Segundo Cuaderno de Embriología Clínica, versión inglesa

4,086 views

Published on

Segundo Cuaderno de Embriología Clínica, “Criterios de Valoración Morfológicos de Oocitos, Embriones tempranos y Blastocistos Humanos”

Published in: Health & Medicine
1 Comment
4 Likes
Statistics
Notes
No Downloads
Views
Total views
4,086
On SlideShare
0
From Embeds
0
Number of Embeds
343
Actions
Shares
0
Downloads
330
Comments
1
Likes
4
Embeds 0
No embeds

No notes for slide

Segundo Cuaderno de Embriología Clínica, versión inglesa

  1. 1. CLINICAL EMBRYOLOGY PAPERS II. ASEBIR criteria for the morphological evaluation of human oocytes, early embryos  and blastocysts.  nd  (2  edition)
  2. 2. ASEBIR CRITERIA FOR THE  MORPHOLOGICAL EVALUATION OF HUMAN  OOCYTES, EARLY EMBRYOS AND  BLASTOCYSTS.  ASEBIR working committee  Coordinators  Manuel Ardoy  Gloria Calderón  Contributors  Gemma Arroyo  Jorge  Cuadros  María José  Figueroa  Raquel  Herrer  Juan Manuel Moreno  Águeda Ortiz  Fernando Prados  Luz Rodríguez  Josep  Santaló  María José  de los Santos  Jorge  Ten  María José  Torelló Published by: Asociación  para el  Estudio  de  la Biología  de  la Reproducción (ASEBIR). C/ Cronos  20,  Edificio 4,  1º,  6ª  ­  28037  Madrid ­  Tel: 91 367 89 94 www .asebir.com  ·  asebir@asebir.com Design and layout: GÓBALO Gráfica  ·  W ·  Multimedia ·  Consultoría  eb C/ Nogal  1,  1º  31  ­  28250  ·  Torrelodones ·  Madrid ·  Tel ­  Fax.: 91 859 57 22 www .gobalo.es ·  info@gobalo.es Legal Deposit: M­6826­2010
  3. 3. CONTENTS LIST OF COMMITTEE MEMBERS . . . . . . . . . . . . . . . . . . ………………. . . . .1 PRESENTATION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .5 INTRODUCTION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . .7 1. MORPHOLOGICAL EVALUATION AT EACH STAGE . . . . . . . . . . .. . . . .9 1.1 Morphological evaluation of the Oocyte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . …. . . . . . . . . . .9  1.1.1  Parameters evaluated at the oocyte stage.  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ……… . . . . . .9  1.1.2  Oocytary parameters included in the classification system.  . . . . . . . ………….. .. . . .16  1.1.3 Recommendations. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ….... . . . . . . . . . .16 1.2 Morphological evaluation of the zygote. D+1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . …. . . . . . . . . . . . . . . .17  1.2.1 Postinsemination observation time interval in D+1. . . . . . . . ………………….. . .17  1.2.2  Parameters evaluated at the  D+1 stage. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ………….. . . .18  1.2.3  D+1 stage parameters included in the classification system.  . . . . . . ………………. .24  1.2.4 Recommendations. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ……. . . . . . . 24 1.3 Morphological evaluation at D+2  and  D+3. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ……... . . .25  1.3.1 Observation intervals at D+2 and  D+3. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . …….. . . . .25  1.3.2  Parameters evaluated at the  D+2 and  D+3  stages. . . . . . . . . . . . . . . . ……... . . . .25  1.3.3  D+2 and D+3 stage parameters included in the classification system.  ………...…... . .35  1.3.4 Recommendations. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ….. . . .36 1.4 Morphological evaluation at the morula and blastocyst stages. D+4, D+5  and  D+6  . . …... . .37  1.4.1 Postinsemination observation interval at D+4, D+5 and  D+6 . . . . . . . . ……….. . .37  1.4.2  Parameters evaluated at the  D+4, D+5 and  D+6  s t a g es . . . . . . . . . . . . . . ... . . . .37  1.4.3  D+4, D+5 and D+6 stage parameters included in the classification system…………..  . .41  1.4.4 Recommendations. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . …... . . . . . . .42 2. GRADING SYSTEM FOR EMBRYO QUALITY. . . . . . . …. ………….. . . .43  2.1 Grading embryo quality at D+2  and  D+3  transfers . . . . …………………….……. . .44  2.2 Grading embryo quality at D+5  and  D+6  transfers . . …………………………. . . .45  2.3  Grading systems proposed for day­to­day work.  . . . . . . . . . . . ………………... . . . .46  2.4  Disagreements with the grading system . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ………. . . . . . . .49 3. GENERAL RECOMMENDATIONS. . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..49 REFERENCES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ...................................... . . . . . . . . . . . .50
  4. 4. PRESENTATION The  ASEBIR  committee  for:  “The  definition  of  morphological  evaluation  criteria and their categorization, from Oocyte to Blastocyst” was created in 2004 to try to respond to the need for the unification of embryo evaluation criteria. The  lack  of  consensus  in  this  key  aspect  of  clinical  embryology  poses  common problems,  such  as  the  inability  to  generate  multicentre  studies  with  a  consistent evaluation of embryo quality, difficulties in the interpretation of clinical reports from other labs and the inability to compare bibliographical data. The goal of the committee was to set out a proposal for morphological evaluation criteria and their categorization into scales for each of the various embryo stages. In order to perform this work the committee has relied on three main tools: The exhaustive review of relevant literature including direct consultation with some of the authors; a multicentre survey based on this review and the actual experience of the members of the committee. The result of this work was the creation of an embryo classification in categories which,  together  with  the  doubts  about  the  essential  parameters,  are  subject  to future revision by the ASEBIR Interest Group “Embryo Quality”. Lastly we should mention that we have considered it essential to include pictures with the morphological descriptions, it is of interest to note that these have been produced  by members  of the  commission itself, meaning  that  the  consensus  on them is unanimous. We hope that this fact explains the variation in the quality and presentation of the photographs.
  5. 5. INTRODUCTION Scientific  evidence  indicates  that  gestation  in  human  largely  depends  on  both endometrial receptivity  and  embryo  quality;  both  aspects  are  far  from  being  well studied. In dealing with embryo quality the first decision to be made relates to the selection of the  working tool.  Twenty­nine  years  after  the  birth  of  the  first  baby  by  in vitro  fertilization, the most common method for  evaluating  embryo  quality is still the use of morphological parameters. Other criteria such as metabolic consumption,  the  study  of  aneuploides  and  other  resources  are  proving  to  be effective  and  evidently  have  a  promising  future.  However,  morphology continues to be the most widespread and effective system in use (Gardner et al.,  2001;  Haggarty  et  al.,  2006;  Hamamah,  2005;  Leese  et  al.,  1993;  Leese, 1995; Munne and Wells, 2002; Scott, 2003). We will also need to decide which developmental stages should be chosen for the morphological  classification  of  embryos.  The  stage  usually chosen  is  that  of  the embryo  during  the  second  or  third  day  of  culture  (D+2  or  D+3)  or  the  blastocyst stage  (D+5  or  D+6).  However,  recent  studies  have  shown  that  evaluation during the other days of culture:  oocyte  (D+0),  zygote  and first cell division (D+1)  and  morula (D+4),  can  also  be  useful  in  the  classification  of  embryos and so they are also considered in this study. At  each  stage  of  the  embryo  development  we  analysed  the  morphological parameters  extracted  from  the  literature.  The  final  classification  system  includes all parameters  that  are  obviously  related  to  the  probability of  successful  embryo implantation.  Some  of the  parameters that  were  excluded  from the  classification system  have  been  proposed  for  use  in  helping  to  choose  between  several embryos  falling  within  the  same  category.  Lastly,  certain  morphological parameters  require  further  study  before  they  can  be  included  in  the  decision­ making system. Once all the morphological data has been collected we need to decide how they should  be  weighted  within  the  final  embryo  classification  system. We  have  two basic  options  in  this  respect:  Evaluation  either  by  category  or  by  scoring.  This committee has opted for the first alternative because it is a broader method and because of the difficulties in agreeing on suitable weighting levels for each of the parameters, although in the future we will definitely be concentrating our efforts on this task (Balaban et al., 2006).
