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Italia-VenezuelaResultados del proyecto conjunto en el  diagnostico serologico del Mal de Chagas2009-2010<br />Laura Cerni...
COLABORADORES<br />Lic. Franca Pace Instituto Inmunologia UCV<br />Lic. Anny Perez   Instituto Medicina Tropical<br />Lic....
Mal de Chagas<br />Un profundo Agradecimiento:   <br />Emb. Luigi Maccotta   <br />Dr. Alfredo Giorgi<br />Dra. Belkisyolè...
Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR)<br />Istituto di neurobiologia e medicina molecolare (INMM)<br />BIO GENETIX srl ...
… LA HISTORIA CONTINUA <br />Byo Research Srl<br />Instituto de Medicina Tropical    <br />Sección de Immunología<br />Mal...
Mal de Chagas<br />Por Què Juntos?<br />Instituto de Medicina Tropical    <br />Sección de Immunología<br />Know-how venez...
Mal de Chagas<br />METODOS DIAGNOSTICOS<br />Analisis directo – Bùsquedadel Trypanosoma cruzi <br />FASE AGUDA<br />1. Anà...
Diagnosi del Mal de Chagas<br />Anàlisis serologico – Bùsqueda de Ac anti-T. cruzi<br />FASE CRONICA<br />TEST CONVENCIONA...
Mal de Chagas<br />Exigencias en el diagnòstico de Chagas<br />Epidemiafase aguda<br />Tratamiento clìnico/farmacològico...
Mal de Chagas<br />Puntos Crìticos en el diagnòstico de Chagas<br />Ausencia de un test de referencia internacional<br />(...
Mal de Chagas<br />Còmo diagnosticar Mal de Chagas  (OPS – OMS)<br />Laura Cerni PhD - ByoResearch srl – Area Science Park...
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ENEASYSTEMIII – BIO GENETIX srl unipersonale<br />EfficientNewEnzymaticAntigenSYSTEM<br />Mal de Chagas<br />Multiparàmetr...
Mal de Chagas<br />ENEASYSTEMIII – BIO GENETIX srl unipersonale<br />Multiparàmetrico<br />Anàlisis de varios paràmetros s...
Test Chagas conAg Puro Entero (IMT)</li></ul>Cuantitativo(U/ml)<br />Test Automatizado– 150 anàlisis 90 min<br />Laura Cer...
Antìgenos:<br />Mal de Chagas<br />Antìgeno purificado entero - IMT<br />Extracto total del epimastigote<br />Antìgeno rec...
A.C.E. – Allergen/AntigenChamberEnzymatic<br />mm<br />2<br />15 <br />25<br />Mal de Chagas<br />FASE SOLIDA<br />5 micro...
Mal de Chagas<br />PANEL MUESTRAS<br /><ul><li>Caracterizaciòn clìnica
Caracterizaciòn serològica con una metòdica de referencia</li></ul>Positivos– en lo posible Fase Aguda/Crònica<br />Sensib...
RESULTADOS PRELIMINARES Antigeno TcF<br />PANEL SUEROS<br /><ul><li>Sueros positivosChagas IgG   </li></ul>n=13  Poblaciòn...
VALIDACION EXTERNA <br />antigeno TcF<br />Realizada enel Laboratorio del IDI-UCV <br />Caracas - Venezuela <br />PANEL DE...
RESULTADOS PRELIMINARES <br />Antigeno TcF<br />Cut off 150<br />Sensibilidad  92.3% - Especificidad  100%<br />Cut off 25...
VALIDACION EXTERNA <br />antìgeno TcF<br />Cut-off270<br />sensibilidad 99% - specificidad 97%<br />Cut-off150 <br />sensi...
VALIDACION EXTERNA <br />antigeno TcF<br />Cut-off150 <br />sensibilità 99% - specificità 69%<br />Cut-off270<br />sensibi...
VALIDACION EXTERNA<br />Antìgeno TcF<br />CROSS-REACTIVIDAD<br />0.0%<br />0.0%<br />20.0%<br />0.0%<br />5.2%<br />4.3%<b...
VALIDACION INTERNA<br />Ag recombinante TcF <br />Ag purificado entero IMT<br />Realizada en Byo Research srl<br />PANEL D...
VALIDACION INTERNA <br />antìgeno TcF<br />Cut-off200<br />Sensibilidad 98% - Especificidad 100%<br />Cut-off300<br />Sens...
VALIDACION INTERNA <br />antìgeno IMT<br />Cut-off200<br />sensibilidad 100% - especificidad 96%<br />Cut-off300<br />sens...
