29th April 2011FOCUS ON HOMOCYSTEINE	      2nd international congress	  
OPENING CEREMONY	  Pr J.L. Touraine • Premier adjoint au Maire de Lyon          J.L. Durousset • PDG de Noalys            ...
REEVALUATION OF OXYDATIFSTRESS ANALYSIS IN THE MALE     Réevaluation de l’analyse du stress oxydatif chez l’homme         ...
A re-evaluation of Tuneland other sperm DNA intergrity tests                        Dr EvensonRé-évaluation du test de Tun...
SPERM CHROMATIN STRUCTURE ASSAY            SCSA®     Donald P. Evenson, Ph.D, HCLDPresident and Director, SCSA Diagnostics...
In the beginning…..Evenson, D.P., Darzynkiewicz,Z. and Melamed, M.R. (1980)Relation of mammalian spermchromatin heterogene...
SCIENCE - first observations on  sperm DNA fragmentation in situ            (DFI)(1980)DFI= 2X higher for infertile couple...
SCSA Samples (1980-2011)•    Mice        Whales      More than•    Rats        Dolphins      100,000•    Bulls       Goril...
Etiology of Sperm      DNA FragmentationPathology             Environmental•  Cancer             •  Chemotherapy•  Varicoc...
SCSA® ProtocolFresh or Frozen raw semen, thawed in a 37oC water         bath and diluted with TNE buffer      30 sec --Aci...
100	                SCSA® - Acridine             Orange Stained DNA     0	                  100	  
Native vs. Fragmented DNA Cytograms             Fragmented sperm                   High DNA Stainable              populat...
SCSA® Parameters derived from SCSAsoft®                                         red fluorescence          DFI             ...
Clinical Results of the SCSA®Native DNA Stainability                             Low level (HDS) High DNA                 ...
Clinical Results of the SCSA®Native DNA Stainability                                                           Total DNA S...
SCSA Cytogram with Sorting Gates     Norm       Green                       HDS                       Mod DFI             ...
Feulgen Analysis                                             High                                             DFIHDS      ...
Comet AssayEmbed sperm in agarose on a microscope slide and lyse.           Remove nucleoproteins and RNA           relax ...
% Comets by Sorted SCSA Population             % Comets by Sorted SCSA Population           100            80% Comets     ...
CMA3 and HDS•  n= 182 men % HDS vs %DFI (r=0.038 P = 0.61) % HDS vs %CMA3 (r=0.61, P < 0.0001)
Effects of Fever               Pre-fever             18                25               33Native DNA                     3...
% DFI
Impossible dafficher limage. Votre ordinateur manque peut-être de mémoire pour ouvrir limage ou limage est endommagée. Red...

     Animal fertility– bullHeterospermic Competitive Index
                           %DFI
Boar Fertility and SCSA Values              FR	        APB	             -­‐0.60a	      -­‐0.59a	            	             ...
Repeatability of SCSA measures of human sperm           DNA/Chromatin Structure   1                         Samples	  from...
Effect of X-ray (mouse testes)                                 measure epididymal sperm +40 days                          ...
1st	  in	  vivo	  study	  of	  sperm	  DNA	  fragmenta7on	  and	   pregnancy	  outcome.	  (Georgetown.	  M.	  Zinaman	  PI...
 Results from a Meta-analysis* 	  Fertilization               Patient Meta-analysisProcedure                   number OR 3...
A recent study by Giwercman et alsuggested that the SCSA® %DFIthreshold for reduced fecundity appearsto be at 20%.
SCSA predicts the outcome of ART       998 ART cycles (387 IUI, 388 IVF, 223 ICSI)                                      2 ...
TESE overcome ICSI failure with high % DFI?•  Werthman et al Abstract PCRS meeting 2010•  38 couples: 1 – 7 failed ICSI cy...
SCSA® Data vs. Classical Semen Parameters (correlation coefficients)• 	  %	  Live	  (-­‐	  0.22)	  • 	  Counts	  (-­‐	  0....
