferinde elektroforesebak.Gietnet zoveel bufferinde baktot de gel zich 1-2 mm onder hetvloeistofoppervlakbevindt. Figuur 45: elektroforesebuffer in elektroforesebakgieten. Pak nuhet buisje met‘HindIIIlambdadigest’(DNA-marker). VA GD RG EL GS JG
  26. 26. 25 Gebruikvoorelkmonstereenapartpipetpuntje.Brengde DNA-fragmentenaanopde agarosegel.Eengel “lees”je vanlinksnaarrechts.Het eerste monsterwordtinhet meestlinkse gaatje vande gel gepipetteerd. Baan 1: HindIIIDNA-marker,buisje kleurloos,8μl Baan 2: VA,buisje groen,8μl Baan 3: GD, buisje blauw,8μl Baan 4: RG, buisje oranje,8μl Baan 5: EL, buisje paars,8 μl Baan 6: GS, buisje rood,8μl Baan 7: JG, buisje geel,8μl Figuur 46: DNA-fragmenten aanbrengen op agarosegel. N.B.Opmerking:de hoeveelheiddieinzo’n“gel slot”(‘gaatje”) pasthangtaf van de kam die gebruiktis.Inhetalgemeenis7μl monster voldoendeomwatte kunnenzien. Bevestigde dekselopde elektroforesebak.De deksel pastmaarop éénmanieropde bak: roodbij rood enzwart bij zwart.Verbindde snoertjesmetde voedingsbron. Figuur 47: elektroforesebakafsluiten en verbinden met voedingsbron. Zetde voedingsbronaan.Stel inop100 V en elektroforeerde monsters gedurende 30–40 minuten. Terwijl je aanhetwachtenbent,kunje vast beginnenmetde vragenopde volgende pagina.
  27. 27. 26 Schakel,wanneerde elektroforese klaaris,de voedingsbronuitenverwijderde deksel van de elektroforesebakmetde gel.Haal de houdermetde gel voorzichtiguitde bak. Kijkgoeduit,wantde gel is ergglibberig! Kleuren van DNA Inleiding Omdat DNA van nature kleurloos is, zal het niet direct zichtbaar zijn in de gel. Zonder hulpmiddelen zie je alleen de laadkleurstoffen. De DNA-fragmenten worden zichtbaar gemaakt met de blauwe kleurstof Fast Blast DNA-kleurstof. De blauwe kleurstofmoleculenzijn positief geladenen wordensterk door het DNA aangetrokken. Deze blauwe kleurstofmoleculen binden zich aan de DNA-fragmenten en zorgener zo voor dat de fragmenten wel zichtbaar zijn. De DNA-fragmenten zijn dan als blauwe bandjes zichtbaar en kunnen overgetekend of gefotografeerd worden. Het is ook mogelijkomde gel te drogenente bewaren. Werkwijze Dit snelle protocol zorgtdatde DNA-bandjesinde agarosegel binnen15 minuten zichtbaarzijn.Voorhetsnelle protocol moetde 500x Fast Blastkleurstof worden5x verdundtoteen100x concentratie. De aanbevolen hoeveelheidverdunde FastBlastomtwee 7 x 7 cm of 7 x 10 cm agarosegelste kleurenis120 ml.Alserandere kleuringsbakjeswordengebruiktdan die inde kit,zorg dan dat er voldoendekleurstof isomde gel vollediginonderte dompelen.Nade elektroforese,moetende agarosegelseerstuitde gelhouders wordengehaaldvoordatze inde kleurstofoplossingwordengeplaatst.Doorzachtjes te duwenkande gel gemakkelijkuitde houderwordenverwijderd.Omdatde gel breekbaaris,moetervoorzichtigmee wordenomgegaan.Ondersteunde gel meteen brede spatel of ietsdergelijkswanneerhij verplaatstmoetworden.Bij hetontkleuren (wanneerhetsnelle kleuring protocol wordtgevolgd) iseropelke werkplekvoorde leerlingeneenvatvanminstens500 ml nodig.Leerlingenkunnenperstapinhet ontkleuringsproceseennieuw vatgebruikenof naelke staphetvatlegenenopnieuw vullen. Zetje naamen klasop hetkleuringsbakje.Erpassentwee gelstegelijkineen kleuringsbakje. Kleurenvan de gels Haal de gel uitde houderenlaathemin hetkleuringsbakjeglijden.Gietongeveer120 ml van de 100x kleurstofoplossinginde bak.Gietermeerkleurstof opalsde gel niet helemaal onderde vloeistof ligt.Laatde gels2-3 minuten,maarzekernietmeerdan3 minuten,inde kleurstofliggen.Gietde 100x kleurstof voorhergebruikmethulpvan eentrechterineenvoorraadvat. De kleurstof kanzeker7keerwordenhergebruikt. Spoelenvan de gels Plaatsde gelsineenruimvat met500-700 ml schoon,warm kraanwater(40–55 °C). Laat de gels5 minutenlangonderwaterliggenenschudze omde minuutvoorzichtig.