Discusion de los resultados<br />Luego optimizaciòn de la fase sòlida <br />Y del tampone di dilucion sueros<br />Validaci...
Analisis Cuantitativo <br />Mal de Chagas<br />Cut-offTcF<br />200 – 300  ABS<br />0.08 – 0.11 U/ml<br />Cut-off IMT <br /...
Diagnostico Mal de Chagas<br />Correlacion  test ENEASYSTEM III y Microplaca (96 pozos)<br />n = 30 sueros positivos<br />...
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Presentazione chagas caracas 2010 12 giugno 2010

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Presentacion Chagas, Festival Italiano 2010

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Presentazione chagas caracas 2010 12 giugno 2010

  1. 1. Italia-VenezuelaResultados del proyecto conjunto en el diagnostico serologico del Mal de Chagas2009-2010<br />Laura Cerni PhD - ByoResearch srl – Area Science Park – Trieste - Italy<br />Caracas, 12 giugno 2010<br />
  2. 2. COLABORADORES<br />Lic. Franca Pace Instituto Inmunologia UCV<br />Lic. Anny Perez Instituto Medicina Tropical<br />Lic. Vanessa Nardelli Byo Latin America<br />
  3. 3. Mal de Chagas<br />Un profundo Agradecimiento:   <br />Emb. Luigi Maccotta   <br />Dr. Alfredo Giorgi<br />Dra. Belkisyolè de Noya<br />Dr. Isaac Blanca<br />Dr. Piero Di Dio<br />Laura Cerni PhD - ByoResearch srl – Area Science Park – Trieste - Italy<br />Caracas, 12 giugno 2010<br />
  4. 4. Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR)<br />Istituto di neurobiologia e medicina molecolare (INMM)<br />BIO GENETIX srl Unipersonale<br />Facultad<br />Medicina UCV<br />Byo Research Srl<br />Instituto de Medicina Tropical, Sección de Immunología<br />Universidad<br />Central de Venezuela<br />Spin-off<br />Laura Cerni PhD - ByoResearch srl – Area Science Park – Trieste - Italy<br />Caracas, 12 giugno 2010<br />
  5. 5. … LA HISTORIA CONTINUA <br />Byo Research Srl<br />Instituto de Medicina Tropical <br />Sección de Immunología<br />Mal de Chagas<br />Desarrollo y validacion <br />de un <br />test serologico<br />para el <br />Mal de Chagas<br />Laura Cerni PhD - ByoResearch srl – Area Science Park – Trieste - Italy<br />Caracas, 12 giugno 2010<br />
  6. 6. Mal de Chagas<br />Por Què Juntos?<br />Instituto de Medicina Tropical <br />Sección de Immunología<br />Know-how venezolano<br />Byo Research Srl<br />Diagnòstico de Chagas confiable<br />aplicado a una tecnologìa automatizada multiparamètrica ycuantitativa<br />Laura Cerni PhD - ByoResearch srl – Area Science Park – Trieste - Italy<br />Caracas, 12 giugno 2010<br />
  7. 7. Mal de Chagas<br />METODOS DIAGNOSTICOS<br />Analisis directo – Bùsquedadel Trypanosoma cruzi <br />FASE AGUDA<br />1. Anàlisis al microscopio òptico<br />4. Xenodiagnòstico<br />2. QBC (Quantitative Buffy Coat)<br />5. PCR (PolymeraseChainReaction)<br />3. Hemocultivo<br />ALTA ESPECIFICIDAD<br />BAJA SENSIBILIDAD <br />LARGA<br />COMPLEJA<br />COSTOSA<br />Laura Cerni PhD - ByoResearch srl – Area Science Park – Trieste - Italy<br />Caracas, 12 giugno 2010<br />
  8. 8. Diagnosi del Mal de Chagas<br />Anàlisis serologico – Bùsqueda de Ac anti-T. cruzi<br />FASE CRONICA<br />TEST CONVENCIONALES<br />TEST NO CONVENCIONALES<br />Ag: Recombinante o pèptidos sinteticos<br />Ag: paràsito completo – extractos solubles o purificados - epimastigote<br />Test immunològicos<br />OTROSTEST<br />1. IHA(IndirectHaemagglutinationAssay)<br />1. RapidImmunochromatographicAssay<br />2. IFA(ImmunoFluorescenceAssay) <br />2. RIPA (Radio ImmunoPrecipitationAssay)<br />3. ELISA(EnzymeLinkedImmunoSorbentAssay)<br />3. Immunoblot<br />4. Reacciòn de fijaciòn del complemento <br />ALTA SENSIBILIDAD<br />Y ESPECIFICIDAD <br />RAPIDA<br />FACIL<br />ECONOMICA<br />Laura Cerni PhD - ByoResearch srl – Area Science Park – Trieste - Italy<br />Caracas, 12 giugno 2010<br />