Acridine      TdT--Fluorochromeorange (AO)              Base -- TUNEL--SCSA
% DFI vs % TUNEL positive
TUNEL VS. SCSA®•  Advantages of SCSA•  Small AO molecule in equilibrium with chromatin providing   precision biochemical r...

    

Sperm Chromatin structure assay                    E. Baldi  Évaluation de la qualité de la chromatine du sperme
A re-evaluation of Tunel and other DNA integrity tests            Elisabetta Baldi            Monica Muratori    Unità di ...
Why it is important to study sperm     integrity of genetic material•  Marker of sperm quality•  Which consequences of spe...
Main types of damage to genetic      material found in spermGenetic damage               Other damage that can be-  Mutati...
IMPACT ON REPRODUCTION Although oocyte has some ability to repairsperm DNA damage, this ability depends notonly on the ext...
Consequence of sperm DNA        fragmentation on reproduction•  Increased fragmentation is associated with  –  a lower ach...
Sperm DNA Fragmentation (SDF)                          Total DNA fragmentation                   	          Presence	   of...
Techniques to evaluate SDF                Sperm Chromatin Structure AssaySCSA	                        (TdT)-mediated fluor...
SCSA                            Sperm Chromatin Structure Assay      •  cytofluorimetry      •  results expressed as perce...
COMET                  o SCGE, Single Cell Gel Electrophoresis•  Sperm inclusion in agarose gel, lysis and electrophoresis...
TUNELterminal deoxynucleotidyl transferase–mediated      fluorescein–dUTP nick end labeling • evaluated by fluorescence mi...
TUNELSTEPS                   VARIANTS                            REFERENCESLack of standardization of the procedures      ...
TUNELSTEPS                              VARIANTS                                           REFERENCES Lack of standardizat...
Effect of the different TUNEL variants                                 Effect of:                 CV%                     ...
Effect of PFAC: 1 immediately after fixation , 2 24 h after fixation in 4% PFAD: 1 fresh sample, 2 24 h after fixation in ...
Effect of data analysisSB: subtraction methodTS: treshold setting method
Data analysis with SB method may resultsin loss of correlation with semen quality
M540 Bodies: apoptotic bodies of testis origin?                                  Staining              Propidium Iodide,  ...
M450 bodies in subfertile subjects                                                                       %	  M540	  bodies...
M540 Bodies interfere with cytofluorimetric                  analysis of spermMuratori et al, 2004 ; Marchiani et al, 2007...
TUNEL/PI allows M450 bodies            subtraction      Controllo negativo          Campione testPI              Frammenta...
SIMPLE TUNEL versus TUNEL/PI                       Simple TUNEL                       underestimates                      ...
TUNEL/PI REVEALS THE OCCURRENCE OF TWO          DIFFERENT SPERM POPULATION                                BRIGHTER        ...
OXIDATIVE STRESS AND MALE INFERTILITY
Oxidative stressCocuzza et al, 2007                               Base adducts
2-­‐DEOXYGUANOSINE	  	     8-­‐HYDROXY-­‐DEOXYGUANOSINE	  	  	                           (8-­‐OHdG)	                      ...
Two main methods to evaluate 8-OH-dG levels IMMUNOFLUORESCENCE	        OxyDNA	  TEST	    using a specific                 ...
Two main methods to evaluate 8-OH-dG levels                                              OxyDNA	  TEST	        IMMUNOFLUOR...
Two main methods to evaluate 8-OH-dG levels                           IMMUNOFLUORESCENCE	  PI	  fluorescence	              ...
Two main methods to evaluate 8-OH-dG levels                                          Pre-­‐adsorption	  with	  8-­‐hydroxy...
Two main methods to evaluate 8-OH-dG levels         Pre-­‐adsorption	  with	  8-­‐hydroxy-­‐guanosine:	  Anti-­‐8-­‐hydrox...
POSITIVE	  CONTROL	  %8-­‐OHdG   -­‐H2O2	                   +H2O2	                            n	  =	  11	  
The percentage of sperm exhibiting 8-OH-dG in the ejaculate                                                   Pa7ent	  1	 ...
