molekularna10-13.pptx

molekularna10-13.pptx
Molekularna Biologija LANČANA REAKCIJA POLIMERAZE (engl. Polymerase Chain Reaction) - PCR -
Metoda PCR (Polymerase Chain Reaction) • Otkriće 1983.- Kary Mullis i saradnici, 1993. godine Nobelova nagrada za hemiju • Polymerase Chain Reaction (PCR) iliti lančana reakcija polimeraze predstavlja izmjenjenu reakciju replikacije DNK u in vitro (vještačkim) uslovima.
Kao i za svaku replikaciju neophodno je prisustvo: 1. DNK matrice, 2. jednolančanih početnica (engl. primer ~ začetnica) tj. DNK sekvenci koje su komplementarne krajevima onog regiona DNK matrice koji se želi umnožiti. Početnice su DNK oligonukleotidi dužine 20-30 nukleotida. 3. smjese slobodnih nukleotida (dNTP=dATP+dCTP+dGTP+dTTP), 4. enzima DNK polimeraze, 5. Mg2+ jona koji se dodaju u obliku soli MgCl2, 6. pufer određene pH vrijednosti.
Taq – polimeraza • Bakterija Thermus aquaticus živi u termalnim izvorima na oko 50-80 oC • otkriće nove vrste polimeraze koja posjeduje aktivnost na visokim temperaturama • nazvana je Taq polimeraza
Taq polymerase
Koraci u PCR metodi 1. DENATURACIJA – engl. denaturation 2. VEZIVANJE POČETNICA – engl. annealing 3. SINTEZA DNK (polimerizacija) – engl. elongation
KORAK 1: DENATURACIJA DNK Zagrijavanje reakcione smjese na 94-96 oC • Obično traje 15-60 sec. • Prvi ciklus na ovoj temperaturi se održava nešto duže (5min) da bi se postigla što bolja denaturacija.
KORAK 2: VEZIVANJE POČETNICA Hlađenje reakcione smjese na 40-60 oC • obično traje oko 30s • dužina početnica i temperatura su važni faktori • duža početnica - više vremena treba da se veže • viša temperatura – specifičnije vezivanje
Denaturacija i hlađenje
KORAK 3: Polimerizacija • Zagrijavanjem cjelokupne smeše na 72 OC (opt. temp) • Polimerizacija - Taq polimeraza dodaje nukleotide u 5’-3’ pravcu • Trajanje koraka je varijabilno, u zavisnosti od dužine pretpostavljenog fragmenta
I sva tri koraka se ponavljaju 20- 30 (40) puta – čime se postiže umnožavanje datog fragmenta DNK
Nekad bilo pa se pripovjeda.. . 55oC Hlađenje 95oC Denaturacija 72oC Polimerizacija
A danas je automatizovano uz pomoć - Termocycler
Programiranje ciklusa • Step 1: 95oC, 5 min • Step 2: 95oC, 30sec • Step 3: 55oC, 30sec • Step 4: 72oC, 1 min • Step 5: go to Step 2 for 30 times UOČITI: Jedan Cijeli ciklus ukupno traje 2 min ! • Step 6: 72oC, 10 min Trajanje PCR reakcije od npr. 30 ciklusa bilo bi: 2 min x 30 + 15 min = ~75-80min (~1 ¼ h)
Umnožavanje produkta je eksponencijalno...
TEORETSKI: N=2n N-broj kopija n – broj ciklusa Zašto ?