  9. 9. Mal de Chagas<br />Exigencias en el diagnòstico de Chagas<br />Epidemiafase aguda<br />Tratamiento clìnico/farmacològico correcto ytempestivo <br />Screening en poblaciòn asintomàtica (endèmica)fase crònica para un tratamiento clìnico/farmacològico antes de la apariciòn de la sintomatologìa cardìaca e intestinal<br />Screening en donantesfase crònicapara evitar una difusiòn de la enfermedad en poblacion no endèmica<br />Screening en mujeres endèmicas embarazadasfase crònica para evitar el contagio del feto con consecuente muerte intrauterina, parto prematuro o lesiones orgànicas al feto<br />Follow-up tratamiento farmacològico<br />Laura Cerni PhD - ByoResearch srl – Area Science Park – Trieste - Italy<br />Caracas, 12 giugno 2010<br />
  10. 10. Mal de Chagas<br />Puntos Crìticos en el diagnòstico de Chagas<br />Ausencia de un test de referencia internacional<br />(Gold Standard)<br />Existencia de diferentes cepas de Trypanosoma cruzi <br />(alta diversidad genètica)<br />T. cruzi I – regiones al norte de la Amazonia<br />(ciclo selvàtico – menos resistentes a fàrmacos)<br />T. cruzi II - regiones al sur de la Amazonia<br />(ciclo domèstico – màs resistentes a fàrmacos)<br />IIa – IIb – IIc – IId<br />T. cruziIII (de Freitaset al.,2006) <br />Reacciòn Cruzadacon otras enfermedades infecciosas: Leishmaniasis, Malaria, Lepra, EBV y enfermedades autoinmunes (i.e. LES) <br />Laura Cerni PhD - ByoResearch srl – Area Science Park – Trieste - Italy<br />Caracas, 12 giugno 2010<br />
  11. 11. Mal de Chagas<br />Còmo diagnosticar Mal de Chagas (OPS – OMS)<br />Laura Cerni PhD - ByoResearch srl – Area Science Park – Trieste - Italy<br />Caracas, 12 giugno 2010<br />
  12. 12. E<br />E<br />E<br />E<br />E<br />E<br />Test ELISA<br />Ricerca Ab<br />anti-Trypanosoma cruzi<br />Byo Research Srl<br />Instituto de Medicina Tropical <br />Sección de Immunología<br />Ac IgG<br />Anti-T. cruzi<br />Ag<br />Mal de Chagas<br />Ag Purificado<br />o<br />Ag Recombinante<br />o <br />Ambos? <br />Fase solida<br />Laura Cerni PhD - ByoResearch srl – Area Science Park – Trieste - Italy<br />Caracas, 12 giugno 2010<br />
  13. 13. ENEASYSTEMIII – BIO GENETIX srl unipersonale<br />EfficientNewEnzymaticAntigenSYSTEM<br />Mal de Chagas<br />Multiparàmetrico <br />(Chagas, Dengue, Malaria etc.)<br />Cuantitativo<br />Automatizado<br />Laura Cerni PhD - ByoResearch srl – Area Science Park – Trieste - Italy<br />Caracas, 12 giugno 2010<br />
  14. 14. Mal de Chagas<br />ENEASYSTEMIII – BIO GENETIX srl unipersonale<br />Multiparàmetrico<br />Anàlisis de varios paràmetros simultàneamente<br /><ul><li>Test Chagas conAg Recombinante (TcF)
  15. 15. Test Chagas conAg Puro Entero (IMT)</li></ul>Cuantitativo(U/ml)<br />Test Automatizado– 150 anàlisis 90 min<br />Laura Cerni PhD - ByoResearch srl – Area Science Park – Trieste - Italy<br />Caracas, 12 giugno 2010<br />
  16. 16. Antìgenos:<br />Mal de Chagas<br />Antìgeno purificado entero - IMT<br />Extracto total del epimastigote<br />Antìgeno recombinante-TcF<br />polipèptido de fusiòn producido con E. coli formado por 4 pèptidos inmunoreactivos identificados mediante libreria de cDNA del Trypanosoma cruzi<br />Laura Cerni PhD - ByoResearch srl – Area Science Park – Trieste - Italy<br />Caracas, 12 giugno 2010<br />