Only live sperm show 8-OH-dG              L23+	  	  	  8OH-­‐	                  L23+	  	  	  8OH+	  %8-­‐OHdG             ...
CORRELATIONS BETWEEN 8-OH-dG (%) and                                             STANDARD SEMEN PARAMETERS                ...
CORRELATIONS BETWEEN 8-OH-dG (%) and                                                         STANDARD SEMEN PARAMETERS    ...
CORRELATIONS BETWEEN 8-OH-dG (%) and STANDARD SEMEN                   PARAMETERS                                          ...
Comet may reveal oxidative damage and DNA           fragmentation in the same assay      = 8-hydroxy, 2 deoxy guanosine   ...
Oxidative damage and DNA fragmenation in the same assay   better discriminate between fertile and infertile couplesFPG
Lara           Marta                                   Tamburrino        Cambi                                       Chiar...
HOMOCYSTEINE         Homocystéine                        Chairpersons : Dr K. ELDER                                       ...
Novel classification   for human SpermatozoaIndications and consequences          Dr. N.G. Cassuto Altérations du Spermato...
 	  Human	  spermatozoa	  altera7ons	  	                 	  Indica7ons	  and	  Consequences	  Nino Guy Cassuto André Hazou...
Dogma	  •  Biologists had long time assumed that sperm is just a carrier of  fathers genes to oocyte•  The idea was that t...
The	  secret	  life	  of	  sperm	                     Ainsworth Claire Nature 2005 	  •  Sperm contains almost 3000 differ...
 	  	     SPERM	  	  PARAMETERS	  	  	  Male	  fer7lity	  cant	  be	  inves7gated	  just	  by	  the	  	  	  sperm	  parame...
Sperm	  DNA	  damage	  	  •  During	  spermatogenesis	     –  Chroma7n	  compac7on:	  	  Histones	  	  	  	  	  	  	  	  	...
 	  	  	  SPERMATOGENESIS	  Quality	  control	  of	  the	  ChromaBn:	  EpigeneBc	  informaBon	  Chromosomes:	  GeneBc	  in...
Histone	  ModificaBons	  •  DNA	  compac7on	  around	  histones	  nucleus	  and	  no	  histones	     is	  variable	  on	  t...
Sperm	  DNA	  damage	  •  During	  spermatogenesis	      –  Chroma7n	  compac7on:	  	  Histones	  	  	  	  	  	  	  	  	  ...
Chromosomal abnormalities                         and spermatogenesis       Number Abnormalities              Structure Ab...
Sperm shape and Genetic status	Abnormal morphology sperm increase the risk of aneuploidyand diploidy	  Some	  head	  abnom...
Aim of our first study	      Correlation between normalcy of the sperm;       fertilization and early embryo developmentWhi...
 	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  SCORE	  	  0	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	...
HVB morphology criteria      and embryo development	Spermatozoon	  S=0	     Embryo	  arrested	  at	  Day	  4	  
 Film	  3
 	  	  HVB Score	  	  •  Logistic regression was used for fertilization as the   dependant variable of motile sperm•  Coef...
 	  	  	  	  	  Scored	  Intra	  Cytoplasmic	  Sperm	  InjecBon:	  SICSI	  
Sperm	  DNA	  damage	  •  During	  spermatogenesis	     –  Chroma7n	  compac7on:	  	  Histones	  	  	  	  	  	  	  	  	  P...
Toxics	  factors	  •  Pollu7on	  •  Pes7cides:	  Organochlorines	  and	  Phosphores	  •  Solvants	  Paint	  and	  Plas7cs;...
100	               TUNEL:	  Terminal	  Uridine	  Nick	  	  	  	  	  End	  	               Labeling	       0	              ...
Morphology test and scoring test	Sperm	  morphology	  	  through	  Kruger	  or	  David	  classifica7on	  is	             no...