  6. 6. Morphological Classification (Oocyte and Embryos).  9 1.  MORPHOLOGICAL EVALUATION AT EACH STAGE 1.1 Morphological evaluation of the Oocyte The  oocyte  maturation  includes  changes  at  the  cytoplasm  and  at  the  nucleus, these  are  not  always  simultaneous  nor  do  they  occur  at  the  same  level  of maturation.  Oocytes  having  metaphase  II  nuclear  maturation  may  present deficiencies  in  cytoplasmic  maturation  that  would  compromise  the  correct development of the embryo (Scott, 2003). The  review  of  the  literature  has  shown  us  that  a  mature  oocyte  may  present alterations or dimorphisms, which allow us to perform a morphological evaluation: 1.1.1 Parameters evaluated at the oocyte stage. a) Cytoplasmic morphological alterations: Organelle clumping/localised granulation at the centre of the oocyte. Smooth endoplasmic reticulum clusters. Vacuoles. Cytoplasmic inclusions. b) Extra­cytoplasmic morphological alterations: Exudates in the perivitelline space Anomalies in the zona pellucida Enlarged perivitelline space. Alterations to the first polar body: Fragmentation and size. c) The cumulus­corona radiata­oocyte complex Organelle clumping/localised granulation at the centre of the oocyte This is a common alteration of the cytoplasm of the oocyte, when viewed under the microscope it can be described as an individual dark mass with an excessively high granular  content  normally  located  at  the  centre  of  the  oocyte  (Kahraman  et  al., 2000;  Meriano  et  al.,  2001;  Van  Blerkom  and  Henry,  1992).  Other  apparent differences  in  cytoplasmic  texture  and  density  have  also  been  described. Extensive  cytoplasm  granularity  due  to  extensive  vesiculization,  may  either  be homogeneous, affecting the whole of the oocyte (Meriano et al., 2004; Van Blerkom and Henry, 1992); see image 1.
  7. 7. 10  __________________Morphological Classification (Oocyte and Embryos).  Image 1.Localized granulation at the centre of the oocyte.  Smooth endoplasmic reticulum clusters (sERCs)  When  viewed  under  an  optical  microscope  this  appears  as  a  type  of  individual  cytoplasmic inclusion  that is  slightly  elliptical in  shape  and of  a  similar  size  to  a  pronucleus  (Meriano  et  al.,  2001;  Serhal  et  al.,  1997;  Van  Blerkom  and  Henry,  1992); see image 2.  Examined  by  transmission  electron  microscopy  it  has  been  confirmed  that  this  dimorphism  is  the  result  of  a  massive  accumulation  of  tubular­type  smooth  endoplasmic reticulum clusters (Otsuki et al., 2004).  Image 2. The presence of sERCs (R) and small vacuoles (V) in the oocyte.  Vacuoles  Vacuoles  are  different  from  aggregations  of  sER  in  that  they  are  a  type  of  cytoplasmic inclusion surrounded by a membrane and are filled with fluid, they are  clearly distinguishable under the microscope (Otsuki et al., 2004; Van Blerkom,
  8. 8. Morphological Classification (Oocyte and Embryos).  11 1990);  see  image  3.  Their  number  and  size  may  vary  considerably  between different  oocytes  and  even  within  each  individual  one (Van  Blerkom  and  Henry, 1992). These vacuoles arise through the fusion of pre­existing vesicles derived from Golgi apparatus and/or the smooth endoplasmic reticulum (El Shafie et al., 2000) or spontaneously (Van Blerkom, 1990). Image 3. The presence of vacuoles in the oocyte. Cytoplasmic inclusions These include several types of cytoplasmic characteristics considered to be small areas of necrosis,  these  will  include  refractile  bodies  of  ~10  μm  in  diameter  and  are composed of lipids and dense granules which may either be clumped together or isolated  (Serhal  et  al.,  1997,  Suzuki  et  al.,  2004)  and  also  non­refractile pyknotic  bodies  which  normally  appear  as  a  horse­shoe  shape  (Meriano  et  al., 2001); see image 4. Image 4. The presence of inclusions. pyknotic body (PC), necrotic body (NC), refractile bodies (I).
  9. 9. 12  __________________Morphological Classification (Oocyte and Embryos).  Exudates in the perivitelline space  The presence of granulation or detritus in the perivitelline space is considered to  be  an  extra­cytoplasmic  anomaly.  This  detritus  is  related  to  a  deterioration  of  the  internal  zona  pellucida,  and  any  increase  may  affect  the  fertility  of  the  oocyte  after  conventional IVF has been performed (Veeck, 1999b). Others authors observed  that the presence of detritus  may be a sign of an “overdose” of gonadotropins  used  in  the  stimulation  protocols,  although  does  not  appear  to  be  related  to  the  quality  of  the  embryo  or  rates  of  fertility,  division,  pregnancy  or  implantation  (Hassan­Ali  et  al.,  1998).  As  such,  this  dimorphism  may  be  a  phenomenon  related to the physical maturation of the oocyte (Balaban  and  Urman, 2006);  see  image 5.  Image 5. Detritus in the perivitelline space.  Anomalies in the zona pellucida  The  zona  pellucida  undergoes  changes  in  the  thickness  and  appearance  of  the  bilayer from D+1 to D+2; this is not noticeable at D+0. But other anomalies: a non­  circular  profile,  bulging,  septation  etc.  remain  during  development  and  can  be  more  easily detected  at the  time  of micro­injection  when  turning the  oocyte;  see  images 6 to 9.  Image 6. Non­circular zona pellucida.
  10. 10. Morphological Classification (Oocyte and Embryos).  13 Image 7. Dark zona pellucida. Image 8. Thick zona pellucida. Image 9.Septated area
  11. 11. 14  __________________Morphological Classification (Oocyte and Embryos).  Enlarged perivitelline space  This  dimorphism  can  be  clearly  seen  through  a  microscope  due  to  the  enlargement  of  the  perivitelline  space  and  makes  the  oocyte  appear  to  be  “floating” within the interior of the zona pellucida, see image 10. If the oocyte also  presents  a  large  first  polar  body  this  may  be  associated  with  a  reduction  in  the  embryo quality at D+2 (Xia, 1997).  Image 10. Enlarged perivitelline space.  st  Alterations of the first polar body (1  PB):  It seems that the morphology of the 1st PB changes within hours of in­vitro culture  and, as such, may vary depending on the observation time  (Balaban et al., 1998).  In  fact,  a  positive  correlation  has  been  detected  between  the  percentage  of  fragmentation  of  the  1st  PB  and  the  time  passed  between  denudation  and  ICSI  (Ciotti  et  al.,  2004);  as  well  as  an  increase  in  the  fragmentation  of  the  1st  PB  over time  (Verlinsky  et  al.,  2003).  Some authors have suggested that the morphology of the 1st PB may be  related to pregnancy and implantation rates (Ebner et al., 1999, 2000, 2002).  On the other hand, a variation in the size of the 1st PB (large or small) may be  treated as an anomalous condition of the oocyte (Veeck, 1999b). The determining  factor is probably the position of the meiotic spindle in relation to the surface of the  oocyte. These oocytes may therefore present chromosomal abnormalities  (Veeck,  1999b); see images 11 to 13.