Ograničavajući faktori PCR-a • dužina fragmenta DNK (polimeraza spadne poslije određenog vremena) • ograničena količina Taq polimeraze i pad njene aktivnosti i tačnosti nakon određenog broja ciklusa • ograničena količina Mg2+ • ograničena količina dNTP i početnica i njihovo trošenje tokom svakog ciklusa PCR-a • zagađenja uzorka (hloroform, fenol, EtOH itd.) koja djeluju inhibitorno na DNK polimerazu
Provjera uspješnosti PCR-a • Elektroforezom na gelu od agaroze M – markeri (engl. ladder), smeša različitih polinukleotida poznate veličine (bp) Proizvod reakcije je veličine oko 350 bp
Početnice (prajmeri) • Prema konvenciji sve nukleotidne sekvence se uvek pišu sa desna na lijevo u 5’–3’ pravcu! >gi|340745325:5001-110244 Homo sapiens actinin, alpha 1 (ACTN1) TCTGCCCCTTCCCCCCGCCCCCGCCCGCCTCGGCTCCCGCAGCGCTAGTGTGTCCGCCTAGTTCAGTGTG CGTGGAGATTAGGTCCAAGCGCCCGCCCAGAGGCAGGCAGTCCGCGAGCCCAGCCGCCGCTGTCGCCGCC AGTAGCAGCCTTCGCCAGCAGCGCCGCGGCGGAACCGGGCGCAGGGGAGCGAGCCCGGCCCCGCCAGCCC AGCCCAGCCCAGCCCTACTCCCTCCCCACGCCAGGGCAGCAGCCGTTGCTCAGAGAGAAGGTGGAGGAAG AAATCCAGACCCTAGCACGCGCGCACCATCATGGACCATTATGATTCTCAGCAAACCAACGATTACATGC AGCCAGAAGAGGACTGGGACCGGGACCTGCTCCTGGACCCGGCCTGGGAGAAGCAGCAGAGAAAGGTTAG
Početnice (prajmeri) >gi|340745325:5001-110244 Homo sapiens actin, alpha 1 (ACTN1) TCTGCCCCTTCCCCCCGCCCCCGCCCGCCTCGGCTCCCGCAGCGCTAGTGTGTCCGCCTAGTTCAGTGTG CGTGGAGATTAGGTCCAAGCGCCCGCCCAGAGGCAGGCAGTCCGCGAGCCCAGCCGCCGCTGTCGCCGCC AGTAGCAGCCTTCGCCAGCAGCGCCGCGGCGGAACCGGGCGCAGGGGAGCGAGCCCGGCCCCGCCAGCCC AGCCCAGCCCAGCCCTACTCCCTCCCCACGCCAGGGCAGCAGCCGTTGCTCAGAGAGAAGGTGGAGGAAG AAATCCAGACCCTAGCACGCGCGCACCATCATGGACCATTATGATTCTCAGCAAACCAACGATTACATGC AGCCAGAAGAGGACTGGGACCGGGACCTGCTCCTGGACCCGGCCTGGGAGAAGCAGCAGAGAAAGGTTAG Lijevi prajmer: PREPISATI SEKVENCU GORNJEG LANCA GGA GAT TAG GTC CAA GCG CC (5’–3’) Desni prajmer: PRVO PREPIŠEMO KOMPLEMENTARNI LANAC CAT CAT GGA CCA TTA TGA TTC TCA G (5’- 3’) GTA GTA CCT GGT AAT ACT AAG AGT C (3’- 5’) POTOM SE PREPIŠE SEKVENCA KOMPLEMENTARNOG LANCA SA DESNA NA LIJEVO KAKO BI BILA U 5’-3’ PRAVCU: C TGA GAA TCA TAA TGG TCC ATG ATG (5’- 3’) donji lanac
Izmjenjene PCR metode: • AFLP PCR • Allele-Specific PCR • Alu PCR • Assembly PCR • Assymetric PCR • Colony PCR • Helicase Dependent Amplification HDA • Hot Start PCR • Inverse PCR • In Situ PCR • ISSR PCR • Late-PCR • Long PCR • Nested PCR • RT-PCR or Reverse Transcriptase PCR • Real Time PCR • RT-PCR • Single Cell PCR
Molekularna Biologija Elektroforeza nukleinskih kiselina na agaroznom gelu
Odvajanje nukleinskih kiselina - CF u gradijentu 2 • poliakrilamid sintetički gelovi, agaroza-akrilamid • korelacija sa sedimentacijskim koeficijentom • otkriće RE + radioaktivno označavanje nukleinskih kiselina • cjevasti gel format  preteča kapilarne elektroforeze • etidijum bromid (EtBr) • horizontalni pločasti gelovi agaroze (McDonell i sar. ) Analitička i preparativna primjena • koristi se i u novim tehnologijama: • uređivanja genoma • sekvenciranje nove generacije (NGS) 1960ih 1971 1972 1977 1967 Kratak istorijat DNK elektroforeze ALTERNATIVA  elektroforeza: • pokretljivost DNK u jonskim rastvorima u električnom polju • gel matrica, vertikalni pločasti gelovi • agar (prirodni ugljeni hidrat) • agaroza (komponenta agara) postepeno zamjenjuje agar