Score 0 and fertilization rate in IVF	            120            100            80            FR           60            4...
r -0.261        Score 0 and fertilization rate in IVF	 120 100 80 FR60 40 20 0                  20                40      ...
First Questions ???	•  Why score 0 does not give us blastocyst ?•  Which abnormality could be select by score 0 ?•  We com...
Material and Methods	Which	  head	  abnormality	  we	  selected	  in	  score	  0	  ?	  	             	  	   	   	  Aneuplo...
18	                18	              Х	                 Х	  Х	                 Х	             18	                18	  
Ejaculate	  sperm	                                                                         n=26	   Density	  Gradient	  	 ...
Score	  0	  	  	  	  Ecart	  Type	                 TMS	  	  	  	  	  	  	  Ecart	  Type	                          p	  Chro...
Conclusion I	•  Score	  0,	  with	  an	  abnormal	  chroma7n	  compac7on,	     must	  be	  discarded	  ………..No	  blastocys...
Second Questions ???	  Can	  we	  select	  a	  spermatozoon	  with	  a	  normal	  	                                   	   ...
 	  	  	  	  Spermatozoa	  selected	  at	  high	  magnificaBon	  X6100	                                                    ...
Results	  	  	  	  No	  correlaBon	  between	  the	  sperm	  head	  morphology	  at	  	                                   ...
Conclusion II 	•  No correlation with FISH•  No correlation with DNA Fragmentation•  Positive correlation with chromatin d...
Morphology test and scoring test		       You	  can	  think	  globaly:	  Sperm	  	  	         But	  you	  must	  act	  loca...
Sperm	  DNA	  damage	  •  During	  spermatogenesis	     –  Chroma7n	  compac7on:	  	  Histones	  	  	  	  	  	  	  	  	  	...
Genomic	  imprin7ng	                                    	  The	  imprin7ng	  is	  a	  chemical	  process	  through	  methy...
INTRODUCTION	  Many	  arBcle	  showed	  birth	  defects	  prevalence	  in	  ICSI	  and	  IVF	  compared	  with	  spontaneo...
AIM	  OF	  THE	  STUDY	  To	  determine	  whether	  the	  IMSI	  with	  microinjecBon	  of	  	  morphologically	  normal	 ...
PATIENTS	  Inclusion	  criteria	  	  :	  	  ♦	  Woman	  under	  39	  years	  ♦	  Singletons,	  twins	  and	  triplet	  pre...
AGE	  	  DISTRIBUTION	                                                                                                    ...
LogisBc	  regression	  of	  Age	  and	  techniques	                     with	  mother’s	  age	  39	  -­‐ 	  Age	  father	 ...
LogisBc	  regression	  of	  techniques	  with	  mother’s	  age	  	  39)	                               IVF / ICSI / IMSI  ...
23	                                         600	                                                                          ...
SECONDARY	  OBJECTIVE	  OF	  STUDY	  	  	  To	  compare	  low	  weight	  birth	  and	  the	  risk	  of	  preterm	  deliver...
DistribuBon	  of	  birth	  weight	  using	  the	  technique	                                                              ...
 	  	  	  	  	  	  	  	  	  Preterm	  and	  Technique	                                    40	  GestaBonal	  age,	  weeks	 ...
IVF	                                                                      IMSI	                                           ...
Results	  Increased	  risk	  of	  preterm	  delivery	  for	  pregnancies	  awer	  IVF	  and	  ICSI	  than	  awer	  IMSI	  ...
 	  	  	  	  THE	  	  SPERMATOZOON	  	  IS	  	  ONLY	  	                           A	  	  VEHICLE	  	  CELL	  	  !!!!	  
Thanks	Jean Michel PLOUCHART	Sonia JELLAD	Pierre VANDERZWALMEN	Karine MEDRANO	Farida KOURTAA	Baya OMAIS	Richard BALET	Lion...
Homocysteineand miscarriages      Pr JC. GrisHomocystéine et fausses couches
      Homocysteine	  	            and	  	        Miscarriages	                         	  Prof.	  Jean-­‐Christophe	  Gris...