  12. 12. Morphological Classification (Oocyte and Embryos).  15 Image 11. Different sizes of polar bodies. A, large; B, normal; C, small. Image 12. Double polar body. Image 13.Fragmented polar body. The cumulus­corona radiata­oocyte complex  The level of maturity of the complex has been used as an indicator of the  oocyte maturity, although synchrony between both is questionable, above  all  in  stimulated  cycles  (Hartshorne  et  al.,  1999;  Tarin  and  Pellicer,  1992).  This may be due to differences in the sensitivity of the cells of the cumulus­corona  complex  and  the  nucleus  of  the  oocyte  to  induced  maturation  through
  13. 13. 16  __________________Morphological Classification (Oocyte and Embryos).  gonadotropins and other follicular factors (Balaban and Urman, 2006).  1.1.2 Oocytary parameters included in the classification system.  The  review  of  the  literature  undertaken  reveals  a  large  disparity  in  results  (De  Sutter  et al., 1996; Loutradis et al., 1999) probably due to the fact that the studies are  retrospective, are not standardised and, in their majority, are based on an insufficient number  of cases. Table  I  shows  a  summary  of the  correlation  of oocyte morphology  with  various parameters.  The  current  state  of scientific  knowledge  does  still  not  allow  us  to  establish that  the morphological parameters analyzed have a direct relationship, by themselves,  with  the  most  significant  reproductive  variables.  For  this  reason  we  can  not  include oocyte quality as a relevant parameter in the categorization of the future  embryo;  although  it  is  becoming  more  evident  that  it  should  be  included  in  the  future as more data is published.  Table I. The correlation of oocyte morphology with several parameters, according to the literature  consulted. Yes, there is correlation; No, there is no correlation; NE, correlation not evaluated.  1.1.3 Recommendations  Based on the recent review of Balaban and Urman (2006) we can conclude that:  ­ The results of the effect of extra­cytoplasmic alterations are controversial and there  appears to be no relationship between these and the rate of implantation of the
  14. 14. Morphological Classification (Oocyte and Embryos).  17 resulting  embryos.  These  oocytes,  instead  of  being  anomalous,  may  be considered  to  be  phenotypical  deviations resulting from the  heterogeneity  of the extracted oocytes. ­  Based  on  the  published  data  it  would  appear  to  be  more  evident  that  severe cytoplasmic  alterations,  such  as  the  presence  of  accumulations  of  smooth endoplasmic  reticulum,  the  severe  accumulation  of  centralised organelles/granulation  and  excessive  vacuolization  may  prejudice  the  embryo development  and  so  their  implantation  potential.  As  such,  these  severe cytoplasmic abnormalities will need to be taken into account when establishing the differences between embryos of the same morphological quality. We  recommend  the  use  of  some  of  these  parameters  to  establish  the differences between embryos of the same morphological quality: Unfavourable: ­ Accumulations of the sER ­ Central granularity We also recommend the observation of the zona pellucida at this stage. 1.2 Morphological evaluation of the zygote. D+1 Visualization  of  the  zygote  has  often  been  considered  to  be  a  useful  tool  for detecting defects or alterations of fertilisation. However, the process of fertilisation involves  an  ordered  series  of  morphological  changes  that  significantly  affect  the appearance of the cell.  These changes are gaining more and more relevance in the final evaluation of the embryo quality.  What is more, certain publications have advocated decision­making based solely on this stage, either due to observations from their own studies or the legal requirements of each country. 1.2.1 Postinsemination observation time interval in D+1. Fertilisation involves a sequence of morphological changes.  This fact implies that the time of observation of the pronuclei is crucial in the correct evaluation of the zygote. The use of incorrect time ranges in the evaluation of fertilisation may cause several problems:
  15. 15. 18  __________________Morphological Classification (Oocyte and Embryos).  At the pronuclear level: Non­visualization of the pronuclei, size alterations,  incorrect evaluation of juxtaposition.  Modified sizes of nucleolar precursor bodies.  Variation of the appearance of the cytoplasm.  Usual  interval  time  for  observing  pronuclei  vary  between  16  and  22  hours  from  insemination­microinjection.  This interval may mean that observations performed  at  between  20  and  22  hours  run  the  risk  of  the  pronuclei  having  already  disappeared  or  their sizes  changed;  for  this reason  we  recommend to  decrease  the range from 16 hours to a maximum of 19 hours for ICSI.  1.2.2 Parameters evaluated at the  D+1 stage.  a) Morphological observations:  ­ Polar bodies (PB) (number and appearance)  ­ Pronuclear number  ­ Appearance of the pronuclei (PN):  ­ Symmetry, synchrony and location  ­ Nucleolar precursor bodies (NPBs) (number, symmetry and polarization)  ­ Cytoplasmic halo (presence and appearance)  b) Early cleavage  Polar bodies  ­  Number.  There  is  no  evidence  that  the  number  of  polar  bodies  should  be  included  in  morphological  evaluation.  However,  it  is  essential  that  they  be  considered  when  evaluating  the  ploidy  in  conjunction  with  the  number  of  pronuclei; see image 14.  Image 14. Number of polar bodies at D+1.  ­  Appearance.  The  appearance  of  a  polar  body  usually  refers  to the  alterations  in  their size or to fragmentation. There is currently no evidence to support the
  16. 16. Morphological Classification (Oocyte and Embryos).  19 inclusion of this parameter in morphological evaluation; see image 15. Image 15. A, fragmented bodies; B, separated bodies. Pronuclear number The  joint  evaluation  of the  number of  pronuclei, the  number  of  polar  bodies  and the  insemination  technique  being  used  (conventional  or  ICSI)  will  help  us  to decide what to do when, at D+1, we have zygotes with the morphology shown in images 16 and 17. Image 16. A, 1 pronucleus + 2 polar bodies; B, 1 pronucleus + 1 polar body; C, 2 pronuclei + 1 polar body. Image 17.A, 2 pronuclei + 2 polar bodies; B 3 pronuclei; C, micronuclei.
  17. 17. 20  __________________Morphological Classification (Oocyte and Embryos).  Appearance of the pronuclei  The literature we reviewed contained several pronuclear parameters that unify the  appearance of the pronuclei and the nucleolar precursor bodies (NPBs). Figures 1  and 2 show two common examples of pronuclear grading based on appearance  (Scott,  2000;  Tesarik  and  Greco,  1999).  However,  there  is  no  relevant  literature  available to enable us to evaluate each individually; see images 18 to 23.  Figure 1. The pronuclear grading system proposed by Tesarik and Greco (1999).  Figure 2. The pronuclear grading system proposed by Scott et al.(2000).  Image 18. Separated pronuclei.
  18. 18. Morphological Classification (Oocyte and Embryos).  21 Image 19.A, different pronuclei; B, only one nucleolar precursor body (NPB) in a pronucleus. Image 20. A, only two precursors (NPBs) in a pronucleus; B, polarization of the NPBs only in one pronucleus. Image 21. A, peripheral pronuclei; B, asymmetric NPBs, the arrows indicate some of the inequalities.
  19. 19. 22  __________________Morphological Classification (Oocyte and Embryos).  Image 22. A, polarized NPBs only in one of the pronuclei; B, polarized NPBs in both pronuclei. p:  polarized, d: dispersed.  Image 23. A, atresic oocyte at D+1 after micro­injection; B, presence of micronucleus indicated by the  arrow.  No consensus was found in the literature when attempting to correlate the various  pronuclear  patterns  with  implantation  rates,  although  there  are  three  morphological  characteristics  which  do  appear  to  be  associated  to  low  implantation rates or with bad embryo morphology.  ­ A single nucleolar precursor body in one pronucleus  ­ Separated pronuclei  ­ Pronuclei of unequal size  Cytoplasmic halo  This is the presence of a lighter cortical area in a part or in all of the cytoplasm.  Several  publications  have  come  to  the  conclusion  that  this  is  a  positive  characteristic as long as it is not excessive.  Zygotes with halo will tend to develop  into  higher  quality  embryos  (60.9%)  than  zygotes  without  a  halo  (52.2%)  with  a  significant  statistical  difference  (Balaban  and  Urman,  2006;  Payne  et  al.,  1997;  Salumets et al., 2001; Zollner et al., 2002); see images 24  and 25.
  20. 20. Morphological Classification (Oocyte and Embryos).  23 Image 24. A, zygote without a halo; B, zygote with an incomplete halo partially present around the cell; C; zygote with a complete halo. Image 25. A, zygote with an excessive halo; B, zygote with a correct halo. Early cleavage An  observation  performed  between  25  and  27  hours  after  insemination;  see image 26. This parameter has been analysed in many studies but never by itself; it has always been studied in conjunction with the morphology of the zygote (Chen and Kattera, 2006), mononucleation at D+2 (Ciray  et  al.,  2005) or the morphology at D+3 (Neuber et al., 2003). Image 26. An embryo with early division at 26 hours.
  21. 21. 24  __________________Morphological Classification (Oocyte and Embryos).  These studies attempt to correlate early division with morphology at D+2 and D+3  (Ciray  et al., 2006; Lundin et al., 2001), development up to blastocyst (Neuber  et  al.,  2003),  viability  (Salumets  et  al.,  2003;  Shoukir  et  al.,  1997), the  implantation  rate (Ciray et al., 2006; Rienzi et al., 2005) and the abortion rate (Van Montfoort et al.,  2004).  The  usefulness  of  this  observation  is  not  unanimous.  Most  publications  recommend  the  use  of  early  cleavage  as  a  “secondary  parameter”  to  distinguish  between embryos of a similar quality.  The following morphological parameters have been analysed:  ­ Occurrence of first cell division.  ­ Similarity of blastomeres.  ­ Presence of fragmentation.  ­ Multinucleation.  Ciray et al. (2006) reached the following conclusion: If we use  early cleavage to  decide  at  the  time  of  transfer,  we  will  select  the  embryo  which,  26  hours  after  insemination, presents two blastomeres of the same size having no fragmentation  and no multinucleation.  1.2.3 D+1 stage parameters included in the classification system  As  with  D+0,  the  review  of  the  published  data  we  undertook  revealed  a  large  variation in results. The current state of knowledge does not allow us to establish  that  the  morphological  parameters  analyzed  have  an  independent  and  unquestionable relationship to the implantation rate.  Quality at D+1, as well as the D+0 parameters, is likely to be included in the future  as more data are published.  1.2.4 Recommendations  We recommend the use of some of the parameters analysed but not included in the  classification system as a useful means to differentiate between embryos with the  same morphological quality:  Favourable:  ­ The presence of a halo.  ­ Early cleavage.  Unfavourable:  ­ A single nucleolar precursor body.  ­ Separated pronuclei.  ­ Pronuclei of unequal size.
