Budapest Science Meetup: 2013. május

1. Az egerek és az érelmeszesedés: az ABCC6
transzporter szerepe
Pomozi Viola
MTA TTK Enzimológiai Intézet
2013.05.09.

2. Az ABC transzporterek
Emberben 7 alcsalád, 48 fehérje
Minden élőlényben megtalálhatóak!
ABCB
alcsalád
ABCC
alcsalád
ABCG
alcsalád

3. ABC transzporterek és betegségek
ABCA1ABCA1 Tangier diseaseTangier disease
ABCA4 (ABCR)ABCA4 (ABCR) Stargardt syndromeStargardt syndrome andand Age rel. macular dystrophyAge rel. macular dystrophy
ABCA3ABCA3 Fatal surfactant deficiencyFatal surfactant deficiency
ABCA12ABCA12 Lamellar ichthyosis type 2Lamellar ichthyosis type 2 andand Harlequin ichthyosisHarlequin ichthyosis
ABCB1(MDR1,Pgp)ABCB1(MDR1,Pgp) Multidrug resistance in cancerMultidrug resistance in cancer
ABCB3 (TAP2)ABCB3 (TAP2) HLA class I deficiencyHLA class I deficiency
ABCB4 (MDR3)ABCB4 (MDR3) Progressive intrahepatic cholestasis type 3Progressive intrahepatic cholestasis type 3
ABCB7ABCB7 X-linked sideroblastic anemia and ataxiaX-linked sideroblastic anemia and ataxia
ABCB11 (sPgP)ABCB11 (sPgP) Progressive intrahepatic cholestasis type 2Progressive intrahepatic cholestasis type 2
ABCC1 (MRP1)ABCC1 (MRP1) Multidrug resistance in cancerMultidrug resistance in cancer
ABCC2 (MRP2)ABCC2 (MRP2) Dubin-Johnson syndromeDubin-Johnson syndrome
ABCC6 (MRP6)ABCC6 (MRP6) Pseudoxanthoma elasticumPseudoxanthoma elasticum
ABCC7 (CFTR)ABCC7 (CFTR) Cystic fibrosisCystic fibrosis
ABCC8 (SUR1)ABCC8 (SUR1) Persistent hyperinsulinemic hypoglycemiaPersistent hyperinsulinemic hypoglycemia
ABCC9 (SUR2)ABCC9 (SUR2) Idiopathic dilated cardiomyopathyIdiopathic dilated cardiomyopathy
ABCC11 (MRP8)ABCC11 (MRP8) Earwax typeEarwax type
ABCD1 (ALD)ABCD1 (ALD) AdrenoleukodystrophyAdrenoleukodystrophy
ABCG2 (MXR/BCRP)ABCG2 (MXR/BCRP) Multidrug resistance in cancerMultidrug resistance in cancer
ABCG5 and G8ABCG5 and G8 SitosterolemiaSitosterolemia andand Mediterranean stomatocytosis/
macrothrombocytopenia

4. ABCC6
Organikus anion transzporter
Plazmamembránban helyezkedik el
Májban, vesében expresszálódik
Plazmamembrán

5. Organikus anion transzporter
Plazmamembránban helyezkedik el
Májban, vesében expresszálódik
Mutációk → PXE (Pseudoxanthoma elasticum)
→ GACI (Generalized Arterial Calcification of Infancy)
→ Rizikófaktor szívkoszorúér megbetegedésben
ABCC6
Plazmamembrán

6. Organikus anion transzporter
Plazmamembránban helyezkedik el
Májban, vesében expresszálódik
Mutációk → PXE – közepesen súlyos
→ GACI – nagyon súlyos / halálos
ABCC6
PXE GACI
(Abcc6-/-
mice: Gorgel et al 2005;
Klement et al, 2005)
Rutsch F et al. Circ Cardiovasc Genet 2008;1:133-140

7. Metabolikus betegség
ABCC6
PXE és GACI

8. • Megérteni, hogyan vezet egy adott mutáció a betegség kialakulásához
Célkitűzések
Plazmamembrán
• Olyan betegséget okozó misszensz mutánsok azonosítása, amelyek
megőrizték transzport aktivitásukat, de hibás sejten belüli lokalizációt
mutatnak
• Ezen mutánsok hibás lokalizációjának farmakológiai korrekciója
• “Meggyógyított” mutánsok tesztelése in vivo rendszerben (egér)

9. ABCC6 mutációk
(betegek)
Transzport
funkció mérése
inaktív
aktív
Sejten belüli lokalizáció
vizsgálata
Sejtmembrán (✔)
Sejten belül (✖)
“gyógyszeres”
kezelés
Sejtmembránba jut
(“megjavul”)
Nincs hatás
In vivo
funkcionális
ellenőrzés
Ideális jelölt gyógyszeres
kezelésre
Munkaterv

10. ABCC6 mutációk
(betegek)
Transzport
funkció mérése
inaktív
aktív
Sejten belüli lokalizáció
vizsgálata
Sejtmembrán (✔)
Sejten belül (✖)
“gyógyszeres”
kezelés
Sejtmembránba jut
(“megjavul”)
Nincs hatás
In vivo
funkcionális
ellenőrzés
Ideális jelölt gyógyszeres
kezelésre
ABCC6 transzport aktivitás