•  General	  concerns/defini7ons                               	  •  Epidemiology	  •  Experimental	  data	  •  Therapeu7c	...
CONCERNS/DEFINITIONS	  MISCARRIAGES:	  A	  SYNDROME,	  NOT	  AN	  ILLNESS…	  STRONG	  HETEROGENEITY	  
Miscarriages…	       or	  clinically-­‐relevant	  loss	  subtypes?	                                                       ...
Miscarriages…	       or	  clinically-­‐relevant	  loss	  subtypes?	                                                       ...
                                                     Heterogeneity:	                                                a	  ma...
                                                           Heterogeneity:	                                                ...
1-­‐	  Gesta7onal	  ages	                   PL	  categories:	  Farquharson	  RG	  et	  al.,	  Hum	  Reprod	  2005	  •  Bio...
PL	  categories:	  Farquharson	  RG	  et	  al.,	  Hum	  Reprod	  2005	  •  Early	  PL	      –  Typically	  between	  weeks...
PL	  categories:	  Farquharson	  RG	  et	  al.,	  Hum	  Reprod	  2005	  •  Late	  PL	  (fœtal)	      –  Typically	  from	 ...
PL	  categories:	  Farquharson	  RG	  et	  al.,	  Hum	  Reprod	  2005	  •  SBllbirth	     – Death	  of	  a	  viable	  fœtu...
2-­‐	  Number:	  of	  PL,	  of	  children	  •  Sporadic	  vs.	  Recurrent	  PL	      –  Ini7ally:	  3	  or	  more.	      –...
3-­‐	  Explained	  vs.	  «	  idiopathic	  »	  PL	  	  •  Recommenda7ons	  for	  the	  tes7ng	  of	  couples	      –  Diver...
CONCERNS/DEFINITIONS	  HYPERHOMOCYSTEINAEMIA:	  JANUS	  	     	     	     	     	     	    	   	  STRONG	  HETEROGENEITY	  
*	                             Methyl groups:                               DNA,                            Histones,…    ...
HCY metabolism:Relevance of enzymatic polymorphisms / variants? MTHFR	   	  C677T	              	  A1298C	                ...
So:	                       	                   really	  	    Hyperhomocysteinaemia	            as	  a	  whole,	           ...
HCY	  during	  normal	  pregnancy	  •  Lower	  tHCY	  plasma	  concentra7ons	           •  But	  higher	  in	  1st	  T	  t...
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Focus on Homocysteine

2nd international congress

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Présentation congrès 2011

  1. 1. 29th April 2011FOCUS ON HOMOCYSTEINE   2nd international congress  
  2. 2. OPENING CEREMONY  Pr J.L. Touraine • Premier adjoint au Maire de Lyon J.L. Durousset • PDG de Noalys Dr M. Cohen • Procrelys
  3. 3. REEVALUATION OF OXYDATIFSTRESS ANALYSIS IN THE MALE Réevaluation de l’analyse du stress oxydatif chez l’homme Chairpersons : Pr P. MERVIEL Dr S. BELLOC
  4. 4. A re-evaluation of Tuneland other sperm DNA intergrity tests Dr EvensonRé-évaluation du test de Tunel et des autres tests d’intégrité de l’ADN
  5. 5. SPERM CHROMATIN STRUCTURE ASSAY SCSA® Donald P. Evenson, Ph.D, HCLDPresident and Director, SCSA Diagnostics www.scsatest.com Distinguished Professor, Emeritus South Dakota State UniversityAdjunct Professor, Sanford Medical School Dept. of OB/GYN University of SD
  6. 6. In the beginning…..Evenson, D.P., Darzynkiewicz,Z. and Melamed, M.R. (1980)Relation of mammalian spermchromatin heterogeneity tofertility. Science240:1131-1133..