Razlika pokretljivosti molekula zavisi direktno od: veličine, oblika i naelektrisanja Preuzeto sa: https://www.thermofisher.com 2
• migracija DNK u slobodnom rastvoruje nezavisna je od Molekulske mase • mehanizam razdvajanja u gelu – dva glavna modela: Ogstonov model • široko prihvaćen  prosijavanje molekula manjih od pora matriksa • kratke, kružne, zapetljane molekule DNK Reptacijski model (model zmije/gusjenice) • kada su molekule znatno veće od pora prema: Butler JM. Forensic DNA Typing. 2nd Ed, Elsevier Academic Press (2005) pore kratka DNA Ogstonov model gela duga DNA Reptacijski model 2
Udaljenost migracije korelira s veličinom molekula • moguće izračunati veličinu DNK nepoznatog uzorka • samo za linearne dsDNA molekule: mobilnost 2 log (veličina) 1000bp 100bp 10bp 1 udaljenost migracije ~ log(𝑀𝑟)
Dvije izvedbe: 1. horizontalna (tzv. submarine elektroforeza) 2. vertikalna Različite veličine, zavisi od broja uzoraka i Mr DNA • šira kadica  više uzoraka • duža kadica  više redaka / duža migracija u gelu Veći formati za: • polimorfizam dužine fragmenta (RFLP) • Southern blot Mini formati za: • brzo razdvajanje i manji broj uzoraka 2
Preuzeto sa: https://www.btlabsystems.com Preuzeto sa: http://www.bio-rad.com Preuzeto sa: https://www.agilent.com SISTEMI ZA ELEKTROFOREZU
Sastav ili gradijent pufera • nativna EF • alkalno denaturirajuća EF • gradijentna EF Električno polje • elektroforeza pulsnog polja, PFGE Matriksi • agaroza • poliakrilamid/PAGE (denaturirajući ili nativni) • sredstva za denaturaciju (npr. NaOH + urea/formamid) • ssDNA (npr. tehnike SSCP, DGGE, ili DNA footprinting) • za kratke dsDNA • za RNA 20 - 60bp • industrijske varijacije - različiti proizvođači • polimeri u uskim silikatnim kapilarama
U obliku: • tanke "ploče" pravougaonog oblika (horiz./vert. EF) • kapilarna elektroforeza, mikrouzorak – danas • komercijalni sistem s gotovim gelom ispunjenim kapilarama • brzo, osjetljivo i standardizovano izvođenje elektroforeze Agarozni gelovi: • Ugljeni hidrat iz algi • velike pore (~200nm), brža migracija Akrilamidni gelovi: • polimer akrilamidnih grupa •male pore (~20nm), spora migracija/bolja rezolucija Komercijalne izvedenice agaroze i PAG • Clearose®, Spreadex®, TruPAGE™, Novex®…
• Gustina gela • Veličina i linearnost DNA • Konformacija DNA • Priprema uzorka • Napon i vrijeme • Pufer (Tris/acetat/EDTA – TAE, Tris/borat/EDTA - TBE) • Koncentracija boje pri bojenju gela (npr. EtBr) Faktori koji utiču na Elektroforezu
Aem 605 nm Aabs210/285nm (UV) Preuzeto sa: https://www.hoelzel-biotech.com/en/infothek/nucleic-acid-detection/
Etidijum bromid •1950ih (homidium) •>20ng DNA/RNA  20X jačiintenzitet •mutagen •karcinogen GelRed •Biotium •sličan EtBr,osjetljiviji •dsDNA, ssDNA i RNA •nije kancerogen •nije toksičan SYBR Green I •Molecular Probes •karcinogen GelGreen •Biotium •manje toksičan •dsDNA, ssDNA i RNA Amax210/285nm Emax 610nm Amax ~ 280nm Emax ~ 590nm Amax497nm Emax 520nm Amax~500nm Emax ~520nm Ostale cijaninske boje •SYBR Green II (za bojenje ssDNA i RNA) •SYBR Gold (pojačana osjetljivost) •Safe-green (manja toksičnost)
DNA standardi (Molecular Weight Markers) • poređenje dužine fragmenata nepoznatog uzorka • različitih dužina ili ljestvica (ladder) 267bp 234bp 213bp 184bp 124bp MWM 1 2 3 4 5 6