  17. 17. A.C.E. – Allergen/AntigenChamberEnzymatic<br />mm<br />2<br />15 <br />25<br />Mal de Chagas<br />FASE SOLIDA<br />5 micropozos ACE (55 ul) al que se le adhiere el antìgeno especìfico<br />Ag Recombinante - TcF<br />Ag Puro Entero - IMT<br />Caracas, 12 giugno 2010<br />Laura Cerni PhD - ByoResearch srl – Area Science Park – Trieste - Italy<br />
  18. 18. Mal de Chagas<br />PANEL MUESTRAS<br /><ul><li>Caracterizaciòn clìnica
  19. 19. Caracterizaciòn serològica con una metòdica de referencia</li></ul>Positivos– en lo posible Fase Aguda/Crònica<br />Sensibilidad clìnica/relativa<br />Negativos– zonas endèmicas y no-endèmicas<br />Especificidad clinica/relativa<br />Positivos a otras enfermedadesdiferentes al Chagas que podrìa cross-reaccionar: Leishmaniasis, Trypanosoma rangeli, otras enfermedades infecciosas (i.e. EBV, Malaria) enfermedades autoinmunes (i.e. LES) <br />Especificidad analìtica – cross reacciòn<br />Laura Cerni PhD - ByoResearch srl – Area Science Park – Trieste - Italy<br />Caracas, 12 giugno 2010<br />
  20. 20. RESULTADOS PRELIMINARES Antigeno TcF<br />PANEL SUEROS<br /><ul><li>Sueros positivosChagas IgG </li></ul>n=13 Poblaciòn endèmica venezolana<br />Sueros caracterizados serològicamente mediante test ELISA IMT e HIA IMT en el IDI-UCV Caracas - Venezuela<br /><ul><li>Sueros negativosChagas IgG</li></ul>n=25 Poblaciòn no-endèmica italiana<br />Sueros provenientes de la seroteca BYO GENETIX srl – Trieste – Italia <br />Laura Cerni PhD - ByoResearch srl – Area Science Park – Trieste - Italy<br />Caracas, 12 giugno 2010<br />
  21. 21. VALIDACION EXTERNA <br />antigeno TcF<br />Realizada enel Laboratorio del IDI-UCV <br />Caracas - Venezuela <br />PANEL DE SUEROS<br /><ul><li>Sueros positivosChagas IgG - n = 100</li></ul>Caracterizados serològicamente mediante test ELISA IMT y HIA IMT <br /><ul><li>Sueros negativosChagas IgG – Poblacion endèmica - n = 99</li></ul>Caracterizados serològicamentemediante test ELISA IMT <br /><ul><li>Sueros negativos Chagas ypositivospara otras enfermedades:</li></ul>- Mononucleosisn=5<br />- Leishmaniasisn=21<br />- Sifilisn=19<br />- Malarian=5<br />- Tiroiditis Autoinmune n=5<br />ByoResearch srl – Area Science Park – Trieste - Italy<br />Caracas, 12 giugno 2010<br />
  22. 22. RESULTADOS PRELIMINARES <br />Antigeno TcF<br />Cut off 150<br />Sensibilidad 92.3% - Especificidad 100%<br />Cut off 250<br />Sensibilidad 92.3% - Especificidad 100%<br />ByoResearch srl – Area Science Park – Trieste - Italy<br />
  23. 23. VALIDACION EXTERNA <br />antìgeno TcF<br />Cut-off270<br />sensibilidad 99% - specificidad 97%<br />Cut-off150 <br />sensibilità 99% - specificità 70%<br />Cut-off250 <br />sensibilità 99% - specificità 96%<br />Cut-off410<br />Sensibilidad 98% - Especificidad 99%<br />
  24. 24. VALIDACION EXTERNA <br />antigeno TcF<br />Cut-off150 <br />sensibilità 99% - specificità 69%<br />Cut-off270<br />sensibilidad 99% - especificidad 98%<br />Cut-off250 <br />sensibilità 99% - specificità 96%<br />Cut-off410<br />sensibilidad 99% - especificidad 100%<br />
  25. 25. VALIDACION EXTERNA<br />Antìgeno TcF<br />CROSS-REACTIVIDAD<br />0.0%<br />0.0%<br />20.0%<br />0.0%<br />5.2%<br />4.3%<br />0.0%<br />20.0%<br />0.0%<br />5.2%<br />410<br />250<br />