  28. 28. 27 Wassenvan de gels Herhaal stap 3 (eventueel meerdere malen,metsteeds5minutenwachttijd). Resultatennoteren Giethetwater wegenkijkof je DNA-bandjesziet.De bandjeszullenerdirectnade wasbeurtnogeenbeetje rafeligenonscherpuitzien,maarna5-15 minutenzijnze goedzichtbaar. Dit komtdoordater nog FastBlast kleurstofmoleculendoorde gel bewegenopzoek naar DNA-fragmenten.Voornogscherpere bandjes,kunje stap3 nog eenaantal keer herhalen.Laatde gelsechterniette langinhet waterliggen.Mochtende bandjesna eenaantal wasbeurtennognietgoedzichtbaarzijn,legde gel danineen1x Fast Blast kleurstofoplossing.Laatdeze eenetmaal staan. a. Leg je gel op eenwitte ondergrond.Legde resultatenvande proef alsvolgtvast:leg eentransparantop de gel entrek (voorzichtig,niethardduwen!)meteenwatervaste stiftde gaatjesenbandjesoverophettransparant. Je kunt de gel ook(fotokopiërenof) meteendigitaal fototoestelvastleggen. b. De gel drogenomte bewaren.Hiervoorhebje speciaal doorzichtigdragermateriaal nodig,datheet“gel support film”.Ditheefteenhydrofiele eneenhydrofobekant. Snijdde ongebruiktebanenwegmeteen(scheer/hobby/Stanley)mes.Je hebtdan alleenbaan1-7 over. Plaatsde gel op de hydrofielezijdevaneenstukgel supportfilm(opde hydrofobe zijde kruipthetwaternaarelkaartoe;op de hydrofiele zijde verspreidthetwaterzich overhethele vlak).Legde gel inhetmiddenvande folie enzorgervoordat hetfolie helemaal gladgestrekenis.Legde folieopeenstukkeukenpapierenlaatde gel drogenzonderhemaan directlichtblootte stellen.Tijdenshetdrogenzal de gel zich aan de folie bindenennietkrimpen.Alsde gel 2tot 3 dagenop kamertemperatuur heeftgelegenishetdroog.Hetresultaatiseenplatte,doorzichtige enduurzame registratie vande proef. NB.Bij anderedrogingproceduresgaatdegelomkrullen en sterk krimpen. Verslag practicum elektroforese: Uit het resultaat blijkt dat de onbekende appel de Elstar was. Een elektroforese werkt net als een chromatografie, maar dan met geladen moleculen. DNA is negatief geladen en gaat dus naar de pluspool, zo krijg je het uiteindelijke resultaat. Maar dat is niet alles, want als alle moleculen dezelfde lading hebben kom je niet zo ver. DNA bestaat uit verschillende moleculen, die moleculen hebben een verschillende grootte. Kleine moleculen bewegen snel, grote moleculen bewegen langzaam. Zo krijg je verschillende lijnen. Elke lijn geeft aan welke moleculen er in het DNA zitten. Je kunt dus zien waaruit het DNA bestaat aan de hand van de positie van de lijnen. DNA is uniek, Daarom kun je snel zien van wie het DNA is, als je van de juiste persoon het DNA hebt genomen om het onbekende DNA te kunnen achterhalen. HindII I VA GD RG EL GS JG
  29. 29. 28 Je kunt deze techniek ook gebruiken om DNA met elkaar te vergelijken van verschillende personen. Zo kun je zien welke delen overeenkomen. Zo kun je er bijvoorbeeld achter komen hoe twee totaal verschillende dames van in de 90 beide kerngezond zijn, terwijl de een bijna niet beweegt en al vanaf kind af aan rookt, en de ander alleen gezond bezig is met het juiste eten, genoeg beweging, niet roken en drinken, etc. Hieronder zie je een aantal foto’s die ik heb gemaakt tijdens het practicum.