  22. 22. Morphological Classification (Oocyte and Embryos).  25 We also recommend that the results on table II be followed for deciding whether or  not  to  continue  embryo  culture  based  on  the  number  of  polar  bodies  and pronuclei,  bearing  in  mind  that  digyny  involves  the  risk  of  triploidy  and  that parthenogenesis does not produce gestation.  PN­PB r elationship  IVF  ICSI  2 PN + 1 PB  Discard*  If it develops, 80%  If it develops, 20%  1 PN + 2 PB**  diploidy  diploidy  1 PN + 1 PB  Discard  > 2PN  Discard  2 PN + 2 PB  Continue Table II. Culture recommendations based on the number of polar bodies and pronuclei. * If you find 2 PN + 1 PB, the zygote should be discarded because the two possibilities are: parthenogenesis or a high likelihood of digyny with the associated risks for the foetus (Carceller et al., 2004). ** Continue up to laboratory decision. 1.3 Morphological evaluation at D+2 and at D+3. Evaluation  at  these  stages  has  traditionally  formed  the  basis  for  determining embryo  quality.  However,  while  there  is  a  certain amount  of agreement on  what constitutes  a  good  embryo  and  what  constitutes  a  bad  one,  it is  very  difficult  to find a consensus between laboratories when attempting to evaluate intermediate quality  embryos.  A  recent  survey  of  IVF  clinics  in  Spain  demonstrated  a  large disparity  in  the  criteria  used  for  evaluating  embryos.  This  disparity  was  more pronounced in the area of intermediate­quality embryos  (Bruna  et  al.,  2005). The absence  of  a  set  of  common criteria  affects  both  the  evaluation  parameters  and the cut­off points between categories; it also affects the algorithms used to define the morphological quality category of the embryo. 1.3.1 Observation interval at D+2 and D+3. The recommended observation intervals are: ­ D+2: 44­47 hours postinsemination. ­ D+3: 67­71 hours postinsemination. 1.3.2 Parameters evaluated at the  D+2 and D+3  stages. ­ Cell number and rate of division. ­ The percentage and type of cell fragmentation. ­ Inequalities in the sizes of blastomeres.
  23. 23. 26  __________________Morphological Classification (Oocyte and Embryos).  ­ Irregular shape of the blastomere  ­ Visualisation of the nucleus and level of multinucleation.  ­ Acytoplasmic ring.  ­ The presence of vacuoles.  ­ Zona pellucida.  ­ Level of early compaction/adhesion.  ­ Pitting.  Cell number and rate of division.  There  are  very  few  studies  which  provide  a  clear  system  for  assigning  different  implantation  rates  for  each  number  of  cells  or  rate  of  division.  In  general,  the  literature  we  studied  does  not  discriminate  between  this  parameter  and  others  which  may  clearly  influence  the  potential  for  implantation:  Multinucleation,  fragmentation cut­off point, exclusion of observation at D+2 etc. (De Placido et al.,  2002; Fisch et al., 2001; Neuber et al., 2003; Racowsky et al., 2003).  Based on the main publications and the results of the national multicentre survey  organized  by  the  ASEBIR  committee,  we  can  outline  a  classification  system  according  to  the  number  of  cells  at  D+2  and  the  division  rates  for  D+2  to  D+3  (Desai  et  al.,  2000;  Hardarson  et  al., 2001; Van Royen et al., 2001); see images  27, 28 and 29.  Image 27. Cell number, cell studies from 2 to 5 blastomeres.
  24. 24. Morphological Classification (Oocyte and Embryos).  27 Image 28. Cell number, cell studies from 6 to 8 blastomeres. Image 29. Cell number, cell studies from 9 to 10 blastomeres. Transfer on D+2: Using the current studies it is possible to group embryos with similar implantation rates  according  to  the  number  of  cells  observed.  From  the  best  to  the  worst implantation rate: ­ 4 cells. ­ 2 or 5 cells. ­ 3 or 6 cells. ­ 1 cell or more than 6 cells. While there are no significant differences between 2 and 5 cells, the presence of 5 cells tends to produce a better implantation rate. This tendency can also apply to the group of 3 or 6 six cells, being 3 cells slightly better than 6 cells on day 2. Transfer on D+3: The evaluation of the embryo on D+3 is dependent on the division rate between D+2 and D+3.
  25. 25. 28  __________________Morphological Classification (Oocyte and Embryos).  Using current studies it is possible to group embryos as a function of the  implantation rates as shown in table III.  Table III. Grouping of embryos according to cell division, from best to worst implantation rates.  Percentage and type of cell fragmentation  The  presence  of  cell  fragmentation  is  common  in  human  embryos  and  does  not  always correlate to a low implantation rate.  As  long  as  the  level  of  fragmentation  does  not  exceed  20%  (Hardarson  et  al.,  2001;  Van  Royen  et  al.,  1999;  Ziebe  et  al.,  1997)  or  even  25%  (Alikani  et  al.,  2000;  Racowsky  et  al.,  2003),  implantation  of  the  embryo  will  not  be  compromised.  Common  observation  methods  for  fragmentation  levels  do  not  allow  us  to  detect  differences  smaller  than  10  percentage  points  and  so  both  these cut­off points (20% and 25%) are equally acceptable.  As well as the percentage of fragments, their size and distribution may also have a  correlation with the probability of implantation (Alikani et al., 2000). When there is a  predominance  of  large  fragments,  which  may  also  be  confused  with  small  cells,  spread  throughout  the  embryo,  there  is  a  low  probability  of  implantation.  This  is  known  as  a  “Type  IV”  fragmentation  pattern  (Alikani  and  Cohen,  1995)  and  is  associated with a very low probability of implantation.  The evaluation of this parameter can be done both at D+2 and at D+3 and it can  be used to divide embryo quality into four groups according to the percentage of  fragmentation, see images 30 to 32:  ­ ≤ 10%  ­ 11 ­ 25%  ­ 26 ­ 35%  ­ >35%
  26. 26. Morphological Classification (Oocyte and Embryos).  29 Image 30. Embryos with 4 and 8 blastomeres with 10% fragmentation. Image 31. Embryos with 15 – 25% fragmentation Image 32. A, embryo with 35% fragmentation; B, embryo with type IV fragmentation.
  27. 27. 30  __________________Morphological Classification (Oocyte and Embryos).  Inequalities in the sizes of blastomeres  When  a  zygote  undergoes  the  first  mitotic  cell  divisions,  the  cells  not  always  cleave  symmetrically  and  synchronically. An  embryo  undergoing  synchronic  and  symmetric cleavage will present 2, 4, 8 or 16 cells of a similar size.  Inequalities in cell size are usually associated with a clear reduction in the ability for  implantation (De Placido et al., 2002; Hnida et al., 2004; Steer et al., 1992; V Blerkom  an et al., 2000; Veeck, 1999a).  According  to  Hardarson,  a  4  cell  embryo  with  asymmetric  cell  division  is  one  in  which  the  difference  between  the  diameters  of  the  largest  and  smallest  blastomeres  is  larger  than  20%  the  diameter  of  the  smallest.  These  unevenly  sized  blastomeres  are  related  to  a  reduction  in  the  implantation  potential  of  the  embryo. See figure 3 and image 33 (Hardarson et al., 2001).  Figure 3. Diameter ratios according to Hardarson.  Image 33. A, a ratio of 16% between blastomeres; B, a ratio of 24% between blastomeres.
  28. 28. Morphological Classification (Oocyte and Embryos).  31 When cell division is not synchronous, meaning that the embryos do not have 2, 4, 8 or 16 cells, it is evident that cells from two different cell cycles are co­existing. This  implies  that  when  we  see  embryos  with  3,  5,  6,  7,  9  etc.  blastomeres,  we should also expect to see two different sizes of cells (Scott, 2003). In an embryo with 3 cells, one of these must correspond to a blastomere of a 2 cell embryo which has not yet divided and which should be clearly larger than the other two cells, the sizes of these should be as expected for blastomeres at the 4 cell stage. If cytokinesis has been symmetrical, 3 of the cells in a 5 cell embryo should have the size of the 4 cell stage and 2 of them the size of the 8 cell stage. This means we should expect to see 3 large cells and 2 small ones. This means that inequalities in the sizes of the blastomeres should be compatible with a positive classification when they appear in the following way: 3 Cells  2 small + 1 large 5 Cells  2 small + 3 large 6 Cells  4 small +2 large 7 Cells  6 small + 1 large Other size combinations imply asymmetric division with an anomalous distribution of cytoplasm between the resulting cells. Irregular shape of the blastomere A blastomere with an irregular shape may either have a physiological alteration or be undergoing division (Goyanes et al., 1990). It is difficult to evaluate the relationship of this characteristic with the potential for implantation and it has therefore not been included as a criterion for assigning embryo category. See image 34. Image 34. Irregular shape.