  26. 26. VALIDACION INTERNA<br />Ag recombinante TcF <br />Ag purificado entero IMT<br />Realizada en Byo Research srl<br />PANEL DE SUEROS<br /><ul><li>Sueros positivosChagas IgG:</li></ul>n = 30 Poblacion endèmica residente en Venezuela<br />Suero caracterizado mediante test ELISA IMT y HIA IMT en el IDI – Caracas <br />n = 20 Poblacion endèmica residente in Italia <br />Sueros caracterizados mediante test ELISA conAg recombinantes y Rapid Test Inmunocromatogràfico en el CMT – Negrar – Verona – Italia <br /><ul><li>Sueros negativosChagas IgG: </li></ul>n = 10Poblaciòn endèmica residente en Venezuela<br />Caracterizados serologicamentemediante test ELISA IMT en el IDI- Caracas<br />n = 64 Poblaciòn no endèmica residente en Italia<br />Donantes de sangre<br />Laura Cerni PhD - ByoResearch srl – Area Science Park – Trieste - Italy<br />Caracas, 12 giugno 2010<br />
  27. 27. VALIDACION INTERNA <br />antìgeno TcF<br />Cut-off200<br />Sensibilidad 98% - Especificidad 100%<br />Cut-off300<br />Sensibilidad 98% - Especificidad 100%<br />
  28. 28. VALIDACION INTERNA <br />antìgeno IMT<br />Cut-off200<br />sensibilidad 100% - especificidad 96%<br />Cut-off300<br />sensibilidad 96% - especificidad 99%<br />
  29. 29. Discusion de los resultados<br />Luego optimizaciòn de la fase sòlida <br />Y del tampone di dilucion sueros<br />Validacion Interna<br />Antigene TCF (Validazione esterna)<br />Antigene IMT<br />Antigene TCF<br />410<br />N° 148<br />Donatore<br />N° 101<br />Negrar<br />270<br />N° 60<br />Venezuela<br /> N° 17 Venezuela<br />N° 53<br />Venezuela<br />N° 115<br />Donatore<br />N° 101<br />Negrar<br />N° 53<br />Venezuela<br />N° 148<br />Donatore<br />N°60-115<br />Venezuela<br /> N° 17 Venezuela<br />Cut-off410<br />sensibilità 98%<br />specificità 99%<br />Cut-off270<br />sensibilità 99%<br />specificità 97%<br />sensibilità 100% <br />specificità 96%<br />sensibilità 98%<br />specificità 100%<br />VPP 94%<br />VPN 100%<br />VPP 100%<br />VPN 99%<br />
  30. 30. Analisis Cuantitativo <br />Mal de Chagas<br />Cut-offTcF<br />200 – 300 ABS<br />0.08 – 0.11 U/ml<br />Cut-off IMT <br />200 – 300 ABS<br />0.11 – 0.15 U/ml<br />Reproducibilidad del test<br />CV% < 20% en sueros bajos positivos<br />Laura Cerni PhD - ByoResearch srl – Area Science Park – Trieste - Italy<br />Caracas, 12 giugno 2010<br />
  31. 31. Diagnostico Mal de Chagas<br />Correlacion test ENEASYSTEM III y Microplaca (96 pozos)<br />n = 30 sueros positivos<br />n = 10 sueros negativos <br />Laura Cerni PhD - ByoResearch srl – Area Science Park – Trieste - Italy<br />Caracas, 12 giugno 2010<br />
  32. 32. Diagnòstico Mal de Chagas<br />CONCLUSION<br />50 sueros positivos 30 venezolanos y 20 de poblaciòn endèmica residente en Italia:<br />Antìgeno Recombinante<br />1 suero falso negativo – venezolano <br />sensibilidad 98%<br />0 sueros falsos negativos<br />Antìgeno Entero Puro <br />sensibilidad 100%<br />75 sueros negativos10 venezolanos y65 donantes Italianos:<br />0 sieri falsi positivi<br />Antìgeno Recombinante<br />Especificidad 100%<br />3 sueros falsos positivos – 2 donantes italianos y1 venezolano<br />Antìgeno Entero Puro <br />Especificidad 96%<br />Positivos<br />Antìgeno Entero Purificado <br />Negativos <br />Antìgeno Recombinante<br />Laura Cerni PhD - ByoResearch srl – Area Science Park – Trieste - Italy<br />Caracas, 12 giugno 2010<br />
  33. 33. Instituto de Medicina TropicalSección de Immunología Caracas - Venezuela<br />Byo Research Srl<br />Diagnòstico Mal de Chagas<br />…LA HISTORIA CONTINUA …<br />Aumentando el panel de sueros <br />Positivos, Negativos y Cross-Reactivos;<br />2. Desarrollando el test para las IgM (fase aguda) <br />Centro Malattie Tropicali<br />Ospedale Sacro Cuore Don Calabria<br />Negrar – Verona - Italia<br />Laura Cerni PhD - ByoResearch srl – Area Science Park – Trieste - Italy<br />Caracas, 12 giugno 2010<br />

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