  30. 30. 29
  31. 31. 30 4.2 DNA isolerenvaneenthymus Op 16 decemberbenikgaanproefstuderenvoorde studie BiologieenMedischLaboratoriumonderzoek. Hierdedenwe eenpracticumwaarbij we DNA moestenisolerenuiteen kalfsthymus.Ikhebhetverslag erbij gedaanomdatDNA isolerenookdeelwasvanhetpracticumelektroforese,alleenwashetdaaral gedaandoor de docent. We kregenhiereenblokje van3gram thymus,watuitde vriezerkwamzodathetmakkelijkerte snijden was.Vervolgensmoestenwe de volgende instructiesopvolgen:  Snij de thymusinhele kleinestukjes,zokleinmogelijk,wantdankunje hetDNA er makkelijker uithalen  Doe het ineenblender,met75mL SSC per thymus,je kan2 of 3 blokjestegelijkdoen wantde mesjesvande blendermoetenhelemaalonderde vloeistof zitten.De SSCzorgtdat alle celmembranenopgelostworden.Blijfblendentoterhelemaal geenblokjesmeerte zienzijn, hetmoeteenmooie gladde vloeistof worden.  Doe het ineenbuisje voorinde centrifuge enzorgervoordatje hetgoedhebtgetaredmeteen anderbuisje andersgaatde centrifuge stuk.  Zetde buisjesinde centrifuge:20minutenop5000 rpm  Alsje hetuit de centrifuge haaltzie je dathetbuisje 2componentenheeft,opde bodemziteen vaste stof,ditheethetpelletendaarzittende celkernenmethetDNA in.Ookzie je een vloeistof,ditheethetsupernatantenbevatde SSCmetde opgeloste celmembranen.  Giethetsupernatantmeteenvloeiendebewegingaf,ditheetdecanteren,je houdtde pellet over.  Doe eenkleinbeetje 2,2M NaCl bij hetpellet,hetmoetnetonderde vloeistof zitten.NaCl zorgt ervoordat de eiwittenneerslaandie omhetDNA zitten.  Roerhet meteenlege reageerbuisof roerstaafje,uiteindelijkkrijg je weer2delen,onderopde eiwitten,endaarboveneenstroperige vloeistof waarhetDNA inzit.  Haal de stroperige vloeistoferuitmeteenpipetenzorgervoordater geenstukjeseiwitbij zitten(hele kleine stukjeskunje haastnietvermijden,maarprobeerde stukjeseiwitdie wat groterzijnnietbij de oplossingte krijgen).  Doe de stroperige vloeistof die je hebtgepipetteerdineenbekerglasendoe er2x zoveel ethanol bij.GiethetervoorzichtigopzodathetnietmengtmethetDNA (wantdat mag niet). Aan hetgrensvlaktussende ethanolende stroperige vloeistof zie je DNA alsbelletjesomhoog komen.Ga meteenglasstaaf voorzichtigroeren.OmdathetDNA negatief geladenis,blijfthet aan de glasstaaf hangen.  Doe het vervolgensineenreageerbuisenloshetopmetSSC.Je mag geenstukjesmeerzien(of probeerdatin iedergeval voorelkaarte krijgen) Toenwe dit haddengedaangingde docentmetbehulpvaneenspeciaal apparaatkijkenhoeveel DNA we haddengeïsoleerdenhoe zuiverhetwas.De zuiverheidmoesttussende 1.8n 2.0 zitten,maar omdathet eenruwe methode was,washetookgoedalsje 1.7 had gehaald. De resultatenkregenwe mee naarhuisenzie je hieronder. Zoalste zieninde resultatenhadmijngroepje hetbestgoedgedaan,hetwaseenleukeervaringeneen leuke toevoegingaanhetvorige practicummetde elektroforese.
  32. 32. 31
  33. 33. 32 5. Conclusie Dus er zijn een aantal technieken waarmee DNA wordt gebruikt in medicijnen. Als eerste heb je een DNA vaccinatie, dat is een bacteriële plasmide met een of meer genen van een parasiet, bacterie, virus of tumorcel. Deze genen worden gekoppeld aan een promotor, die wordt verkregen van een zoogdier. Er moeten veel keuzes gemaakt worden bij het maken van een DNA vaccinatie, hierbij moeten wettelijk bepaalde richtlijnen gevolgd worden en tegelijkertijd moet er worden gekeken naar de effectiviteit van het vaccin. DNA vaccins hebben voordelen en nadelen, de voordelen zijn:  Makkelijker, goedkoper en veiliger  Natuurlijker  Makkelijker  Praktischer en realistischer De nadelen zijn:  Plasmide DNA kan integreren in het DNA van de cel  Niet bruikbaar voor polysacharide vaccins  Risico van auto-immuniteit DNA vaccins werken nog niet zoals gewenst bij mensen, maar daar zijn de wetenschappers naartoe aan het werken. Verder heb je moderne biotechnologie die op meerdere vlakken kan worden gebruikt, niet alleen de geneeskunde. Er wordt voor deze technologie gebruik gemaakt van recombinant-DNA techniek, waarbij een gewenst deel van het DNA geknipt wordt. Dit deel wordt dan in een bacterie-, gist-, of hamstercel geplaatst en dat wordt dan op de juiste plek in het organisme (plant, dier of mens) gebracht. Biotechnologie combineert het DNA van meerdere soorten, wat kan zorgen voor resistentie tegen bepaalde ziektes. Dat is nu vooral bij planten het geval. Bij mensen kan er op deze manier worden gezorgd dat de cellen bijvoorbeeld insuline aan gaan maken. Vaccins maken ook gebruik van moderne biotechnologie. Je hebt ook xenotransplantatie, waarbij cellen, weefsels of organen worden getransplanteerd van de ene soort in de andere.