  29. 29. 32  __________________Morphological Classification (Oocyte and Embryos).  Visualisation of the nucleus and the level of multinucleation.  The  presence  of  two  or  more  nuclei  or  of  micronuclei  in  a  cell  has  a  direct  correlation with an increase in the rate of chromosomal anomalies (Hardarson et al.,  2001). The presence of multinucleated blastomeres implies a low implantation rate  and  increases  the  rate  of  abortion,  although  children  have  been  born  from  multinucleated blastomeres  (Jackson  et  al.,  1998; Meriano et al., 2004; Pelinck et al.,  1998; V Royen et al., 2003); see image 35.  an Image 35. A, micronucleation; B, binucleation. The arrows indicate the positions of the nuclei.  Observation  of  the  nuclei  becomes  more  difficult  as  the  number  of  cells  or  the  fragmentation increases. In some cases the embryo will need to be rotated for us to  be able to evaluate multinucleation and single nucleation.  Acytoplasmic ring  This is characterized by the apparent contraction of the cytoplasm leaving a large  translucent  ring  with  no  organelles  close  to  the  edge  of  the  blastomere.  The  presence of an acytoplasmic ring in the embryo has been related to a process of  cellular lysis, see image 36. (V eeck, 1999b).  Image 36. Acytoplasmic ring (arrows)
  30. 30. Morphological Classification (Oocyte and Embryos).  33 The presence of vacuoles This is associated with a reduction in the developmental potential.  However there is no evidence in the literature relating the exact number of vacuoles, their size or distribution in the blastomeres, with implantation rates. Vacuoles with diameters of less than 5 μm may not compromise the development of the embryo (Veeck, 1999b); see image 37. Image 37. A, presence of large vacuoles; B, a vacuole of approximately 5 µm (arrow). Zona pellucida Abnormalities of the zona pellucida are associated with a low implantation rate due to the lack of hatching (Calderón et al., 2002; Gabrielsen  et  al.,  2001;  Ruiz  et  al., 1999;  Veeck,  1999b). A  healthy  zona  pellucida  may  be  described  as  having  a  round  silhouette  and  a thickness  of  approximately  17  μm,  in  addition  to  this  it  should  not  be homogeneous,  it  should  not  have  a  double  layer  due  to  the  partitioning  of  the inner zone, there should be no bulges and it should be translucent in appearance (Gabrielsen  et  al.,  2001;  Goyanes  et  al.,  1990;  Veeck,  1999b);  see images  38 and 39. Image 38. A, septated zona pellucida (arrow); B, non­circular zona pellucida; C, homogeneous zona pellucida, the thickness of the zona pellucida are similar.
  31. 31. 34  __________________Morphological Classification (Oocyte and Embryos).  Image 39. A, thick zona pellucida; B, dark zona pellucida.  In order to estimate the thickness of the zona pellucida we can take measurements  using  a  monitor  connected  to  an  inverted  microscope  and  a  ruler;  calibration  will  need to be performed first.  Level of early compaction/adhesion.  Early  compaction  is  a  sign  of  embryo  activation  which  involves  intercellular  contact,  the  formation  of  intercellular  bonds  and  the  start  of  embryonary  polarization  (Gardner,  1989;  Veeck,  1999c).  We  can  distinguish  between  two  levels of compaction; see image 40:  The initiation of adhesion: The stage at which the cells can be individually identified,  although the membranes are adjacent.  Compaction: The stage at which it is difficult to distinguish individual blastomeres.  Image 40. A, an embryo without evident signs of the initiation of cellular adhesion; B, an embryo with  signs of the initiation of cellular adhesion; C, a compacted embryo.
  32. 32. Morphological Classification (Oocyte and Embryos).  35 The  references  we  reviewed  did  not  provide  sufficient  evidence  to  allow  us  to include this parameter in an embryo classification system, possibly as it is highly influenced  by  the  culture  protocol  and  medium  used,  although  some recommendations  can  be  suggested  based  on  the  level  of  adhesion  and  the observation day (Desai  et al., 2000; Wiemer et al., 1996). Pitting. Similarly  to  cell  adhesion  the  appearance  of  this  morphological  parameter indicates  that  cytoplasmic  activation  has  taken  place  and  it  should  occur  at  the moment of physiological embryo activation at D+3. It appears as an orange peel effect  which  should  not  be  confused  with  extensive  vacuolization  (Desai  et  al., 2000; Wiemer et al., 1996); see image 41. Image 41. Embryo with pitting. 1.3.3 D+2 and D+3 stage parameters included in the classification system. In order to be able to decide which morphological parameters could be included in an  embryo  classification  system  we  looked  for  bibliographical  references  which confirmed  the  relationship  between  these  parameters  and  the  implantation  rate. Despite  the  fact  that  the  review  produced  very  variable  results,  some morphological  characteristics  have  a  clear relationship  with the  implantation rate and  can  be  included  in  the  classification  system.  Some  other  parameters  may also be used in proposing recommendation for embryo selection. Parameters included in the classification system : Cell number in transfer at D+2 according to the system shown.
  33. 33. 36  __________________Morphological Classification (Oocyte and Embryos).  Cell division rate in transfers at D+3 according to the system shown.  Cell fragmentation according to the following grading system, from best to worst  implantation rate:  ­  ≤10%  ­ 11 ­ 25%  ­ 26 ­ 35%  ­ >35% or presence of type IV fragmentation as per Alikani.  Blastomere asymmetry, from best to worst implantation rate:  ­ Equal or similar blastomeres.  ­ Uneven blastomeres with differences according to the Hardarson criteria.  Multinucleation, from best to worst implantation rate:  ­ Absence of multinucleated blastomeres.  ­ Presence of multinucleated blastomeres.  Acytoplasmic ring at D+3, from best to worst implantation rate:  ­ Absence of acytoplasmic ring.  ­ Presence of acytoplasmic ring.  Vacuoles, from best to worst implantation rate:  ­ Absence of vacuoles.  ­ Few vacuoles, diameters less than 5 μm.  ­ Abundant vacuoles.  Zona pellucida, from best to worst implantation rate:  ­ Normal zona pellucida.  ­ Abnormal zona pellucida  The significance of alterations in the zona pellucida can be reduced if there is  the possibility of performing an Assisted Hatching. It is possible that this  technique can increase the implantation rate (Calderón  et  al., 2002).  1.3.4 Recommendations.  We  recommend  the  use  of  some  of  the  following  parameters  to  make  a  more  refined selection between embryos with similar morphological quality.
  34. 34. Morphological Classification (Oocyte and Embryos).  37 Favourable: ­ If you do not see 2, 4, 8 or 16 cells during observation, there should be 2 different cell sizes corresponding to asynchronous division. ­ Presence of mononucleation in all cells (Moriwaki et al., 2004) ­ Initiation of adhesion as long as it appears at D+3 when the embryo has 7 or 8 cells. Evaluate according to culture protocol. ­ The presence of pitting at D+3. Unfavourable: ­ Very advanced compaction at D+3. Evaluate depending on culture protocol. ­  Initiation  of  adhesion  or  compaction  at  D+2.  Evaluate  depending  on  culture protocol. ­ 3 cells of the same size at D+2. 1.4  Morphological evaluation at the morula and blastocyst stages. D+4, D+5 and D+6. Transfer  during the  blastocyst  stage  is associated  with  higher  implantation  rates as  in  some  cases it can allow for  better  embryo  selection  (Gardner  et  al.,  2000). The embryo presents a complex structure at the blastocyst stage due to the large number of cells and their organization. Several authors have stated which are the key  parameters  for morphologically  optimal  blastocysts  and  which  correlate  with higher implantation rates (Balaban et  al.,  2000;  Dokras  et  al.,  1993;  Gardner  and Schoolcraft,  1999;  Racowsky  et  al.,  2003;  Richter  et  al.,  2001;  Shoukir  et  al., 1998). 1.4.1 Postinsemination observation intervals at D+4, D+5 and D+6. ­ D+4: 94­98 hours after insemination. ­ D+5: 112­120 hours after insemination. ­ D+6: 136­140 hours after insemination. 1.4.2 Parameters evaluated at the  D+4, D+5 and D+6  st age s . ­ Morula compaction. ­ Embryo development. Blastocyst organization. ­ Blastocoel expansion. ­ Zona pellucida. ­ Trophectoderm. ­ Inner cell mass. ­ Fragmentation. ­ Vacuolization.