Dijelovi • UV transiluminator (260-300-312nm) • kamera ili scanner • software za očitavanje i analizu • pojedinačno ili kao gel imaging sistem By Bonnvenn - Own work, CC BY-SA 3.0, https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=7861132 http://www.gelanalyzer.com/ Sistemi za vizualizaciju i analizu gelova
Moguće varijacije: • količina i kvalitet uzorka (5 – 8 – 10 – 12uL…) • postavke napona (60 - 80 - 100 - 120 - 150V…) • gustina gela (0,5 - 0,8 - 1,0 - 2,0 - 5,0 - 10 - 16%) • dužina trajanja (15 – 30 – 60 – 120min …) • bojenje i vizualizacija (EtBr – GelRed – SYBR…) Priprema gelova: • zahtjevan postupak: • kuvanje agaroze, izlijevanje gela • priprema i pranje kalupa, polimerizacija akrilamida • problemi sa zaostalim mjehurićima vazduha • nanošenje malih količina uzorka • prelijevanje uzorka iz bunarčića • neurotoksičnost akrilamida, kancerogene boje
• RFLP, kvantifikacija, preparacija, ispitivanje kvaliteta • nije za određivanje SNP • 0,7% (5–10kb) – vrlo krhki gelovi • 2% (0,2–1kb) • 3% za vrlo kratke fragmente • 1% - najčešće • Postupak: 1. Izvagati tačnu količinu agaroznog praha, dodati pufer • npr. 1% agaroza = 1g + 99ml H2O 2. Zagrijati u vodenom kupatilu u mikrotalasnoj/magnetskom grijaču •  bistar rastvor (70°C) 3. Pripremiti kalup  izliti rastvor gela, umetnuti češalj 4. Ohladiti gel, izvaditi češalj 5. Postaviti gel u kadicu 6. Pripremiti uzorke i molekularni standard (marker), 7. Nanositi 5-10uL, pomiješan sa obojenim puferom za nanošenje (npr. BFP+glicerol)
Agaroza (EtBr) PAGE (SYBR Gold) Smile efekt •previsoka T gela •loša homogenost gela Mjehurići vazduha Nehomogen gel •previsoka T,loša homogenost Ispravan gel oštre jasno odijeljene trake
Sekvenciranje Maxam - Gilbert • radioaktivno obilježavanje 5‘ kraja • hemijsko cijepanje • A+G, G, C, C+T Preuzeto sa: http://upload.wikimedia.org/wikipedia/en/6/66/Maxam_gilbert_sequencing.png Preuzeto sa: http://www.generasibiologi.com/2016/03/metode- sekuensing-kimiawi-maxam-gilbert.html 1976
Sekvenciranje Sanger (terminacija lanca) • dideoksi nukleotidi – ddNTP (terminacija) • fluorescentno obilježeni primer • Novi DNA lanac s obilježenim dNTP, ili • Obilježenim ddNTP NN 1980 Preuzeto sa: http://dnamismatch.com/dna-sequencing/methods-in-development/microfluidic-sanger-sequencing/
Molekularna Biologija GENETIČKI KOD
 genetička informacija je sadržana u DNK molekulu u šifrovanom obliku osnovu toga čini triplet nukleotida na DNK molekulu koji se u procesu transkripcije prepisuje po principu komplementarnosti naiRNK  triplet nukleotida na iRNK predstavlja šifru za jednu aminokiselinu i naziva se kodon skup svih kodona i sistem pravila kojima se oni prevode u redoslijed aminokiselina u polipeptidnom lancu čini genetički kod
Genetički kod  ukupno ima 64 kodona stop kodoni: UAA, UAG, UGA  start kodon: AUG (kod prokariota i GUG)
U klasičnoj genetici, stop kodonima su data imena UAG UAA UGA amber ochre opal (ili umber) ćilibar oker opal  Identifikovani su mutanti bakteriofaga T4 koji su imali nonsens mutacije, pa su zbog toga imali oslabljenu infektivnost i mogli su da napadnu samo neke sojeve E.coli  Amber mutacija (UAG) su prve otkrivene a nose ime po Harris Bernstein-u čije prezime na njemačkom znači “amber” (ćilibar)  Zatim su otkrivene ochre i opal mutacije, a imena su data tako da se uklapaju boje