  34. 34. 33 Ook heb je gentherapie, wat een manier is om een genetisch probleem op te lossen bij de bron. Dit wordt gedaan door een gecorrigeerde kopie van een defect gen toe te voegen. Gentherapie maakt vooral gebruikt van een vector, meestal een virus om het aangepaste gen in de cellen te brengen waar het nodig is. Eenmaal binnen wordt het RNA van de gen gelezen en omgezet in eiwitmoleculen, die daarna hun werk doen in de cellen. Met gentherapie kunnen helaas niet alle aandoeningen worden behandeld, en om erachter te komen welke aandoeningen behandeld kunnen worden moeten een aantal vragen worden beantwoordt, die te maken hebben met textuur en structuur van de genen en de biologie van de aandoening. Verder moet je weten of je het gecorrigeerde gen in de cellen van het aangetaste weefsel kan brengen. Andere technieken bij gentherapie zijn gen silencing, het repareren van genen en genetisch gemodificeerde cellen die immuun zijn en specifieke moleculen aanvallen. Het repareren van genen gebruikt een techniek genaamd Spliceosome-Mediated RNA Trans- splicing (SMaRT), deze techniek valt het mRNA aan wat gekopieerd is van het gemuteerde gen en repareert het Om genetisch gemodificeerde cellen te krijgen die immuun zijn en specifieke moleculen aanvallen, maken wetenschappers gebruik van de natuurlijke functie van het immuunsysteem. Door de immuun cellen van een persoon te isoleren en genetisch te modificeren kan je er voor zorgen dat deze cellen bepaalde cellen aanvallen, en je kan ze gebruiken om een medicijn te dragen, hierdoor kunnen ze naast het vechten en vernietigen van de specifieke cellen ook een product loslaten die tegen de ziekte vecht. Daarnaast heb je epigenetica, het deel in de cellen die bepaalde genen uitschakelt. Elke cel heeft het zelfde DNA, maar toch hebben alle cellen een andere functie. Epigenetica zorgt dus dat elke cel hun eigen functies kunnen hebben. Wetenschappers hebben ontdekt hoe dat werkt en kunnen dat nu kunstmatig. Eén manier om dat voor elkaar te krijgen word ook wel epigenetische silencing genoemd. Deze techniek verklaard ook, gedeeltelijk, waarom eeneiige tweelingen niet dezelfde fenotypen hebben. Genen kunnen ook uitgezet worden door RNA. Dit kan alleen als het RNA in de vorm is van antisense transcripten, niet-coderende RNA’s or RNA interferentie. RNA kan genexpressie beïnvloeden door ervoor te zorgen dat heterochromatine wordt gevormd, of door histon modificaties en DNA methylering teweeg te brengen. Als laatste heb je Optogenetica, waarbij licht wordt gebruikt om neuronen te beïnvloeden, op deze manier kunnen bepaalde ziektes die de hersenen beïnvloeden onderzocht worden. Uiteindelijk kan deze techniek er ook voor zorgen dat de mensen met deze ziektes genezen kunnen worden. Bij deze techniek wordt DNA van een channelrhodopsin gebruikt om een eiwit te maken wat reageert op het licht. Dat DNA wordt op een bepaalde groep neuronen geplaatst
  35. 35. 34 en die neuronen worden dan onderzocht door de wetenschappers, die proberen uit te vinden wat er gebeurt als je die groep uitzet, of juist aanzet. En met behulp van de techniek ‘elektroforese’ wordt gekeken naar overeenkomsten in het DNA. Op deze manier kun je DNA van twee hele verschillende mensen vergelijken die beide een aanzienlijke leeftijd hebben bereikt maar hele verschillende leefstijlen hadden, om er zo achter te komen welke eigenschappen van het DNA overeenkomen. Die eigenschappen kunnen worden gebruikt in een medicijn.
  36. 36. 35 6. Nawoord Terwijl ik werkte aan mijn profielwerkstuk heb ik veel geleerd. Zo ben ik te weten gekomen welke technieken worden gebruikt om met behulp van DNA medicijnen te maken. Daarnaast weet ik nu ook hoe die technieken werken en waarvoor ze worden gebruikt. Het was heel leuk om te doen en ik hoop in de toekomst meer van dit soort projecten te kunnen ondernemen. Ik wil graag mevrouw Van Gameren bedanken dat ze me toestemming gaf om dit werkstuk alleen te mogen maken. Graag wil ik ook mevrouw Blenk bedanken voor de hulp die ze mij gaf bij dit project. Dit project was een uitdaging voor mij, een uitdaging waar ik erg naar uitzag en ik ben blij dat ik het mocht doen.