11. ABCC6 mutációk
(betegek)
Transzport
funkció mérése
inaktív
aktív
Sejten belüli
lokalizáció vizsgálata
Sejtmembrán (✔)
Sejten belül (✖)
“gyógyszeres”
kezelés
Sejtmembránba jut
(“megjavul”)
Nincs
hatás
In vivo
funkcionális
ellenőrzés
Ideális jelölt gyógyszeres
kezelésre
ABCC6 lokalizáció
Sejten belüli lokalizáció
Piros:
Sejtmembrán
(NaK-ATPase)
Zöld:
ABCC6
Sejtvonal + humán fehérje

12. ABCC6 mutációk
(betegek)
Transzport
funkció mérése
inaktív
aktív
Sejten belüli
lokalizáció vizsgálata
Sejtmembrán (✔)
Sejten belül (✖)
“gyógyszeres”
kezelés
Sejtmembránba jut
(“megjavul”)
Nincs
hatás
In vivo
funkcionális
ellenőrzés
Ideális jelölt gyógyszeres
kezelésre
ABCC6 hibás lokalizáció kijavíása
Gyógyszeres kezelés
4-phenylbutyrate (4-PBA)
• FDA által jóváhagyott, az urea-ciklus megbetegedéseiben
rutinszerűen használt gyógyszer
• CFTR (ABCC7)  cisztikus fibrózis
∆F508 mutáns érésének segítése sejvonalakon + klinikai kipróbálás

13. A 4PBA kezelés hatása
ABCC6 wt
- 4PBA + 4PBA
ABCC6
R1314W
Piros:
Sejtmembrán
(NaK-ATPase)
Zöld:
ABCC6

14. A 4PBA kezelés hatása
ABCC6 wt
- 4PBA + 4PBA
ABCC6
R1314W
Piros:
Sejtmembrán
(NaK-ATPase)
Zöld:
ABCC6

15. A 4PBA kezelés hatása
R1114P
Q1347H
Piros:
Sejtmembrán
(NaK-ATPase)
Zöld:
ABCC6
- 4PBA + 4PBA
T1301I

16. In vitro
Sejtvonal
In vivo
Egér máj
+ 4PBA
Eredmények ellenőrzése egérben
- 4PBA

17. ABCC6 mutációk
(betegek)
Transzport
funkció mérése
inaktív
aktív
Sejten belüli lokalizáció
vizsgálata
Sejtmembrán (✔)
Sejten belül (✖)
“gyógyszeres”
kezelés
Sejtmembránba jut
(“megjavul”)
Nincs hatás
In vivo
funkcionális
ellenőrzés
Ideális jelölt gyógyszeres
kezelésre
In vivo funkcionális teszt kidolgozása
ABCC6 működésével összefüggő biomarker
Kálcium lerakódás a lágy szövetekben
(valami gyorsabb kéne…)

18. Kalcifikáció kiváltása Abcc6-hiányos egerekben
C3H/He, Abcc6 KO
Szívizom kis területének fagyasztása
4 nap múlva a a szív kivétele,
Lerakódott kálcium meghatározása

19. C3H/He, Abcc6 KO
Szívizom kis területének fagyasztása
4 nap múlva a a szív kivétele,
Lerakódott kálcium meghatározása
Kalcifikáció kiváltása Abcc6-hiányos egerekben

20. Kalcifikálódott terület lemetszése
Kálcium lerakódás kvantitatív meghatározása
Kalcifikáció kiváltása Abcc6-hiányos egerekben

21. Hogyan használható ez a modell az ABCC6 működés tesztelésére?
“Normál” egér nincs kalcifikáció
KO egér  kalcifikáció
KO egér + ABCC6 (farokvénán keresztül)  csökkenti a kalcifikációt??
1. lépés: wt ABCC6 expressziója KO egérben
szív fagyasztása
kálcium lerakódás megmérése
Az ABCC6 képes
csökkenteni a kálcium
lerakódást!!!
(77%!)
n=4 n=4 n=7

22. 2. lépés: mutáns ABCC6 expressziója KO egérben
(Nem számítunk a kalcifikáció csökkenésére)
3. lépés: mutáns ABCC6 expressziója KO egérben + 4PBA kezelés
Csökkent kalcifikáció ?
További tervek

23. Összefoglalás
• ABCC6 fehérje (wt és mutánsok) expressziója sejtvonalakban
• ABCC6 fehérje (wt és mutánsok) expressziója egér májban in vivo
 A módszer alkalmaslkalmas más máj-fehérjék vizsgálatára is
• Kalcifikációs in vivo modell kidolgozása
 Betegséget okozó mutációk funkcionális vizsgálata
 Potenciális gyógyszerek tesztelése

24. Köszönetnyílvánítás
Váradi András
Fülöp Kriszti
Iliás Attila
Szabó Zalán
Demeter Györgyi
Gyergyák Hella
Tőkési Natália
Szakács Gergely
Sarkadi Balázs
Homolya László
Olivier Le Saux
Yukiko Yamaguichi
Christopher N. Brampton
Paku Sándor
Köszönöm a figyelmet!
MTA TTK Enzimológiai Intézet
University of Hawaii
NIH R01AR055225 USA, PXE International USA, OTKA CK 80135, OTKA NK 81204
SE I. Sz. Patológiai Intézet
Korányi Intézet, Tumorbiológiai Osztály
Tóvári József
Döme Balázs
Cserepes Mihály