  7. 7. SCIENCE - first observations on sperm DNA fragmentation in situ (DFI)(1980)DFI= 2X higher for infertile couples thanfertile menDFI = 3X higher for sub/infertile bullsDFI = significant increase in sperm DNAfragmentation from Zn+ deficient mice
  8. 8. SCSA Samples (1980-2011)•  Mice Whales More than•  Rats Dolphins 100,000•  Bulls Gorillas sperm•  Stallions Monkeys samples•  Boars Rabbits•  Rams Fowl & FishHUMANS >30,000
  9. 9. Etiology of Sperm DNA FragmentationPathology Environmental•  Cancer •  Chemotherapy•  Varicocele •  Radiation•  Fever •  Prescription Rx•  Age •  Air pollution•  Leukocytospermia •  Pesticides•  Genotype (GST) •  Chemicals•  Zinc deficiency •  Heat
  10. 10. SCSA® ProtocolFresh or Frozen raw semen, thawed in a 37oC water bath and diluted with TNE buffer 30 sec --Acid (pH 1.20) denaturation of DNA at sites of strand breaks AO staining of ss (red) & ds (green) DNA Measure 5,000 sperm by flow cytometry
  11. 11. 100   SCSA® - Acridine Orange Stained DNA 0   100  
  12. 12. Native vs. Fragmented DNA Cytograms Fragmented sperm High DNA Stainable population (%DFI) population (%HDS) %HDSNative DNA Native DNA %DFI Fragmented DNA Fragmented DNA
  13. 13. SCSA® Parameters derived from SCSAsoft® red fluorescence DFI =(DNA Fragmentation Index) total (red + green) fluorescence X DFI = mean of DFI population (1-1024 units) SD DFI = standard deviation of DFI population %DFI = % cells outside main sperm population Moderate DFI and High DFI %HDS = % cells with High DNA Stainability (5,000 SPERM/ SAMPLE X DUPLICATE MEASUREMENTS)
  14. 14. Clinical Results of the SCSA®Native DNA Stainability Low level (HDS) High DNA Total DNA Stainability Stainability Total Moderate level Moderate High High level Fragmented DNA DNA Fragmentation Index DNA Fragmentation Index Patient Date Measurement X DFI SD DFI DFI (%) HDS (%) 7272-87 #### 1 213.5 111.6 6.8 5.0 2 221.2 118.1 8.3 5.4 mean 217.4 114.8 7.5 5.2 sd 5.4 4.6 1.1 0.2
  15. 15. Clinical Results of the SCSA®Native DNA Stainability Total DNA Stainability Low level (HDS) High DNA Stainability Total Moderate level Moderate High High level Fragmented DNA DNA Fragmentation Index DNA Fragmentation Index Patient Date Measurement X DFI SD DFI DFI (%) HDS (%) 7272-113 #### 1 563.7 307.0 64.9 6.4 2 561.4 304.8 64.9 7.2 mean 562.6 305.9 64.9 6.8 sd 1.2 1.1 0.0 0.4
  16. 16. SCSA Cytogram with Sorting Gates Norm Green HDS Mod DFI High DFI Debris Red
  17. 17. Feulgen Analysis High DFIHDS Norm Increasing Decreasing Roundness and Roundness and Intensity Area Mod DFI
  18. 18. Comet AssayEmbed sperm in agarose on a microscope slide and lyse. Remove nucleoproteins and RNA relax DNA loop domainsElectrophorese, stain with YOYO-1 and digitallyarchive with image analysis software. Normal Sperm Abnormal Sperm (COMET)
  19. 19. % Comets by Sorted SCSA Population % Comets by Sorted SCSA Population 100 80% Comets 60 40 20 0 Normal HDS DFI SCSA Population
  20. 20. CMA3 and HDS•  n= 182 men % HDS vs %DFI (r=0.038 P = 0.61) % HDS vs %CMA3 (r=0.61, P < 0.0001)
  21. 21. Effects of Fever Pre-fever 18 25 33Native DNA 39 46 53 66 Fragmented DNA Evenson DP, Jost LK, Corzett M, Balhorn R. Characteristics of human sperm chromatin structure following an episode of influenza and high fever: a case study. J Androl. 2000;739-746.