Degenerisanost genetičkog koda jednu aminokiselinu može kodirati više kodona koji se nazivaju sinonimi samo su aminokiseline Met i Trp šifrovane sa po jednim kodonom ukoliko su prva dva nukleotida identična treći nukleotid može biti C ili U i kodon će i dalje kodirati istu aminokiselinu (na isti način A i G vrlo često mogu da se zamjene na trećoj poziciji) degenerisanost genetičkog koda objašnjava postojanje velike varijacije u AT/GC odnosu DNK između različitih organizama bez velikih promjena u proporciji aminokiselina u njihovim proteinima
•transverzija na trećoj poziciji kodona će u oko 50% slučajeva promijeniti aminokiselinu Smatra se da je genetički kod evoluirao na način da minimizira štetne efekte mutacija •mutacija na prvoj poziciji kodona će često dati sličnu aminokiselinu (ili istu) • kodoni koji imaju pirimidin na drugoj poziciji obično kodiraju hidrofobne aminokiseline •kodoni koji imaju purin na drugoj poziciji obično kodiraju polarne aminokiseline • tranzicija (koja predstavlja najčešći tip tačkaste mutacije) na drugoj poziciji kodona će obično dovesti do zamjene jedne aminokiseline drugom (nekad sličnom) • tranzicija na trećoj poziciji kodona će veoma rijetko promijeniti aminokiselinu postoje brojna odsupanja od ovih pravila
Kolebljivo (eng. wobble) sparivanje baza U in vitro sistemu za sintezu proteina pokazano je da sparivanje treće baze kodona i prve baze antikodona često nestastandardno tzv. kolebljivo  Crick 1966. - hipoteza o kolebljivosti interakcije kodon-antikodon: Antiparalelno povezivanje G C A U I U ili C G U A ili G A, U, ili C Baza na 5’ kraju antikodina Baza na 3’ kraju kodona U C C A G G
ako je prva “kolebljiva” baza antikodona: treća baza kodona može biti prva baza antikodona može biti ako je treća “kolebljiva” baza kodona:
 sve tRNK koje prepoznaju jednu istu aminokiselinu su izoakceptorske tRNK i za svaku grupu izoakceptorskih tRNK postoji jedna aminoacil-tRNK sintetaza zbog kolebanja baze na prvoj poziciji antikodona broj tRNK koji je potreban u ćeliji ne mora da odgovara broju kodona  npr. za prepoznavanje Ser kodona (UCU, UCC, UCA, UCG, AGU, AGC) potrebne su najmanje tri različite tRNK minimalan broj tRNK potreban u ćeliji za čitanje genetičkog koda je 31 tRNK, odnosno 32 jer je za inicijaciju translacije neophodna još jedna, specifična tRNK (mnoge ćelije sadrže, međutim, mnogo više od 32 tRNK) jedna aminokiselina može biti kodirana sa više različitih kodona (degenerisanost) jednom kodonu može odgovarati nekoliko različitih tRNK (kolebljivo sparivanje baza) tRNK sa istim antikodonima mogu se vezivati za različite kodone (kolebljivo sparivanje baza)  biološki smisao ovakve fleksibilnosti je zaštita od mutacija
Kako je dešifrovan genetički kod? Put od RNK do proteina Kako je utvrđeno da tri nukleotida predstavljaju šifru za jednu aminokiselinu? Kako je utvrđen odgovarajući kodon za svaku aminokiselinu?
pošto postoji 20 aminokiselina i 4 baze bilo je jasno da grupa od nekoliko nukleotida predstavlja šifru za jednu aminokiselinu dva nukleotida bi specificirala samo 16 aminokiselina (premalo), dok tri nukleotida bi mogla da kodiraju 64 aminokiseline (previše) postavilo se i pitanje kolinearnosti nukleotida u DNK i aminokiselina u polipeptidnom lancu tj. da li se kodoni čitaju sa preklapanjem ili ne  da li možda dva nukleotida predsavljaju šifru, ali se kodoni preklapaju?
