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Simposio: Edición de genoma (Webinar introductorio)

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Presentaciones durante el webinar introductorio al Simposio: Edición de genoma. Cambiando la investigación agricola en América Latina.

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Simposio: Edición de genoma (Webinar introductorio)

  1. 1. Serie de Simposios de DuPont Plant Sciences Octubre 17 y 18 Centro Internacional de Agricultura Tropical-CIAT Palmira-Valle, Colombia Con el apoyo de
  2. 2. Presentación del Webinar • Introducción a la edición de genomas Alejandro Brand, BSc CIAT • Errores innatos del metabolismo Pedro M. Hernández, MSc Pontificia Universidad Javeriana-Cali • Detección y diagnóstico de enfermedades Mónica Carvajal, PhD CIAT
  3. 3. Introducción a la Edición de Genomas Alejandro Brand, BSc Plataforma de Transformación y Edición de Genomas CIAT
  4. 4. Generar cambios/mutaciones permanentes y heredables en un sitio específico del ADN. Estos cambios son mediados por los sistemas de reparación del ADN de la maquinaria celular, que posibilitan la inserción, deleción o alteración de las secuencias. Aplicaciones • Función génica: Knock-out • Reemplazo de alelos, inserciones, Knock-in. • Regulación de la expresión génica y epigenética • Gene Drive ¿Qué significa editar un genoma? https://ghr.nlm.nih.gov/primer/genomicresearch/genomeediting
  5. 5. ¿Para qué editar un genoma? • Estudiar la función de los genes (Reverse genetics) • Tratamientos para combatir efermedades humanas (HIV, Cancer, etc) • Corregir enfermedaes hereditarias en embriones humanos • Crear modelos animales para el estudio de enfermedades y tratamientos farmacológicos. • Mejorar el desempeño de cultivos • Controlar la propagación de enfermedades (Malaria, Zika,) (Genedrive) • Entender los factores de la regulación epigenética http://www.cell.com/cell/abstract/S0092-8674(14)00604-7
  6. 6. Cambios en el ADN (Mutaciones): fuente de variación genética Rio Red Grapefruit https://www.thetreecenter.com/rio-red-grapefruit-tree/
  7. 7. Zinc-Fingers Dominio de unión al DNA + Endonucleasa Transcription Activator-Like Effector Nucleases (TALENs) Activadores de Transcripción + Endonucleasa Herramientas moleculares usadas en edición de genomas CRISPR associated Cas9 Nucleasa bacteriana + RNA guía
  8. 8. CRISPR/Cas: Sistema inmune bacteriano adquirido CRISPR-Cas9: Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats. http://rna.berkeley.edu/crispr.html
  9. 9. J. Doudna UC-Berkely E. Charpentier Max Plank-Berlin F. Zhang (MIT-Broad Institute) Francisco J.M. Mojica U-Alicante
  10. 10. En 2015, el número de artículos relacionados con CRISPR (1185) casi triplicó la cantidad de artículos en los que se utilizaban algunas tecnicas de edición anteriores (397). Publicaciones relacionadas con CRISPR (2011-2015) https://www.elsevier.com/research-intelligence/campaigns/crispr
  11. 11. CRISPR/Cas9
  12. 12. Inserciones/deleciones Mutaciones de tamaño variable Sistemas de reparación del DNA Ran et al. 2013. Nat Protoc. 8:2281 Mutación/modificación precisa
  13. 13. ¿Qué se necesita para editar un genoma?
  14. 14. Una mutación en el receptor CCR5 de las células inmunes, impide el ingreso del virus. Terapia génica para tratar el HIV
  15. 15. Eliminación de virus endógenos en cerdos https://www.egenesisbio.com/technology/ • Edición de PERVs (Porcine endogenous retrovirus) como avance en el uso de Xenotransplantes • Futuro: Editar genes relacionados con inmunocompatibilidad
  16. 16. Gene drive https://s1-ssl.dmcdn.net/lBSTc.jpg Difusión de variantes alelicas en la población a través de la edición genomas de poblaciones silvestres. Uso potencial en genes responsables de la transmisión de virus y parásitos. ¿Cómo propagar una modificación genética de unos cuantos mosquitos generados en el laboratorio a toda una población silvestre en corto tiempo? Herencia Mendeliana convencional
  17. 17. Gene drive https://s1-ssl.dmcdn.net/lBSTc.jpg Drive sequence Cas9 Protein sgRNA Gen modificado Difusión de variantes alelicas en la población a través de la edición genomas de poblaciones silvestres. Uso potencial en genes responsables de la transmisión de virus y parásitos.