  22. 22. % DFI
  23. 23. Impossible dafficher limage. Votre ordinateur manque peut-être de mémoire pour ouvrir limage ou limage est endommagée. Redémarrez lordinateur, puis ouvrez ànouveau le fichier. Si le x rouge est toujours affiché, vous devrez peut-être supprimer limage avant de la réinsérer.
  24. 24. 
 Animal fertility– bullHeterospermic Competitive Index
 %DFI
  25. 25. Boar Fertility and SCSA Values FR   APB   -­‐0.60a   -­‐0.59a       -­‐0.68b   -­‐0.55c  
  26. 26. Repeatability of SCSA measures of human sperm DNA/Chromatin Structure 1 Samples  from  4  Individuals  for  8   ConsecuBve    Months   2        Extremely  high  repeatability  of     3  AO/chromaBn    biochemistry   4  and  SCSA®  data    over  Bme     5        Note  consistent,  unique          cytogram  paNerns  from    month   6  to  month  in  individuals   7      Evenson,  D.,  Jost,  L.,  Baer,  R.,  Turner,  T.  and    Schrader,  S.  (1991).  ReproducBve  Toxicology      5:115-­‐125.   8    
  27. 27. Effect of X-ray (mouse testes) measure epididymal sperm +40 days 120 ∗∗ ∗∗ 100 SD DFI ∗∗ 80%DFI  &  SD  DFI     ∗∗ 60 ∗∗ ∗∗ 40 ∗ ∗∗ ∗∗ 20 DFI ∗ 0 0 100 200 300 400 RadiaBon  Dose  (rads)   Sailer  et  al,  1995  
  28. 28. 1st  in  vivo  study  of  sperm  DNA  fragmenta7on  and   pregnancy  outcome.  (Georgetown.  M.  Zinaman  PI)        Pregnancy Outcome n Xαt SDαt DFI HDS PG in 3 months 73 234.6 137.9 11.2 8.95 PG 4-12 months 40 255.1** 157.9** 15.5** 8.78 No Pregnancy 31 270.3*** 173.7*** 17.2*** 15.03*****p<0.01; ***p<0.001 Evenson  et  al,  1999    Hum  Reprod  
  29. 29.  Results from a Meta-analysis*  Fertilization Patient Meta-analysisProcedure number OR 30%DFIIn vivo 358 7.0a(no known infertility problems) IUI 518 7.3aRoutine IVF 521 ~2.0bIVF/ICSI 322 1.7 a p=0.0001 b p=0.02 Evenson D, Wixon R (2006) Meta-analysis of Sperm DNA Fragmentation using the Sperm Chromatin Structure Assay. Reproductive Medicine 12: 466-472
  30. 30. A recent study by Giwercman et alsuggested that the SCSA® %DFIthreshold for reduced fecundity appearsto be at 20%.
  31. 31. SCSA predicts the outcome of ART 998 ART cycles (387 IUI, 388 IVF, 223 ICSI) 2 OR for pregnancy IUI 1 0 10 15 20 25 30 35 40 Cut-off for DFI •  87 men with DFI >27% 4 pregnancies •  300 men with DFI <27% 75 pregnancies•  DFI can be used as an independent predictor of fertility in couples undergoing IUI Bungum  M,  Humaidan  P,  Axmon  A,  Spano  M,  Bungum  L,   Erenpreiss  J  and  Giwercman  A.  (2007)  Sperm  DNA  integrity   assessment  in  predic7on  of  assisted  reproduc7on  technology   outcome.  Hum  Reprod.  Jan;22(1):174-­‐9  
  32. 32. TESE overcome ICSI failure with high % DFI?•  Werthman et al Abstract PCRS meeting 2010•  38 couples: 1 – 7 failed ICSI cycles•  TESE: PG rate of 62.5% –  83% PG rate with SCSA® > 65% DFI –  75% PG rate in couples with >4 failed IVF cycles. –  Thus, there is utility for the SCSA® for those patients that have had several ICSI failures. –  As noted by D.Carrell, those patients that had two or more failed ICSI cycles, the %DFI by TUNEL was about 4 higher X than with sperm donors.