1. kodoni se uvijek čitaju u 5’ – 3’ smjeru i to tri po trinukleotida 2. kodoni se ne preklapaju 3. poruka se prenosi u otvorenom okviru čitanja koji je određen start kodonom TRI OSNOVNA PRAVILA
Tri tipa tačkastih mutacija mijenja genetički kod 1. misens mutacije – dovode do promjene kodona tako da dolazi do zamjene jedne aminokiseline drugom 2. nonsens ili stop mutacije – nastaje stop kodon 3. mutacije promjene okvira čitanja (frameshift mutations) – adicije ili delecije najčešće jednog ili dva nukleotida
Supresorske mutacije
Štetne mutacije mogu biti “neutralisane” sekundarnom genetičkom promjenom Reverzne mutacije • promjene koje vraćaju nukleotidnu sekvencu u prvobitno stanje Supresorske mutacije •supresija promjene koja je nastala mutacijom na mjestuA, dodatnom mutacijom na mjestu B 1. Intragenska supresija 2. Intergenska supresija • geni koji dovode do supresije mutacije u drugim genima se nazivaju supresorski geni
jedan od najboljih primjera supresorskih mutacija su mutirani tRNK geni koji vrše supresiju efekta nonsens mutacija u kodirajućoj sekvenci (mutantne tRNK koje vrše supresiju misens ili mutacija koje menjaju okvir čitanja su takođe poznate) kod E.coli poznati su supresorski geni za svaki od tri stop kodona,oni kodiraju supresorske (mutirane) tRNK koje prepoznaju stop kodone kao signal za specifičnu aminokiselinu  npr. postoje tri dobro okarakterisana gena koja vrše supresiju UAG kodona, jedan ubacuje Ser, drugi Gln, a treći Tyr supresorske tRNK nastaju mutacijom koja menja antikodon date tRNK npr. supresorska tRNKTyr je nastala mutacijom koja menja antikodon GUA (3’-AUG-5’ čita kodon 5’-UAC-3’) u CUA (3’-AUC-5’ čita kodon 5’-UAG-3’) i na taj način omogućeno je prepoznavanje UAG kodona Intergenska supresija uključuje mutirane tRNK
Nonsens supresorske tRNK takođe čitaju i normalan terminacioni signal kada stop kodon dođe na A mjesto ribozoma postoji kompeticija između supresorske tRNK i RF faktora (release factor) za vezivanje za ribozom supresija UAG kodona je veoma efikasna, u prisustvu supresorske tRNK više od polovine terminacionih signala se čita kao kodon za specifičnu aminokiselinu E.coli ovo može da toleriše jer se UAG veoma rijetko koristi kao stop kodon međutim, supresija UAA kodona se dešava u prosjeku u 1-5%u prisustvu supresorske tRNK ovo je očekivano jer je UAA veoma čest stop kodon, i njegovo prepoznavanje od strane supresorskih tRNK bi često dovelo do nastanka aberantnih dugačkih polipeptida
Figure 15-7 a
rezltati sekvenciranja genoma su potvrdili univerzalnost genetičkog koda  univerzalan genetički kod je omogućio: direktno poređenje protein kodirajuće sekvence među različitim organizmima za koje je dostupna genomska sekvenca (postoje programi za predviđanje proteinske sekvence) genetički inženjering – ekspresija klonirane kopije gena koji kodira neki protein u nekom drugom domaćinu (npr. produkcija humanog inzulina u bakterijama) izuzetak: genetički kod se malo razlikuje u mitohondrijama i u genomima nekih prokariota kao i u nekoliko nuklearnih genoma eukariota
Molekularna Biologija TRANSKRIPCIJA
Razlike između transkripcije i replikacije 1.RNK se sastoji od ribonukleotida 2.RNK polimeraza ne zahteva prisustvo prajmera 3.Samo jedan lanac DNK se prepisuje 4.Novosintetisana RNK se odmah odvaja od lanca matrice; ovo omogućava da više RNK polimerazamože da transkribuje isti gen u isto vrijeme, tako da u kratkom vremenskom periodu može da nastane veliki broj RNK transkripata 5.greška pri transkripciji je 10-4, a pri replikacijije 10-7 6.samo pojedini dijelovi genoma se transkribuju (može da nastane i nekoliko hiljada kopija RNK), dok se čitav genom samo jednom u toku ćelijskog ciklusa udvaja replikacijom Više