  18. 18. Gene drive https://s1-ssl.dmcdn.net/lBSTc.jpg Difusión de variantes alelicas en la población a través de la edición genomas de poblaciones silvestres. Uso potencial en genes responsables de la transmisión de virus y parásitos. La secuencia drive fue heredada con una eficiencia ≥ 98%
  19. 19. KO: Polyphenol oxidase (PPO) - Oxidación KO: granule bound starch synthase GBSSI – Almidón tipo ceroso (Waxy) KO: Genes FAD2: Menos ácidos grasos poliinsaturados, + acumulación de aceite. KI: TALENs, inserción alelo en el gen POLLED
  20. 20. Errores Innatos del Metabolismo. Pedro M. Hernandez, MSc., PhD student. Pontificia Universidad Javeriana-Cali
  21. 21. Contenido Introducción y Justificación Bases Teóricas Estrategias Terapéuticas para el Tratamiento de los Errores Innatos del Metabolismo, EIM.
  22. 22. Introducción y Justificación.
  23. 23. Los EIM son un grupo de enfermedades de origen genético, que como entidades individuales presentan muy baja prevalencia, pero que como grupo de enfermedades tienen un alto impacto en la morbilidad y mortalidad infantil. http://www.metascreen.com.my/newborn-screening/what-is-newborn-screening Errores Innatos del Metabolismo, EIM:
  24. 24. Indels y Polimorfismos de único nucleótido, SNPs. https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/a/a3/Mutaci%C3%B3n_ADN.jpg/250px-Mutaci%C3%B3n_ADN.jpg http://1.bp.blogspot.com/-Pt_BTnxQflE/UaA4pqbjUGI/AAAAAAAAAFU/8vCGaJfd1v0/s1600/mutacion_adn.gif http://fr.cdn.v5.futura-sciences.com/buildsv6/images/largeoriginal/0/7/9/0795b855fe_50036520_rnapol-abbondanzieri-dp.jpg
  25. 25. Modificación Post traduccional, el role de las chaperonas en el plegamiento de proteínas y la identificación de errores. Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
  26. 26. X Consecuencias de la degradación prematura de proteínas: Enfermedades de Acúmulo Lisosomal, LSDs Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) http://images.slideplayer.es/8/2417390/slides/slide_23.jpg http://www.16deabril.sld.cu/rev/218/image/gaucher2.png
  27. 27. CRISPR-Cas9 como Estrategia Terapéutica para el Tratamiento de los Errores Innatos del Metabolismo, EIM.
  28. 28. Estrategias terapéuticas para el tratamiento de los EIM Trasplante de Células Hematopoyéticas https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/c/cb/Bone_marrow_biopsy.jpg https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/7/78/Cellular_tight_ https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/1/19/Membrantransport.p
  29. 29. Kimura Y, Oda M, Nakatani T, Sekita Y, Monfort A, Wutz A, et al. CRISPR/Cas9-mediated reporter knock-in in mouse haploid embryonic stem cells. Sci Rep. 2015 https://www.youtube.com/watch?v=D2PLICc3-hM Kimura Y, Oda M, Nakatani T, Sekita Y, Monfort A, Wutz A, et al. CRISPR/Cas9-mediated reporter knock-in in mouse haploid embryonic stem cells. Sci Rep. 2015 https://thedotingskeptic.wordpress.com/2016/02/06/crispr-cas9-not-just-another-scientific-revolution/ Homology-dependent double strand break repair
  30. 30. http://pirros.tripod.com/gaucher/celulamacrofaga.jpg Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) http://www.jci.org on September 30, 2017. https://doi.org/10.1172/JCI21476 * * * * * ** * * * * *
  31. 31. CRISPR-Cas9, Retos y Potenciales. https://www.savalnet.cl/cienciaymedicina/progresosmedicos/en-el-corazon-de-la-edicion-genica.html Ma H, Marti-Gutierrez N, Park S-W, Wu J, Lee Y, Suzuki K, et al. Correction of a pathogenic gene mutation in human embryos. Hong Ma Professor of Biology Huck Distinguished Research Professor Molecular Biology Cardiomiopatía Hipertrófica * Padres Homocigoto Recesivo. * Enfermedad Genética Dominante
  32. 32. Otros Usos de CRISPR-Cas9 en Salud https://www.cancer.gov/about-cancer/treatment/research/car-t-cells Emily Whitehead y Layla Richards El CAR en la superficie de la célula está compuesto de fragmentos, o dominios, de anticuerpos sintéticos. Los dominios que se utilizan pueden afectar hasta qué punto el receptor reconoce o se une al antígeno en la célula tumoral. Avances en la ingeniería intracelular de las células Expanción clonal Tiempo de sobrevida en circulación = Persistencia.