  35. 35. 38  __________________Morphological Classification (Oocyte and Embryos).  Morula compaction  Cell compaction is usually presented in embryos at around D+4 of culture although it  initiates at around the 8 cell stage. Visually speaking it is characterized by the  appearance of a compacted mass of cells. This compaction is due to the tight bonds formed  between cells thus preventing to clearly distinguish their own shape. At this stage cells are no  longer totipotent, corresponding to an embryo which has already become  specialized. Therefore, the ability to see compaction at D+4 is a good prognosis for  development. Compaction will sometimes only affect some of the cells of the  embryo resulting in partial compaction.  Image 42. A, morula with partial compaction; B, morula with complete compaction.  At  present,  reported  evidences  do  not  allow  us  to  draw  conclusions  on  the  possible correlation between the type of compaction and the probability of embryo  implantation, although the latest studies have shown that partial compaction may  imply a lower chance of implantation.  When partial compaction occurs, the proportion of cells undergoing compaction will be  correlated to the size of the resulting embryo.  Embryos which are smaller than usual  have a lower chance of implantation (Tao et al., 2002).  Embryo development. Blastocyst organization  It is usually assumed that an embryo cultured in vitro reaches the blastocyst stage  at  D+5  or  D+6.  This  range  will  vary  depending  on  the  culture  system  used.  Embryos having a slower development rate may reach this stage at D+7 or even  D+8; this situation implies a worse prognosis (Khorram et al., 2000; Richter et al.,  2001;  Shapiro  et  al.,  2001). The  following  elements  in  the  blastocyst  should  be  taken into account (see image 43):
  36. 36. Morphological Classification (Oocyte and Embryos).  39 ­ Blastocoele. ­ Zona pellucida. ­ Inner cell mass. ­ Polar and mural trophectoderm. Image 43. Blastocyst morphology. Blastocoele expansion The increase in the size of the blastocoele is very difficult to categorize and is very time­dependent; especially due to the blastocoele collapse phases. If this event is observed, evaluation of the embryo should be postponed for several hours; this is a common phenomenon during the blastocyst stage and the morphology recovers after a short time lapse.  The blastocyst is able to expand considerably in only a few  hours,  this  will  result in  a  corresponding  thinning  of  the  zona  pellucida;  see images 44 and 45. Observing blastocoele expansion is associated with good implantation rates (Shoukir et al., 1998). Image 44. A, early blastocyst; B, expanding blastocyst; C, expanded blastocyst.
  37. 37. 40  __________________Morphological Classification (Oocyte and Embryos).  Image 45. A, Hatching blastocyst ; B, hatched blastocyst.  Zona pellucida  The  thickness  of  the  zona  pellucida  can  greatly  vary  during  blastocyst  development. It will become thinner with the blastocoele expansion, reaching the  minimum  thickness  when  the  blastocyst  is  completely  expanded  and  hatching  begins with the break of the zona pellucida. Some authors consider the thinning of  the zona pellucida to be a favourable factor for implantation (Balaban et  al.,  2000;  Racowsky et al., 2003; Y oon et al., 2001).  Trophectoderm  This structure presents a single layer of bonded cells which form the wall of the  blastocoele  or  blastocyst  cavity.  The  number,  shape  and  cohesion  degree  of  these cells will allow us to classify the blastocyst into several categories:  ­ Homogeneous epithelium with elliptical cells.  ­ Irregular epithelium.  ­ Irregular epithelium with few cells.  Blastocysts having a sub­optimal trophectoderm have good implantation rates as  long as the inner cell mass has normal morphology (Kovacic et al., 2004).  Inner cell mass (ICM).  This  is  the  most  important  parameter  for  defining  the  various  categories  of  blastocyst. The  inner  cell  mass  should  be  oval  in  shape  and  its  cells  should  be  compacted.  2  The most favourable size varies between 1,900 and 3,800 μm . Smaller sizes  2 imply a lower implantation potential (Richter et al., 2001). 3,800 μm 
  38. 38. Morphological Classification (Oocyte and Embryos).  41 is comparable to the size of a blastomere in a 4 cell stage embryo; see figure 4. Figure 4. Comparison of blastomere size according to the stage of development and the size of the inner cell mass. Fragmentation and vacuolization Both  parameters  indicate  the  start  of  apoptosis,  however  there  are  no  reported references directly relating them to implantation failures. Presence  of  vacuoles  and  fragmentation  are  incompatible  with  a  correct morphology of the blastocyst and those presenting these abnormalities should be assigned to the lowest category of embryo quality. 1.4.3 D+4, D+5 and D+6 stage parameters included in the classification system Parameters included in the classification system: Embryo development. Blastocyst organization, from best to worst implantation rate: ­ Blastocoele appearance at D+5. ­ Blastocoele appearance at D+6. ­ Blastocoele appearance at D+7 or D+8.
  39. 39. 42  __________________Morphological Classification (Oocyte and Embryos).  Presence of two or more blastocoele cavities is related to lower implantation rates.  Blastocoele expansion:  When the blastocyst is organized, the blastocoele occupies almost the whole  volume of the embryo. This parameter favourably correlates with the implantation  rate.  Zona pellucida, from best to worst implantation rate:  ­ Thinning appears at D+5.  ­ Thinning appears at D+6.  Trophectoderm, from best to worst implantation rate:  ­ Trophectoderm has homogeneous epithelium and elliptical cells.  ­ Trophectoderm has an irregular epithelium.  ­ Trophectoderm has an irregular epithelium with few cells.  Inner cell mass, from best to worst implantation rate:  2  ­ ICM sizes from1,900 – 3,800 μm  , with an oval compacted appearance.  2  ­ ICM size <1,900 μm , with a compacted non­oval appearance.  Fragmentation and vacuolization:  As described.  1.4.4 Recommendations.  We recommend the use of some of the following parameters to establish differences  between embryos of similar morphological quality.  Favourable:  ­ Compaction in the morula at D+4.  ­ Hatching signs.  Unfavourable:  ­ Appearance of the blastocoele at D+7 or even D+8.
  40. 40. Morphological Classification (Oocyte and Embryos).  43 2.  GRADING SYSTEM FOR EMBRYO QUALITY. The  various  observations  of  an  embryo  should  provide  relevant  information  to classify  it  and  to  assign  an  implantation  probability  which  will  help  us  to  reach conclusions with respect to transfer or freezing it. From  the  material  we  have  dealt  with  in  this  study  we  can  conclude  that  an embryo  should  not  be  evaluated  from  just  one  isolated  observation  taken  at  a particular  stage  of its development.  Categorization  should be  a  result  of several observations taken over the course of preimplantational development. Evaluating the  quality  of  an  embryo  at a  given moment  of  its  development  should  take  into account observations made at previous stages. We  have  not  included  observations  of  the  morphology  of  the  oocyte  and  the zygote  in  our  final  conclusions  due  to  a  lack  of  consensus  on  the  relevant characteristics influencing the quality of the embryo. For our grading system we have divided the expected implantation potential of the embryo into 4 categories: Category A: An embryo with optimal quality and the best implantation potential. Category B:  An embryo of good quality and a high implantation potential. Category  C:  An  acceptable  embryo  with  an  average  chance  of  implantation. Category D: A poor­quality embryo with a low chance of implantation. Assigning an embryo to a particular category will depend on the morphological parameters which we have previously described. This system is only suggested for the purposes of grading. The decision of what to do with an embryo of a certain category is left to the laboratory. In order to classify the embryo we suggest you use tables IV and V which are based on observations of the embryos between D+2 and D+6.
  41. 41. 44  __________________Morphological Classification (Oocyte and Embryos).
  42. 42. Morphological Classification (Oocyte and Embryos).  45 2.2 Grading embryo quality during transfers at D+5 and D+6. The morphology of the embryo at the blastocyst stage should not be considered by itself as we have already mentioned for the D+3 stage. The final classification should  depend  on  the  observations  made  over  the  course  of  development. Observations of the embryo must be made within the time frames indicated in the text; see table VI.
  43. 43. 46  __________________Morphological Classification (Oocyte and Embryos).  2.3 Grading systems proposed for day­to­day work.  .  Option 1. For transfers at D+2 and D+3.
  44. 44. Morphological Classification (Oocyte and Embryos).  47 Option 2. For transfers at D+2.
  45. 45. 48  __________________Morphological Classification (Oocyte and Embryos).  Option 2. For transfers at D+3.
  46. 46. Morphological Classification (Oocyte and Embryos).  49 2.4 Controversies over the grading system. Some  of  the  parameters  reported  in  the  literature  could  be  compared  with  the partial analysis of the survey undertaken for IVF clinics. Other parameters could not be evaluated due to the disparity of the results between clinics. Others are still controversial with the evaluations reported in the literature; see table VII. Table VII. Controversials over the grading system. 3. GENERAL RECOMMENDATIONS ­ Participate in external quality control programs which include the morphological evaluation of embryos. ­  Ensure  that  there  is  a  low  variability  between  laboratories  either  by  using  an internal quality control system which includes embryo quality and/or by limiting the number of people dealing with this aspect. ­  Use  image  capture  and  storage  systems  which,  as  well  as  facilitating  internal control,  allow  embryos to be  evaluated  later  on  without  spending too much time out of the incubator. ­ In case that better embryo classification is needed, we recommend you opt for transferring at D+3 and that you respect the established observation times. ­ Use the category evaluation system described in this book although it is still open to correction.