  37. 37. 36 7. Geraadpleegde literatuur Biotechnologie Learning Hub, B.L.H. (2014). Modern Biotechnologie. Laatst geraadpleegd op 03- 01-2015 via http://biotechlearn.org.nz/themes/what_is_biotechnology/modern_biotechnology Clinical Epigenetics, C.E. (2014). Clinical Epigenetics. Laatst geraadpleegd op 03-01-2015 via www.clinicalepigeneticsjournal.com Discover, D. (2006). DNA Is Not Destiny: The New Science of Epigenetics. Laatst geraadpleegd op 03-01-2015 via http://discovermagazine.com/2006/nov/cover DNA-Labs, D.L. (2014). Recombinant-DNA techniek. Laatst geraadpleegd op 03-01-2015 via www.dnalabs.nl/basisinfo/dna-werk/recombinant-dna-techniek.html Epigenetics and Chromatin, A.C. (2014). Epigenetics and Chromatin. Laatst geraadpleegd op 03- 01-2015 via www.epigeneticsandchromatin.com Genetics Home Reference, G.H.R. (2014). What is gene therapy? Laatst geraadpleegd op 03-01- 2015 via http://ghr.nlm.nih.gov/handbook/therapy/genetherapy GRID Arendal, G.R.I.D.A. (2008). Biotehnology and modern biotechnology defined. Laatst geraadpleegd op 03-01-2015 via http://www.grida.no/graphicslib/detail/biotechnology-and- modern-biotechnology-defined_b9d8 Hogeschool Rotterdam, H.R. (2014). Profielwerkstuk voorbereiden. Geraadpleegd op 27-11- 2014 via http://www.hogeschoolrotterdam.nl/studeren/profielwerkstuk/voorbereiden Learn.Genetics, U. (2014 a). Gene Therapy. Laatst geraadpleegd op 03-01-2015 via http://learn.genetics.utah.edu/content/genetherapy/ Learn.Genetics, U. (2014 b). Epigenetics. Laatst geraadpleegd op 03-01-2015 via http://learn.genetics.utah.edu/content/epigenetics/ Medscape, M. (2014). Hematopoietic stem cell transplantation. Laatst geraadpleegd op 03-01- 2015 via http://emedicine.medscape.com/article/208954-overview MIT, M.I.T. (2014). Optogenetics: Controlling the brain with light. Laatst geraadpleegd op 03-01- 2015 via http://video.mit.edu/watch/optogenetics-controlling-the-brain-with-light-7659/ Nature.com, N. (2014). Gene Therapy. Laatst geraadpleegd op 03-01-2015 via www.nature.com/gt/index.html
  38. 38. 37 NZORD, N.Z.O.R.D. (2014). Modern Biotechnology. Laatst geraadpleegd op 03-01-2015 via www.nzord.org.nz/research/modern_biotechnology OECD, O.E.C.D. (1999). Modern Biotechnologie and the OECD. Laatst geraadpleegd op 03-01- 2015 via http://www.oecd.org/science/biotech/1890904.pdf Open Optogenetics, O.O. (2011). Open Optogenetics. Laatst geraadpleegd op 03-01-2015 via www.openoptogenetics.org Quora, Q. (2014). DNA. Laatst geraadpleegd op 03-01-2015 via http://www.quora.com/search?q=DNA Science, S. (2014). What is epigenetics. Laatst geraadpleegd op 03-01-2015 via http://m.sciencemag.org/content/330/6004/611 Scitable, N. (2014). Epigenetic Influences and Disease. Laatst geraadpleegd op 03-01-2015 via www.nature.com/scitable/topicpage/epigenetic-influences-and-desease-895 Stanford, S. (2014). Optogenetics. Laatst geraadpleegd op 03-01-2015 via http://web.stanford.edu/group/dlab/optogenetics/ Weebly, W. (2014). Optogenetics. Laatst geraadpleegd op 03-01-2015 via http://optogenetics.weebly.com/what-is-it.html
  39. 39. 38 Bijlage Tirumalai Kamala’s answer to: What is a DNA vaccin? At its simplest, a DNA vaccine is just a bacterial plasmid, containing one or more genes from a parasite, a bacterium, a virus or a tumor cell, coupled to a mammalian promoter for driving protein expression inside our body. Once inside our cells, the plasmid doesn't (or shouldn't) replicate but its gene(s) are transcribed and translated into protein(s), which in turn are targeted by our immune responses through mechanisms that we don't fully understand. Where did the idea of DNA Vaccines come from? Foreign DNA is transcribed 1. In 1950, chromatin derived from a tumor cell transfers malignancy to a normal cell (1). In 1960, naked DNA could be delivered into mammalian cells in vivo (2). 2. Hepatitis viral DNA causes hepatitis when injected into animals (3, 4). 3. In 1983, protein is expressed in vivo when a plasmid containing its gene is injected into rats (5) or in mouse muscle (6). Foreign DNA is immunogenic 1. In 1963, DNA or RNA from liver could induce Type I interferons from chicken cells (7). 2. In 1965, mycobacterial ribosomes and RNA are immunogenic (8). 3. In 1984, DNA from BCG has anti-tumor activity (9). 4. A 1992 study injects plasmids containing human Growth Hormone (hGH) gene into the ears of mice (10). A few weeks later, many, not all, mice have high circulating antibodies against hGH. Shortly after, in other studies, DNA plasmids encoding flu antigens protect mice against lethal flu (11, 12).
  40. 40. 39 Foreign DNA could be a vaccine? What has happened since? Lots, some useful, much not. From Reference 13 How are DNA vaccines made? Constructing a DNA vaccine entails many choices, choices tempered by regulatory guidelines (14, 15, and 16). What antigens? Wild type or mutated genes? Membrane-bound, intracellular or secreted antigens? What type of plasmid (and promoters, enhancers, and introns)? Delivered how? Where? Skin or muscle? Dose? Adjuvants? Boosted how and how often? Each of these choices greatly influence the effectiveness of the resulting DNA vaccine, effectiveness alluding to strength and type of immune responses, anything from neutralizing antibodies to cytotoxic CD8 killer cells. For illustration purposes, let's look at this graphic that describes the steps necessary in constructing a DNA vaccine for West Nile virus.