  33. 33. Detección de ácidos nucleicos con CRISPR-Cas13a Monica Carvajal, PhD Virología CIAT
  34. 34. Cas: Proteinas asociadas a CRISPR Diversidad de sistemas CRISPR-Cas Sistema Clase Tipo Aislado Proteina Cas Blanco Aplicación CRISPR/Cas9 2 II Streptococcus pyogenes Cas9 DNA Edición genomas CRISPR/Cas13a 2 VI Leptotrichia shahii C2c2 (Cas13a) RNA Detección / Diagnóstico
  35. 35. Mark A. Young CRISPR: Un enfoque alternativo para detectar virus Yellowstone National Park Metagenomic date sets- CRSPR spacers library (2000) Microarrays Spacer’s probes • Diseño una plataforma de micro arreglos utilizando las secuencias espaciadoras de CRISPR (son a menudo derivados de virus) como sondas para detectar virus. • Las secuencias espaciadoras dentro de los loci CRISPR pueden servir como un registro de los virus que se han replicado dentro de la célula • Permite detectar virus que no se han caracterizado previamente • Demostraron que puede ser usado para monitorear cambios temporales de la poblaciones virales dentro de un ambiente. Virus diversity ~500 (25%) Snyder et.al., 2010
  36. 36. El uso de CRISPR para el diagnóstico: CRISPR-Dx Specific High-sensitity Enzymatic Reporter unLOCKing Feng ZhangJames Collins • Detección de patógenos (nivel attomolar) • Genotipificación • Monitoreo de enfermedades CRISPR-Dx: SHERLOCK Esta plataforma combina: • La enzima Cas13a (blanco ARN) • Una amplificación isotérmica CRISPR-Cas13a 2017
  37. 37. El Sistema de detección SHERLOCK ARN ADN Reacción de amplificacion Grandes cantidades de ADN Crear copias de ARN T7RPA
  38. 38. SHERLOCK + Cas13a crARN Cas13a OFF ON = Secuencia blanco Cas13a crARN +
  39. 39. Cas13a + Cas13a crARN OFF ON = Secuencia blanco SHERLOCK SEÑAL
  40. 40. SHERLOCK en comparación con otros métodos Sensible Específico Sencillos Rápido Bajo costo Gotenberg et al, 2017 qPCR RPA-SYBR green SHERLOCK Digital droplet PCR
  41. 41. 1) Diagnóstico de enfermedades infecciosas 2) Genotipificación rápida en humanos Aplicaciones de SHERLOCK Gotenberg et al, 2017
  42. 42. El virus del zika (ZIKV)-ARN Síntomas tales como: fiebre no muy elevada, exantema, conjuntivitis, dolores musculares y articulares, malestar o cefaleas. Asociado a microcefalia en neonates y síndrome de Guillan-Barré Sherlock es capaz de detectar con alta sensibilidad ZIKV 2aM (1,25 cp/ul) en muestras de suero (S) y Orina (U) Detección del virus del Zika (ZIKV) con SHERLOCK Gotenberg et al, 2017
  43. 43. CRISPR-Dx para identificar bacterianas http://www.huffingtonpost.com https://sueishaqlab.org GEN ARN ribosomal 16S Gotenberg et al, 2017 SHERLOCK logro sensibilidad y detección específica de E. coli y P. aeruginosa
  44. 44. 1) Diagnóstico de enfermedades infecciosas 2) Genotipificación rápida en humanos Aplicaciones de SHERLOCK Gotenberg et al, 2017
  45. 45. • Introducción de cambios sintéticos en los crRNAs para detector diferencias en un solo nucleótido • Oportunidad para usar SHERLOCK para genotipificación rápida en humanos Genotipificación rápida en humanos • Seleccionaron 5 loci en diferentes cromosomas • SNPs asociados a problemas de salud Colección de saliva gDNA Genotipificaron SHERLOCK
  46. 46. SHERLOCK distingue alelos asociados a enfermedad
  47. 47. papel de filtro Autoclavado Bloqueo (BSA) Remocion de RNasas Lavado Congelado-secado Preparación Reacción Cas13 Muestra RPA SHERLOCK: Rápido, portable y bajo costo $ 0,61 USD/ muestra +T7polymerase
  48. 48. CRISPR-Dx en el campo Monitoreo y vigilancia de enfermedades Evaluar la diversidad genética de los cultivos Asistir la toma de decisiones para la edición de genomas Diagnóstico rápido, sensible, confinable y a bajo costo
  49. 49. Gracias! ©J.C.Martínez

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