  47. 47. 50  __________________Morphological Classification (Oocyte and Embryos).  REFERENCES  Alikani M, Cohen J.  Patterns of cell fragmentation in the human embryo. J  Assist Reprod  Genet, 1995;12:28S.  Alikani  M,  Calderón  G,  Tomkin  G,  Garrisi  J,  Kokot M,  Cohen  J.  Cleavage  anomalies  in  early human embryos and survival after prolonged culture in­vitro. Hum Reprod  2000;15:2634­2643.  Balaban  B,  Urman  B,  Sertac  A,  Alatas  C,  Aksoy  S,  Mercan  R.  Oocyte  morphology does  not  affect  fertilization rate,  embryo  quality  and  implantation rate  after  intracytoplasmic  sperm  injection. Hum  Reprod  1998;13:3431­3433.  Balaban B,  Urman  B,  Sertac  A,  Alatas  C,  Aksoy S,  Mercan  R.  Blastocyst  quality  affects  the success  of  blastocyst­stage  embryo transfer.  Fertil Steril  2000;74:282­287.  Balaban B,  Urman B. Effect of oocyte morphology on embryo development and  implantation. Reprod Biomed  Online 2006;12:608­615.  Balaban B, Yakin K, Urman B. Randomized comparison of two different blastocyst  grading  systems.  Fertil Steril  2006;85:559­563.  Carceller  Beltrán  R,  Sáenz  Moreno  I,  Gracia  Cervero  E,  Bassecourt  Serra  M,  Ureña  Hornos  T,  García­Dihinx  Villanova  J,  et  al.  Carta  al Editor.  Triploidía  completa  69XX Y.  An Pediatr (Barc)  2004;61:562­564.  Bruna  Catalán  I,  Pérez  Milán  F,  Tur  Padró  R,  Ricciarelli  E,  De  la  Fuente Hernández  A,  Monzó Miralles A, et al. Embarazo  múltiple derivado de FIV­ICSI en España: incidencia  y criterios sobre  la  transferencia embrionaria.  Rev  Iberoam  Fertilidad 2005;22:99­110.
  48. 48. Morphological Classification (Oocyte and Embryos).  51 Calderón  G,  Prados  N,  Caligara  C,  Mantrana  E,  Navarro  J,  Pellicer  A,  et  al.  Calidad embrionaria.  Indicadores  predictivos  de  vitalidad.  En:  Remohí  J,  Pellicer A, Simón  C, Navarro  J,  editors. Reproducción Humana  2º  ed.  Madrid: McGraw­Hill  Interamericana; 2002. p. 463­468. Ciotti PM, Notarangelo L, Morselli­Labate AM, Felleti V, Porcu E, Venturoli S. First polar body  morphology  before  ICSI  is not  related  to  embryo  quality or  pregnancy  rate.  Hum Reprod  2004;19:2334­2339. Ciray HN,  Karagenc  L, Ulug U,  Bener  F,  Bahçeci  M.  Use  of  both  early cleavage  and day 2  mononucleation  to  predict  embryos  with  high  implantation  potential  in intracytoplasmic  sperm  injection cycles.  Fertil Steril  2005;84:1411­1416. Ciray  HN,  Karagenc  L, Ulug  U,  Bener  F,  Bahçeci  M.  Early cleavage  morphology  affects the quality  and  implantation potential of day 3  embryos.  Fertil Steril  2006;85:358­365. Chen  C,  Kattera  S.  Comparison  of  pronuclear  zygote  morphology  and  early  cleavage status of  zygotes  as  additional criteria  in the selection  of  day 3  embryos:  a  randomized study.  Fertil Steril  2006;85:347­352. Desai  NN,  Goldstein  J,  Rowland  DY, Goldfarb  JM.  Morphological  evaluation of  human embryos and derivation of an embryo quality scoring system specific for day 3 embryos: a  preliminary study. Hum  Reprod  2000;15:2190­2196. De  Placido  G,  Wilding  M, Strina I,  Alviggi  E,  Alviggi  C,  Mollo  A,  et  al.  High  outcome predictability  after  IVF using  a  combined  score  for  zygote  and  embryo  morphology and growth rate.  Hum  Reprod  2002;17:2402­2409. De  Sutter  P,  Dozortsev D, Qian  C,  Dhont M.  Oocyte morphology does  not correlate  with fertilization  rate  and  embryo  quality  after  intracytoplasmic  sperm  injection.  Hum Reprod  1996;11:595­597.
  49. 49. 52  __________________Morphological Classification (Oocyte and Embryos).  Dokras  A,  Sargent  IL,  Barlow  DH.  Human  blastocyst  grading:  an  indicator  of  developmental potential?  Hum  Reprod  1993;8:2119­2127.  Ebner T, Moser M, Yaman C, Feichtinger O, Hartl J,  Tews G. Elective transfer of embryos  selected  on the  basis  of first polar body  morphology is  associated  with increased  rates  of implantation  and pregnanc y.  Fertil Steril  1999;72:599­603.  Ebner T, Yaman C,  Moser  M, Sommergruber  M,  Feichtinger O, Tews G.  Prognostic v alue  of  first  polar  body  morphology  on  fertilization  rate  and  embryo  quality  in  intracytoplasmic  sperm  injection. Hum  Reprod  2000;15:427­430.  Ebner T,  Moser M, Sommergruber M, Yaman C, Pfleger U, Tews G. First polar body  morphology and blastocyst formation rate in ICSI patients. Hum Reprod 2002;17:2415­2418.  El  Shafie  M,  Sousa  M, Windt  ML,  Kruger  TF.  An  atlas  of  the  ultrastructure of  human  oocytes. A guide for assisted  reproduction. New  York: The Parthenon  Publishing Group  Inc.;  2000.  Fisch  JD,  Rodriguez H,  Ross  R,  Overby G,  Sher  G.  The Graduated Embryo  Score (GES)  predicts  blastocyst  formation  and  pregnancy  rate  from  cleavage­stage  embryos.  Hum  Reprod  2001;16:1970­1975.  Gabrielsen A, Lindenberg S, Petersen K. The impact of the zona pellucida thicknes variation  of human embryos on pregnancy outcome in relation to suboptimal embryo development.  A prospective randomized controlled study. Hum Reprod 2001;16:2166­2170.  Gardner  RL.  Cell allocation  and lineage  in the early mouse embryo.  Ciba Found Symp  1989;144:172­181;  discussion  181­186, 208­211.  Gardner  RL,  Schoolcraft  W B.  In  vitro  culture  of  human  blastocysts.  En:  Cansen  R,  Mortimer  D  editors.  Toward  reproductive  certainty:  fertility  and  genetics  beyond.  Carnforth: The Parthenon  Publishing Group Inc.;  1999. p. 378­388.
  50. 50. Morphological Classification (Oocyte and Embryos).  53 Gardner  DK,  Lane  M,  Stevens  J,  Schlenker  T,  Schoolcraft W B. Blastocyst  score  affects implantation  and pregnancy outcome:  towards a  single blastocyst transfer.  Fertil Steril 2000;73:1155­1158. Gardner  DK,  Lane  M,  Stevens  J,  Schoolcraft  W B.  Noninvasive  assessment  of  human embryo  nutrient consumption  as  a  measure  of  developmental  potential. Fertil Steril 2001;76:1175­1180. Goyanes  VJ,  Ron­Corzo  A,  Costas  E,  Maneiro  E.  Morphometric  categorization  of  the human  oocyte and  early conceptus.  Hum  Reprod  1990;5:613­618. Haggarty  P,  Wood  M,  Ferguson  E,  Hoad  G,  Srikantharajah  A,  Milne  E,  et  al.  Fatty acid metabolism  in human  preimplantation  embryos. Hum  Reprod  2006;21:766­773. Hamamah S. Oocyte and embryo quality: is their morphology a good criterion? J  Gynecol Obstet Biol  Reprod  2005;34(7  Pt 2):5S38­5S41. Hardarson  T,  Hanson  C,  Sjögren  A,  Lundin  K.  Human  embryos  with  unevenly  sized blastomeres  have  lower  pregnancy and  implantation  rates:  indications for aneuploidy and  multinucleation. Hum  Reprod  2001;16:313­318. Hartshorne  G,  Montgomery  S,  Klentzeris L.  A  case  of failed  oocyte  maturation in  vivo and  in vitro. Fertil Steril  1999;71:567­570. Hassan­Ali  H,  Hisham­Saleh  A,  El­Gezeiry  D,  Baghdady  I,  Ismaeil  I,  Mandelbaum  J. Perivitelline  space  granularity:  a  sign  of  human  menopausal  gonadotrophin  overdose in intracytoplasmic  sperm  injection. Hum  Reprod  1998;13:3425­3430. Hnida  C,  Engenheiro  E,  Ziebe  S.  Computer­controlled,  multilevel,  morphometric analysis of blastomere size as  biomarker of fragmentation and  multinuclearity in human embryos.  Hum  Reprod  2004;19:288­293.
