Tecnicas de biología molecular

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Seminario de Técnicas de Biología Molecular. UBA

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  • Tecnicas de biología molecular

    1. 1. Seminario Genética Técnicas de Biología Molecular
    2. 2. 1º Extracción de ADN Se pueden tomar diferentes fuentes para extraer ADN humano: Sangre, Saliva, Semen, hisopado vaginal, restos de fluidos en ropa, orina, piel, bulbo piloso, muestras biospsias de órganos/tejidos, material cadavérico (ej huesos), etc Se separa el ADN de otras fases orgánicas celulares:
    3. 3. <ul><li>El ADN purificado refrigerado a 4 ° C se conserva hasta un máximo de 3 años. </li></ul><ul><li>Aquellas muestras que necesitan mantenerse más de 3 años deberán congelarse a -70 ° C. </li></ul>2º Almacenamiento y conservación del ADN:
    4. 4. Las técnicas desarrolladas utilizan: <ul><li>Fundamentos: </li></ul><ul><li>Complementariedad de bases </li></ul><ul><li>Replicación del ADN </li></ul><ul><li>Herramientas: </li></ul><ul><li>Elementos de virus y bacterias </li></ul><ul><li>(Ejemplo: Transcriptasa Reversa, Enzimas de Restricción, Polimerasas, etc.) </li></ul>
    5. 5. Las técnicas pueden ser Directas o Indirectas Fragmento de ADN El sector azul representa una secuencia conocida dentro fragmento de ADN El sector azul es una secuencia conocida que esta ligada/asociada a la presencia del sector que quiero buscar y desconozco su secuencia especifica (en verde) Detección ADN Directa Indirecta
    6. 6. Sólo veremos Técnicas Directas: <ul><li>Southern Blot </li></ul><ul><li>PCR </li></ul><ul><li>Secuenciación </li></ul>Directa Fundamentos: Complementariedad de bases Replicación del ADN
    7. 7. SOUTHERN BLOT Edwin Southern desarrolló esta técnica en 1975
    8. 8. <ul><li>Sirve para detectar por Hibridación la presencia de una porción de ADN en una muestra </li></ul><ul><li>Fundamento: COMPLEMENTARIEDAD DE BASES </li></ul><ul><li>Se diseña una sonda con nucleótidos marcados que sean complementarios al sector de ADN buscado . </li></ul><ul><li>El sector de ADN buscado puede ser un gen, o parte del mismo. Se puede utilizar para el diagnóstico molecular de patologías genéticas </li></ul>Southern Blot
    9. 9. <ul><li>HIBRIDACIÓN: </li></ul><ul><li>La doble hebra de ADN se forma por complementariedad SONDA-muestra (una de las hebras es la sonda en simple cadena y la otra es la muestra en simple cadena) </li></ul><ul><li>Los nucleótidos de la sonda está marcados P 32 (radiactivos): Si al revelar hay marcador radiactivo presente, está en la muestra analizada la secuencia complementaria a la sonda </li></ul>Southern Blot
    10. 10. Para poder realizar Hibridación en una muestra de ADN se necesitan realizar los siguientes pasos
    11. 11. Pasos: Previos a la Hibridación: separación de fragmentos <ul><li>Extracción de ADN </li></ul><ul><li>Fragmentar el ADN en porciones más pequeñas (Enzimas de restricción) </li></ul><ul><li>Separo los fragmentos realizando una corrida electroforética usando como sustrato de </li></ul><ul><li>migración un gel (separación por tamaño) </li></ul>
    12. 12. Pasos: Previos a la Hibridación: Inmovilización de los fragmentos en soporte sólido <ul><li>Desnaturalización con solución alcalina (SIMPLE CADENA) </li></ul><ul><li>Transferencia a soporte sólido (membrana de nylon / nitrocelulosa): Por capilaridad o por electroforesis: pasan del gel a la membrana </li></ul><ul><li>Se agrega solución (NaCl) para evitar rehibridación previa a colocar la sonda </li></ul>
    13. 13. Sacado de los bocetos de Edwin Southern antes de la publicación de la técnica
    14. 14. Pasos: Hibridación <ul><li>Se agrega la sonda sobre la membrana y se incuba </li></ul><ul><li>Se lava para quitar el máximo de hibridaciones inespecíficas </li></ul><ul><li>Se revela por autoradiografía </li></ul>