  41. 41. 40 From DNA vaccines and the future of disease control
  42. 42. 41 How are DNA vaccines delivered? (20, 23, 24, 25) Originally they were injected directly into muscle. This resulted in variable and less immunogenic uptake. An innovation called the gene gun shot DNA coated onto gold micro particles into the skin using pressurized gas. Improved uptake but not by much. Then came electroporation. Here simple electrodes generate electric pulses across the cell membrane to transiently induce pores in the cell membrane (cell electropermeabilization), promoting cellular uptake of DNA (17, 18). A variation of the gene gun approach, the Particle-Mediated Epidermal Delivery (PMED) directs delivery into skin, primarily into keratinocytes (19). This method also improves uptake (20). DNA tattooing is a newer delivery method (21, 22), highly immunogenic possibly due to skin damage by tattoo needles. Advantages of DNA Vaccines (20, 23, 24, 25, 26) 1. Easier, cheaper, safer. Let's consider a bit. Targets of vaccines are usually microbes or tumors capable of terrible disease and/or mortality. With DNA vaccines, we don't work directly with a dangerous microbe or tumor. We don't have to culture it, inactivate it or purify proteins from it. We just choose microbial or tumor genes likely to drive strong and specific immune responses and clone them into a plasmid. 2. More natural. Almost counter-intuitively so compared to their closest counterpart, sub- unit vaccines. Typically, non-living vaccines require lengthy and tedious purification of the constituent proteins, processes that inherently introduce changes that could change, subvert or minimize immune responses against these proteins' natural counterparts. With DNA vaccines, our bodies own cells synthesize these proteins, replicating their native structures and essential post-translational modifications, likely mimicking their natural capacity to induce immunity. 3. Much easier to change (mutate). This is an advantage with viruses that rapidly drift, i.e. frequently change antigen coding sequences, e.g. flu. 4. More practical and realistic. Plasmid DNA is stable at room temperature hugely reducing costs for storage and shipping. Most other types of vaccines need to be kept and shipped cold. Refrigerators and refrigerated trucks, the so-called cold chain, are too expensive to be norm the world over. Disadvantages of DNA vaccines (20, 23, 24, 25, 26) 1. Plasmid DNA could integrate into the cell's DNA. Depending on the site of such integration, at least three adverse outcomes are possible. Either the integration could turn on an oncogene, turn off a tumor suppressor gene, or induce chromosomal instability. How does plasmid DNA integration compare with spontaneous gene mutation frequencies? The standard accepted value is 2X10-6 spontaneous gene- inactivating mutations per gene (20, 27). While there is no known human study that did such a comparison, mouse, rabbit and guinea pig model studies confirmed DNA vaccine genomic integration but at rates much lower than this standard value (28, 29, 30, 31, 32, 33, 34)
  43. 43. 42 2. Not useful for polysaccharide vaccines. Genes are translated into proteins. DNA vaccines aren't useful for microbes where immune responses against polysaccharides are necessary and sufficient to prevent disease. For example, against pneumococcal and meningococcal infections. 3. Risk of auto-immunity. If the target of the immune responses against anti-DNA vaccine included common elements between it and our own DNA, it could trigger auto- immunity. However, while circulating anti-double stranded DNA antibodies increased in mice following DNA vaccination (35), same was not seen in humans (36). DNA vaccines in humans: Disappointing results thus far. (20, 23, 24, 37, 50, 71) Nearly 20 years and counting, human clinical trials of DNA vaccines for flu, hepatitis B, HIV, malaria and cancer ended with largely disappointing results. Vaccines that worked well at earlier stages, inducing strong immune responses in mouse models, just didn't work as well in humans. Why? Insufficient expression? In hindsight, maybe these vaccines were optimized for mouse models, not for humans? At a minimum, they were safe when injected into humans, with local injection site reaction being the most commonly reported side effect (38, 39, 40, and 41). What about autoimmunity? Published reports suggest not (36). How do DNA vaccines drive immunity? This is still a mystery. Let's first make explicit the nature of this mystery. A DNA vaccine is quite simply gene(s) encoding protein(s) derived from microbes or from tumor cells. How could proteins derived from these genes drive immunity? After all, our cells make all kinds of proteins all the time. In health, we don't make immune responses against them...unless those proteins were made in the context of death or damage, i.e. something that activated the so-called innate arm of immunity. After all, immunity is so powerful, plenty of checks and balances exist for getting it started and sustained. So what could be happening with DNA vaccines? Considered in this light, there are at least three targets. 1. One, the bacterial DNA plasmid with its abundant unmethylated CpGmotifs, itself a likely target of mammalian immunity. 2. Two, location, i.e. double-stranded DNA in the cytoplasm. Surely, that's abnormal? 3. Three, if one and two trigger immune activation of a cell, surely the protein product(s) of such DNA would automatically feed into the ongoing immunity? Now, let's consider the players involved. 1. Professional antigen-Presenting Cells (pAPCs). Why are they important? pAPCs are necessary for a strong CD4 T cell response. Without CD4 T cell help, B cell and CD8 T cell responses are weak and transient. Current DNA vaccines are designed to specifically target and stimulate APCs (42) but they aren't delivered into the body to do so (43). For practical and not scientific reasons, we choose to give most experimental DNA vaccines intramuscularly, i.e. inject them inside muscle cells. Muscle tissue is considered lacking in pAPCs and myocytes considered poor at driving immune responses. Less