  51. 51. 54  __________________Morphological Classification (Oocyte and Embryos).  Jackson  KV, Ginsburg ES, Hornstein MD, Rein MS, Clarke RN. Multinucleation in  normally  fertilized  embryos  is  associated  with  an  accelerated  ovulation  induction  response  and  lower implantation  and  pregnancy  rates  in in  vitro  fertilization­embryo  transfer cycles.  Fertil Steril  1998;70:60­66.  Kahraman  S,  Yakin  K,  Dönmez  E,  Samli  H,  Bahçe  M,  Cengiz  G,  et  al.  Relationship  between  granular  c ytoplas m  of  oocytes  and  pregnancy  outcome  following  intracytoplasmic  sperm  injection. Hum  Reprod  2000;15:2390­2393.  Khorram O, Shapiro SS, Jones JM. Transfer of nonassisted hatched and hatching human  blastocysts after  in vitro fertilization. Fertil Steril  2000;74:163­165.  Kovacic B, Vlaisavljevic V, Reljic M, Cizek­Sajko M. Developmental capacity of different  morphological  types  of  day 5  human  morulae  and blastocysts. Reprod Biomed  Online  2004;8:687­694.  Leese  HJ.  Metabolic control during preimplantation  mammalian  development.  Hum.  Reprod Update  1995;1:63­72.  Leese HJ, Conaghan  J,  Martin KL, Hardy K. Early human embryo metabolism. Bioessays  1993;15:259­264.  Loutradis  D,  Drakakis  P,  Kallianidis K, Milingos  S,  Dendrinos  S,  Michalas  S.  Oocyte  morphology  correlates  with  embryo  quality  and  pregnancy  rate  after  intracytoplasmic  sperm  injection. Fertil Steril  1999;72:240­244.  Lundin K, Bergh C,  Hardarson  T.  Early embryo cleavage  is a  strong indicator of embryo  quality  in human  IV F.  Hum  Reprod  2001;16:2652­2657.  Mikkelsen AL, Lindenberg S. Morphology of in­vitro matured  oocytes: impact on  fertility potential  and embryo  quality. Hum  Reprod  2001;16:1714­1718.
  52. 52. Morphological Classification (Oocyte and Embryos).  55 Meriano  JS,  Alexis  J,  Visram­Zaver  S,  Cruz  M,  Casper  R F.  Tracking  of  oocyte dysmorphisms  for  ICSI  patients  may  prove  relevant  to  the  outcome  in  subsequent patient cycles. Hum  Reprod  2001;16:2118­2123. Meriano J,  Clark C, Cadesky K, Laskin CA. Binucleated and micronucleated blastomeres in embryos  derived from  human  assisted  reproduction  cycles.  Reprod  Biomed  Online 2004;9:511­520. Moriwaki T, Suganuma  N, Hayakawa  M,  Hibi  H, Katsumata Y, Oguchi H,  et  al. Embryo evaluation by analysing blastomere  nuclei. Hum Reprod  2004;19:152­156. Munne S,  Wells D. Preimplantation genetic diagnosis. Curr Opin Obstet Gynecol 2002;14:239­244. Nayudu  PL, Gook  DA, Hepworth  G,  Lopata  A,  Johnston  WI. Prediction of  outcome  in human  in vitro fertilization based  on follicular and  stimulation response  variables.  Fertil Steril  1989;51:117­125. Neuber  E,  Rinaudo  P,  Trimarchi  JR,  Sakkas  D.  Sequential  assessment  of  individually cultured  human  embryos  as  an  indicator  of  subsequent  good  quality  blastocyst development.  Hum  Reprod  2003;18:1307­1312. Otsuki  J,  Okada  A, Morimoto K, Nagai Y, Kubo H. The  relationship  between pregnanc y outcome  and  smooth  endoplasmic  reticulum  clusters  in  MII  human  oocytes.  Hum Reprod  2004;19:1591­1597. Payne  D,  Flaherty  SP,  Barry M F,  Matthews  CD.  Preliminary  observations  on  polar  body extrusion  and  pronuclear  formation  in  human  oocytes  using  time­lapse  video cinematography. Hum  Reprod  1997;12:532­541. Pelinck MJ, De Vos M, Dekens M, Van der Elst J,  De  Sutter P Dhont M. Embryos cultured in  ,vitro with multinucleated blastomeres have poor implantation potential in human in­vitro
  53. 53. 56  __________________Morphological Classification (Oocyte and Embryos).  fertilization and intracytoplasmic sperm injection. Hum Reprod 1998;13:960­963.  Racowsky C,  Combelles CM,  Nureddin A,  Pan  Y, Finn A, Miles L,  et  al. Day 3  and day  5 morphological predictors of embryo viability. Reprod Biomed Online 2003;6:323­331.  Richter  KS,  Harris  DC,  Daneshmand  ST,  Shapiro  BS.  Quantitative  grading  of  a  human  blastocyst:  optimal inner cell  mass  size  and  shape.  Fertil Steril 2001; 76:1157­1167.  Rienzi  L, Ubaldi  F,  Iacobelli M,  Romano  S,  Minasi  MG,  Ferrero  S,  et  al.  Significance  of  morphological attributes of the early embryo. Reprod Biomed  Online 2005;10:669­681.  Ruiz  A,  Herrer  R,  Romero  JLl,  de  los  Santos  MJ,  Pellicer  A,  Remohí  J.  Calidad  y  transferencia  embrionarias.  En:  Remohí  J,  Romero  JL,  Pellicer  A, Simón  C,  Navarro  J,  editors. Manual Práctico  de Esterilidad y  Reproducción Humana.  Madrid: McGraw­Hill  Interamericana  de  España;  2000. p.  231­237.  Salumets A, Hydén­Granskog C, Suikkari AM, Tiitinen A, Tuuri T. The predictive v alue  of pronuclear  morphology of zygotes  in the assessment of human embryo  quality. Hum  Reprod  2001;16: 2177­2181.  Salumets  A,  Hydén­Granskog  C,  Mäkinen  S,  Suikkari AM,  Tiitinen  A, Tuuri  T.  Early  cleavage  predicts  the  viability  of  human  embryos  in  elective  single  embryo  transfer  procedures.  Hum  Reprod  2003;18:821­825.  Scott  L. Predicting Embryo Development. En:  Rabe  T,  Dietrich K, Strowitzki T,  editors.  Manual  on Assisted Reproduction. Springer;  2000. p. 321­338.  Scott  L.  The  biological  basis  of non­invasive  strategies  for  selection  of  human  oocytes  and embryos.  Hum Reprod Update  2003;9:237­249.  Serhal PF, Ranieri DM, Kinis A, Marchant S, Davies M, Kadhum IM. Oocyte morphology  predicts outcome of intracytoplasmic sperm injection. Hum Reprod 1997;12:1267­1270.
  54. 54. Morphological Classification (Oocyte and Embryos).  57 Shapiro  BS,  Richter KS,  Harris  DC,  Daneshmand  ST.  A  comparison  of  day 5  and day 6 blastocyst transfers.  Fertil Steril 2001;75:1126­1130. Shoukir Y,  Campana  A,  Farley  T,  Sakkas  D. Early cleavage  of in­vitro  fertilized  human embryos  to  the  2­cell  stage:  a  novel  indicator  of  embryo  quality  and  viability.  Hum Reprod  1997;12:1531­1536. Shoukir Y,  Chardonnens D,  Campana  A,  Bischof  P,  Sakkas  D. The  rate  of  development and time of transfer  play different roles in influencing the vi ability of human blastocysts. Hum Reprod  1998;13: 676­681. Steer  CV,  Mills CL,  Tan  SL,  Campbell  S,  Edwards  RG.  The  cumulative  embryo  score:  a predictive embryo scoring technique  to select  the  optimal  number  of embryos to transfer in  an  in­vitro  fertilization  and  embryo  transfer  programme.  Hum  Reprod  1992;7:117­ 119. Suzuki K, Yoshimoto  N,  Shimoda  K,  Sakamoto  W,  Ide  Y,  Kaneko  T,  et  al.  Cytoplasmic dysmorphisms in metaphase II chimpanzee oocytes. Reprod Biomed Online 2004;9:54­58. Tao  J,  Tamis R,  Fink K, Williams B, Nelson­W hite T, Craig R. The neglected morula/compact  stage  embryo transfer. Hum  Reprod  2002;17:1513­1518. Tarin JJ,  Pellicer A. Oocyte maturation in human in vitro fertilisation programmes. Ann Acad  Med Singapore 1992;21:492­497. Tesarik  J,  Greco  E.  The  probability of  abnormal  preimplantation  development  can  be predicted  by  a  single static observation  on  pronuclear  stage  morphology.  Hum  Reprod 1999;14:1318­1323. Van  Blerkom  J.  Occurrence  and  developmental  consequences  of  aberrant  cellular organization  in  meiotically  mature  human  oocytes  after  exogenous  ovarian hyperstimulation. J  Electron  Microsc Tech 1990;16:324­346.
  55. 55. PUBLISHED BY: EXECUTIVE BOARD  Mark Grossmann Mª  Victoria  Hurtado de Mendoza  Nieves Cremades  Manuel Ardoy  Mª  José  de los Santos  Begoña Arán  Jorge Cuadros  Fernando Marina  Jorge Ten  Montserrat Boada  María Bonada  Antonio Urries With the collaboration of:

×