    15. 15. Sólo veremos Técnicas Directas: <ul><li>Southern Blot </li></ul><ul><li>PCR </li></ul><ul><li>Secuenciación </li></ul>
    16. 16. PCR: Reacción en cadena de la polimerasa Kerry Mullis en 1983 desarrolló esta técnica
    17. 17. <ul><li>Amplificación de un gran número de copias a partir de un fragmento molde de ADN, utilizando una reacción enzimatica simple de polimerizacion in vitro </li></ul>PCR ADN molde PCR ADN resultante
    18. 18. <ul><li>Fundamento: </li></ul><ul><li>REPLICACION DEL ADN </li></ul><ul><li>COMPLEMENTARIEDAD DE BASES </li></ul><ul><li>Herramientas: </li></ul><ul><li>POLIMERASA BACTERIANA </li></ul><ul><li>Estrategia: </li></ul><ul><li>Utilizar cambios de temperatura para desnaturalizar y renaturalizar las hebras de ADN complementario </li></ul>PCR
    19. 19. 1. Desnaturalización: 94°C - 96°C 2. Alineación: temperatura variable 3. Extensión: 68 - 72°C PCR: la reacción se divide en 3 pasos LOS 3 PASOS FORMAN 1 CICLO Y EL CICLO PUEDE REPETIRSE VARIAS VECES
    20. 20. Necesitamos en este proceso controlar la temperatura: termociclador Si repetimos el ciclo, tendremos cuatro copias Extensión de la cadena 75 ºC Primer Ciclo Múltiples ciclos darán un incremento exponencial en el número de copias Desnaturalización 95°C Hibridización 50-60 ºC 2 do Ciclo 95ºC 50 - 60ºC 75ºC
    21. 21. ¿Qué elementos son necesarios para la polimerización in Vitro? <ul><li>Extracción del ADN molde </li></ul><ul><li>Preparado de la MIX: </li></ul><ul><li>Agua libre de nucleasas </li></ul><ul><li>􀁺 Catión divalente ( MgCl2 ) </li></ul><ul><li>􀁺 Desoxinucleótidos ( dNTP´s ) </li></ul><ul><li>􀁺 Sol. amortiguadora y sales ( Buffer 10X) </li></ul><ul><li>􀁺 Oligonucleótidos ( Primers ) </li></ul><ul><li>􀁺 Enzima termo-resistente (Ej: Taq Polimerasa ) </li></ul>
    22. 22. <ul><li>Para la polimerización de ADN es necesario: </li></ul><ul><li>Una polimerasa, primers y nucleótidos . </li></ul><ul><li>Como se utiliza cambios de temperatura para lograr la desnaturalización y renaturalización de las hebras: la enzima tiene que ser resistente a cambios de temperatura </li></ul>¿Qué elementos son necesarios para la polimerización in Vitro?
    23. 23. <ul><li>Thermus aquaticus se descubrió en el Parque Yellowstone, inició el campo de la biología de los hipertermófilos. </li></ul><ul><li>Thermus aquaticus , crece a  70º grados (fuente de la  enzima taq polimerasa usada en la PCR) </li></ul>PCR
    24. 24. <ul><li>La taq polimerasa no es la única enzima usada en la PCR. Hay muchas más </li></ul><ul><li>Ej: PFU (enzima extraída de Pynococus Furioso) </li></ul>PCR Velocidad 500 nucleótidos/ min. Velocidad 2000 nucleótidos/ min. Tiene actividad 3’ exonucleasa No tiene actividad 3’ exonucleasa. Puede copiar con errores PFU TAQ
    25. 25. <ul><li>Complementariedad durante la hibridación en la fase de alineamiento </li></ul><ul><li>Se unen zona donde la secuencia es complementaria </li></ul><ul><li>Son diseñados los primers: esto permite seleccionar que porción amplificar </li></ul>PCR: Primers
    26. 26. PCR: <ul><li>Ejemplos de utilización PCR en diagnóstico: </li></ul><ul><li>Colocando primers FF diferentes (una para secuencia normal y otra mutada) y mismo RW en el mismo tubo </li></ul><ul><li>Combinando a PCR cortes con enzimas de restricción </li></ul>
    27. 27. El siguiente es el resultado en un gel de agarosa En la calle (1) se sembró el marcador de peso molecular En la calle (2) se sembró una muestra conocida para una mutación homocigota En la calle (3) se sembró la muestra del paciente
    28. 28. El siguiente es el resultado en un gel de agarosa En la calle (C1) muestra conocida homocigota gen mutado En la calle (C2) muestra conocida homocigota gen normal ¿Qué resultados dieron las muestras 1, 2, 3, 4?