  44. 44. 43 straightforward approach? Yes. Unnecessary complication? Yes. Immunological surprise? Undeniably so. At least in a mouse model, DNA vaccines encoding antigens driven by myocyte-specific promoters were similarly immunogenic compared to other, more common promoters (44). At the very least, such studies demonstrate that even when we deliver DNA vaccines into sites that current paradigms predict are unfavorable for immunity, robust immunity can and does ensue. 2. TLR9. Bacterial DNA has abundant unmethylated CpG motifs. Such motifs induce strong immune responses by triggering activation of molecules such as TLR9. However, mice lacking TLR9 respond similarly to DNA vaccines (45, 46, 47, 48, 49, and 50). 3. Double-stranded DNA in cytoplasm: cause for alarm? When we inject DNA vaccines, we directly deliver double-stranded DNA into a cell's cytoplasm. The nucleus is the normal location for DNA. Surely the cytoplasm is an abnormal location for double- stranded DNA? Surely that must happen only when a cell is infected, distressed, damaged or dying? Surely, over evolutionary time, we must have evolved systems to sense double-stranded DNA in the cytoplasm? We are still hunting for such mystery cytoplasmic DNA sensor(s) (51, 52). Recent mouse model studies suggests we may be close with molecules such as TBK1, IRF3 and STING (53, 54, 55, and 56). Caveat being mouse studies. If past is any guide to present and future, mouse model immune responses are slightly too radically different from those in humans. As good as wishing on a shooting star. From Reference 50
  45. 45. 44 From Reference 57 4. We are still unclear how much of the immune response is against the antigen(s) encoded by the plasmid versus the plasmid itself. Maybe once inside the cytoplasm, DNA vaccines induce changes similar to those induced by Inclusion or certain viruses (58)? Such instability or imbalance inside the host cells could in turn induce metabolic changes (59) such as local accumulation of uric acid, which in turn could trigger immune responses (50, 60). 5. Cells that take up DNA vaccines could turn over faster, with more rapid cell death (61), leading to extracellular DNA release which would trigger immune responses.
  46. 46. 45 Approved DNA vaccines Not withstanding disappointing human data and the mystery about how they drive immunity, several veterinary DNA vaccines have been approved. From Reference 24 1. West Nile Virus, Horses, USA (62, 63). 2. Infectious hematopoietic necrosis virus, Salmon, Canada (64, 65). 3. Melanoma, Dogs, USA (66, 67). 4. Growth hormone releasing hormone, Pigs, Australia (68, 69, 70). Where are DNA vaccines today? In a disappointing place, at least for humans. Full circle with so-called heterologous prime- boost vaccination protocols with DNA vaccine prime followed by viral vector boost (13, 24, and 71). All the advantages I pointed out in the beginning? Down the drain because a viral vector boost negates them all. My reading of the literature suggests that tremendous effort was expended in designing DNA vaccines that seem optimal for mouse and other non- human pre-clinical models. When the success of those models didn't translate into equally successful human data, does that not suggest at the very least that such models don't predict human immunity, at least not very well? Why not focus instead on improving DNA vaccine design exclusively for humans, using in vitro human models to guide the path? Maybe we would end up with a human DNA vaccine that worked by itself, either injected once or boosted, greater likelihood of regulatory approval, and without added bells and whistles that increase cost, artifice and difficulty,
  47. 47. 46 Bibliography 1. Production of Neoplasms by Injection of Fractions of Mammalian Neoplasms 2. A tumor-producing factor extracted by phenol from papillomatous tis... 3. Cloned HBV DNA causes hepatitis in chimpanzees. 4. Page on nih.gov 5. Page on nih.gov 6. Wolff, Jon A., et al. "Direct gene transfer into mouse muscle in vivo. “Science 247.4949 (1990): 1465-1468. Direct gene transfer into mouse muscle in vivo 7. Isaacs, A., R. A. Cox, and Z. Rotem. "Foreign nucleic acids as the stimulus to make interferon." The Lancet 282.7299 (1963): 113-116. 8. Page on nih.gov 9. Tokunaga, Tohru, et al. "Antitumor activity of deoxyribonucleic acid fraction from Mycobacterium bovis BCG. I. Isolation, physicochemical characterization, and antitumor activity." Journal of the National Cancer Institute 72.4 (1984): 955-962. 10. Tang, De-chu, Michael DeVit, and Stephen A. Johnston. "Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune response."Nature 356.6365 (1992): 152-154. 11. Page on nih.gov 12. Ulmer, Jeffrey B., et al. "Heterologous protection against influenza by injection of DNA encoding a viral protein." Science 259.5102 (1993): 1745-1749. 13. DNA/MVA Vaccines for HIV/AIDS 14. Page on fda.gov 15. Page on ema.europa.eu 16. Page on ema.europa.eu 17. Page on nih.gov 18. Page on nih.gov 19. DNA vaccination protects against an influenza challenge in a double-blind randomised placebo-controlled phase 1b clinical trial. 20. Page on www.njmonline.nl 21. Bins, Adriaan D., et al. "A rapid and potent DNA vaccination strategy defined by in vivo monitoring of antigen expression." Nature medicine 11.8 (2005): 899-904. https://openaccess.leidenuniv.nl/bitstream/handle/1887/11457/03.pdf?...