Više RNK polimeraza može da transkribuje isti gen u isto vrijeme
-sinteza novog lanca u 5’-3’ smjeru -supstrat za enzim je nukleozidtrifosfat, a nukleozidmonofosfat se ugrađuje -enzim prepoznaje geometriju ispravno sparenog baznog para -vezivanje dva metalna jona u aktivnom centru enzima -visoko procesivni enzimi ZAJEDNIČKI MEHANIZAM DJELOVANJA ZA SVE POLIMERAZE
Mjesto početka transkripcije se obilježava kao +1 pozicija Nizvodne sekvence – koje se nalaze u 3’ smjeru u odnosu na početak transkripcije (pozicije ovih sekvenci imaju pozitivan predznak) Uzvodne sekvence - koje se nalaze u 5’ smjeru u odnosu na početak transkripcije (pozicije ovih sekvenci imaju negativan predznak) Promotor–sekvenca na DNK za koju se vezuje RNK polimeraza (uz pomoć inicijacionih faktora) INICIJACIJA
Inicijacija se može podijeliti u tri faze: 1.Vezivanjem RNK polimerazeza DNK formira se zatvoren kompleks (DNK je dvolančana) 2.Zatim se formira otvoreni kompleks razdvajanjem DNK lanaca oko 14 bp oko mjesta početka transkripcije (transkripcioni mjehurić) 3.Treća faza se naziva promotor escape- ugradnja prvih desetak ribonukleotida je veoma neefikasan proces i u ovoj fazi enzim često otpušta kratak transkript i započinje sintezu ponovo - u ovoj fazi kompleks polimeraza-promotor se naziva inicijalni transkribujući kompleks - kada enzim sintetiše prvih desetak nukleotida kaže se da je “pobjegao” promotoru i u ovoj fazi formiran je stabilan ternarni kompleks (enzim, DNK i RNK) i započinje faza elongacije
PITANJA I ZADACI: 1. Tokom transkripcije samo jedan lanac DNK se prepisuje. Kako se naziva lanac koji se prepisuje, a kako njemu komplementaran lanac koji se ne prepisuje? 2. Data je šifra jednog lanca DNK: 5’- ATTAGCGTATGTA-3’. Napišite sekvencu iRNK koja nastaje transkripcijom ukoliko data sekvenca DNK predstavlja: a) Kodirajući lanac b) Lanac matrice 3. Definišite promotor 4. Šta znači da je genetički kod degenerisan? 5. Napišite start kodon i stop kodone za translaciju 6. Napišite sekvencu peptida koji kodira sljedeća iRNK: 5’-AUGGUGGCACAUCCUGCAUAA-3’ Obilježite N i C kraj peptida 7. Koja od ponuđenih iRNK kodira dati polipeptid: N-Met-Leu-Thr-Arg-Gly-Met- His-C a) 5’-AUGCUAACCCGAGGCAUGCACUGG-3’ b) 3’- AUGCUAACCCGAGGCAUGCACUGA-5’ c) 3’- AGUCACGUACGGAGCCCAAUCGUA-5’
8. Data je skevenca iRNK. Zaokrižite koji proteimn kodira ova iRNK, ukoliko se zna da je metionin prva aminokiselina u nizu 5’- CGCUUCAUGGGCUCGGAAGUCUAAGUAGCA-3’ A) Met-Gly-Ser-Glu-Val B) Arg-Phe-Met-Gly-Val-Tyr-Val-Ala C) Met-Gly-Ser-Glu-Val-Tyr-Val-Ala D) Met-Arg-Phe-Met-Gly-Ser-Glu-Val E) Arg-Phe-Met-Gly-Ser-Glu-Val-Tyr-Val-Ala 9. Objasnite šta je otvoreni okvir čitanja? 10. Koliko nukleotida čini kodirajući dio ghena koji kodira protein od 250 aminokiselina? 11. Kodirajući region iRNK za neki hipotetički protein sadrži 963 nukleotida. Koliko kodona determiniše ovaj protein i koliko aminokiselina sadrži ovaj protein? 12. Nukleotidna sekvenca lanca matrice hipotetičkog gena je: 3’-TACTGATTCAGCACGCGGAAGGGAAATATC-5’ Desila se mutacija, tako da je guanin na poziciji 15 zamijenjen adeninom. Kakav to ima efekat na ekspresiju datog gena?

Check these out next

molekularna10-13.pptx

Recommended

More Related Content

Recently uploaded(20)

Featured(20)

molekularna10-13.pptx