    29. 29. ¿Qué elementos son necesarios para la polimerización in Vitro? <ul><li>Extracción del ADN molde </li></ul><ul><li>Preparado de la MIX: </li></ul><ul><li>Agua libre de nucleasas </li></ul><ul><li>􀁺 Catión divalente ( MgCl2 ) </li></ul><ul><li>􀁺 Desoxinucleótidos ( dNTP´s ) </li></ul><ul><li>􀁺 Sol. amortiguadora y sales ( Buffer 10X) </li></ul><ul><li>􀁺 Oligonucleótidos ( Primers ) </li></ul><ul><li>􀁺 Enzima termo-resistente (Ej: Taq Polimerasa ) </li></ul>
    30. 30. Los iones de magnesio estimulan a la enzima Taq Polimerasa para que incorpore los dNTP´s. Algunas aclaraciones… Sol. amortiguadora PCR: 􀁺 Mantiene el pH óptimo para que la enzima actúe 􀁺 Sales Proporcionan la fuerza iónica adecuada para una máxima actividad de la enzima, influyen temperatura desnaturalización y de hibridación Taq Mg
    31. 31. <ul><li>Herramientas: </li></ul><ul><li>POLIMERASA BACTERIANA que resista a los cambios Tº </li></ul><ul><li>Estrategia: </li></ul><ul><li>Utilizar cambios de temperatura para desnaturalizar y renaturalizar las hebras de ADN complementario </li></ul>PCR: cómo ve el observador el proceso MIX + ADN
    32. 32. Sólo veremos Técnicas Directas: <ul><li>Southern Blot </li></ul><ul><li>PCR </li></ul><ul><li>Secuenciación </li></ul>
    33. 33. Secuenciación: Método enzimático 1977: Frederick Sanger desarrolló esta técnica Método de los terminadores de cadena o dideoxi
    34. 34. <ul><li>Fundamento: </li></ul><ul><li>REPLICACION DEL ADN </li></ul><ul><li>COMPLEMENTARIEDAD DE BASES </li></ul><ul><li>Herramientas: </li></ul><ul><li>Dideoxinucleotidos </li></ul><ul><li>Estrategia: </li></ul><ul><li>Cuando se agrega un dideoxinucleotido a la cadena en formación se interrumpe la polimerización </li></ul>Secuenciación
    35. 35. En la polimerización del ADN H P O OH OH HO O O CH 2 NH 2 N N N N Azúcar Base Fosfato 3 ’ 5’ 2’ 1’ 4’ Jerárquico OH del carbono 3
    36. 36. Secuenciación: utiliza deoxinucleotidos y dideoxinucleotidos H P O OH OH HO O O CH 2 NH 2 N N N N Azúcar Base Fosfato 3’ 5’ 2’ 1’ 4’ H 2’3’-dideoxinucleótido monofosfato H P O OH OH HO O O CH 2 NH 2 N N N N Azúcar Base Fosfato 3’ 5’ 2’ 1’ 4’ deoxinucleotido monofosfato
    37. 37. Cuando se incorpora un dideoxinucleótido se interrumpe la polimerización H P O OH OH HO O O CH 2 NH 2 N N N N Azúcar Base Fosfato 3’ 5’ 2’ 1’ 4’ H 2’3’-dideoxinucleótido monofosfato
    38. 38. Se realizan 4 reacciones de síntesis (4 tubos separados) <ul><li>Se incluyen pequeñas cantidades de dideoxinucleotidos ddNTP que compiten con los dNTP. </li></ul><ul><li>En cada tubo se colocan: </li></ul><ul><li>dNTP (4 tipos ), </li></ul><ul><li>un solo tipo de ddNTP por tubo , </li></ul><ul><li>primer o cebador marcado, </li></ul><ul><li>ADN molde a secuenciar, </li></ul><ul><li>Polimerasa </li></ul>A ddNTP C ddNTP G ddNTP T ddNTP
    39. 40. <ul><li>Los productos de las 4 reacciones, cada una conteniendo una pequeña cantidad de uno de los cuatro dideoxinucleótidos, son cargadas en el gel y sometidas a electroforesis </li></ul><ul><li>Como la polimerización es solo en dirección 5’ a 3’, los fragmentos más cortos estarán en 5’ y los más largos que se encontrarán en la dirección 3 ’ </li></ul>Secuenciación: Separación de fragmentos ddTTP ddCTP ddGTP ddATP Lectura 5’ a 3’ desde la basa al tope
    40. 41. ► Alternativa del método Sanger ► Se marca cebador con fluorescencia y se activa la reacción ► Los productos se detectan durante electroforelectroforésis al pasar por un láser que excita los fluorocromos y se detecta fluorescencia emitida ► Se realizan 4 reacciones de secuencia distintas Se coloca el cebador marcado, polimerasa , dNTP y ddNTP ► Al finalizar las cuatro reacciones se mezclan en único tubo SECUENCIACION AUTOMATICA empleando método enzimático
    41. 44. + Big Hairy Computer … . . Placa caliente Pol. líquido A TT G C A Laser Prisma Detectores - Ventana Reacción Secuencia Capilar
    42. 45. ¿Cómo se ve el resultado?
    43. 46. En el electroferograma se observa dos picos en la posición 152 (G / A)

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