  48. 48. 47 22. Verstrepen, Babs E., et al. "Improved HIV-1 specific T-cell responses by short-interval DNA tattooing as compared to intramuscular immunization in non-human primates." Vaccine 26.26 (2008): 3346-3351. 23. Page on nih.gov 24. From Concepts to Applications 25. Page on www.actabp.pl 26. Page on nih.gov 27. Cole, J., and T. R. Skopek. "International Commission for Protection Against Environmental Mutagens and Carcinogens. Working paper no. 3. Somatic mutant frequency, mutation rates and mutational spectra in the human population in vivo." Mutation research 304.1 (1994): 33-105. 28. Pal, Ranajit, et al. "Definitive toxicology and biodistribution study of a polyvalent DNA prime/protein boost human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) vaccine in rabbits." Vaccine 24.8 (2006): 1225-1234. 29. Page on karger.com 30. Martin, Terrie, et al. "Plasmid DNA malaria vaccine: the potential for genomic integration after intramuscular injection." Human gene therapy10.5 (1999): 759-768. 31. Nichols, Warren W., et al. "Potential DNA vaccine integration into host cell genome." Annals of the New York Academy of Sciences 772.1 (1995): 30-39. 32. Page on nature.com 33. Page on nih.gov 34. Faurez, Florence, et al. "Biosafety of DNA vaccines: New generation of DNA vectors and current knowledge on the fate of plasmids after injection." Vaccine 28.23 (2010): 3888- 3895. Biosafety of DNA vaccines: New generation of DNA vectors and current knowledge on the fate of plasmids after injection. 35. Page on nature.com 36. Page on nih.gov 37. Liu, Margaret A. "DNA vaccines: an historical perspective and view to the future." Immunological reviews 239.1 (2011): 62-84. 38. Page on nih.gov 39. Vardas, Eftyhia, et al. "Indicators of therapeutic effect in FIT-06, a Phase II trial of a DNA vaccine, GTU< sup>®</sup>-Multi-HIVB, in untreated HIV-1 infected subjects." Vaccine 30.27 (2012): 4046-4054. Page on osakeannit.fi 40.Page on plosone.org
  49. 49. 48 41. Bagarazzi, Mark L., et al. "Immunotherapy against HPV16/18 generates potent TH1 and cytotoxic cellular immune responses." Science translational medicine 4.155 (2012): 155ra138-155ra138. Page on stanford.edu 42. Targeting Dendritic Cells to Enhance DNA Vaccine Potency 43. Page on nature.com 44.No Effect on DNA-Raised Immune Responses 45. Page on jimmunol.org 46. Page on nih.gov 47. Tudor, Daniela, et al. "TLR9 pathway is involved in adjuvant effects of plasmid DNA- based vaccines." Vaccine 23.10 (2005): 1258-1264. 48. Page on nih.gov 49. Ligtenberg, Maarten A., et al. "NF-κB activation during intradermal DNA vaccination is essential for eliciting tumor protective antigen-specific CTL responses." Human Vaccines & Immunotherapeutics 9.10 (2013): 2189-2195. 50. Page on nih.gov 51. Ishii, Ken J., et al. "A Toll-like receptor–independent antiviral response induced by double-stranded B-form DNA." Nature immunology 7.1 (2005): 40-48. 52. Extrachromosomal Histone H2B Mediates Innate Antiviral Immune Responses Induced by Intracellular Double-Stranded DNA 53. Ishii, Ken J., et al. "TANK-binding kinase-1 delineates innate and adaptive immune responses to DNA vaccines." Nature 451.7179 (2008): 725-729. 54. Ishikawa, Hiroki, Zhe Ma, and Glen N. Barber. "STING regulates intracellular DNA- mediated, type I interferon-dependent innate immunity." Nature 461.7265 (2009): 788-792. 55. Page on nih.gov 56. Page on nih.gov 57. Innate Immune Signaling by, and Genetic Adjuvants for DNA Vaccination 58. Page on nih.gov 59. Ishii, Ken J., and Shizuo Akira. "Potential link between the immune system and metabolism of nucleic acids." Current opinion in immunology 20.5 (2008): 524-529. 60. Desmet, Christophe J., and Ken J. Ishii. "Nucleic acid sensing at the interface between innate and adaptive immunity in vaccination." Nature Reviews Immunology 12.7 (2012): 479-491.
  50. 50. 49 61. http://www.nature.com/icb/journa... 62. Davidson, Ann H., et al. "Immunologic responses to West Nile virus in vaccinated and clinically affected horses." Journal of the American Veterinary Medical Association 226.2 (2005): 240-245. 63. Page on nih.gov 64. Page on int-res.com 65. Page on int-res.com 66. Long-Term Survival of Dogs with Advanced Malignant Melanoma after DNA Vaccination with Xenogeneic Human Tyrosinase 67. Bergman, P. J., et al. "Development of a xenogeneic DNA vaccine program for canine malignant melanoma at the Animal Medical Center." Vaccine24.21 (2006): 4582-4585. 68. Khan, Amir S., et al. "Effects of maternal plasmid GHRH treatment on offspring growth." Vaccine 28.8 (2010): 1905-1910. 69. Page on nih.gov 70. Plasmid-mediated growth hormone-releasing hormone efficacy in reducing disease associated with Mycoplasma hyopneumoniae and porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection 71. DNA Vaccines: Recent Developments and the Future

×