  33. 33. SCSA® Data vs. Classical Semen Parameters (correlation coefficients)•   %  Live  (-­‐  0.22)  •   Counts  (-­‐  0.16)  •   %  Normal  morphology  (0.30)  •   %  MoBle  (0.43)   Suggests  SCSA®  is  an  independent  parameter    
  34. 34. Acridine TdT--Fluorochromeorange (AO) Base -- TUNEL--SCSA
  35. 35. % DFI vs % TUNEL positive
  36. 36. TUNEL VS. SCSA®•  Advantages of SCSA•  Small AO molecule in equilibrium with chromatin providing precision biochemical reaction between AO and DNA (<2% CV) in contrast to use of large enzymes and antibodies•  1024 channels of TWO dimensional X (red) and Y (green) More accurate gating of + and – cells via histogram of DFI (red/ red + green fluoresence) Measure fresh sample immediately after collection SCSA – 5 min vs. TUNEL –4 hrs multiple steps•  Avoid commercial variation of Tunel kit TdT enzyme•  Avoid gating out sperm with nuclear vacuoles by FCM light scatter parameters•  Measure DNA integrity AND Chromatin structure (histones/ protamine ratio= immature/abnormal)•  Reagents for SCSA: < 10 ¢ / sample
  37. 37. 
 

  38. 38. Sperm Chromatin structure assay E. Baldi Évaluation de la qualité de la chromatine du sperme
  39. 39. A re-evaluation of Tunel and other DNA integrity tests Elisabetta Baldi Monica Muratori Unità di Andrologia, Università di Firenze EAA Andrology Center, Center of Excellence De Nothe
  40. 40. Why it is important to study sperm integrity of genetic material•  Marker of sperm quality•  Which consequences of sperm DNA decay for offspring and future generations?•  What induces the damage?•  Which damage is more relevant for reproduction?
  41. 41. Main types of damage to genetic material found in spermGenetic damage Other damage that can be-  Mutations transmitted to the-  Deletions progeny-  DNA strand breaks -  Epigenetic damage (DNA methylation, histone-  base oxidation acetylation tec)-  Chromosome aberrations -  extent of protamination (aneuploidies) -  Status of sulfhydril groups -  Significance of sperm RNA (and miRNA) Association between genetic or epigenetic damage and fertility or outcome of progeny
  42. 42. IMPACT ON REPRODUCTION Although oocyte has some ability to repairsperm DNA damage, this ability depends notonly on the extension of damage but also on its quality (single or double strand breaks, nucleotides modification) Oocyte quality
  43. 43. Consequence of sperm DNA fragmentation on reproduction•  Increased fragmentation is associated with –  a lower achievement of natural pregnancy (Evenson and Wixon, 2008) –  IUI: poor pregnancy rate (Bungum et al, 2007) –  Fertilization IVF: discussed, contradictory results –  Fertilization ICSI: no effect –  Embryo development: good evidence for impairment (animal studies) –  Implantation/pregnancy rate: discussed, contradictory results –  Pregnancy loss: good evidence
  44. 44. Sperm DNA Fragmentation (SDF) Total DNA fragmentation   Presence   of single *p<0.001   double DNA strand and 70 breaks is common in the ejaculate 60   50   40 Affects     a high percentage of spermatozoa 30 20   10 Relevant   in infertile/subfertile men 0 PATIENTS FERTILE MEN n=39 n=38
  45. 45. Techniques to evaluate SDF Sperm Chromatin Structure AssaySCSA   (TdT)-mediated fluorescein-dUTP nick end labeling TUNEL   In Situ Nick Translation ISNT   Single Cell Gel Electrophoresis assay COMET   Acridine Orange Test AO  Test   Sperm Chromatin Dispersion Test SCD  test   (Halosperm)   Do they reveal the same type of damage? Are results comparable? Are all standardized?
  46. 46. SCSA Sperm Chromatin Structure Assay •  cytofluorimetry •  results expressed as percentage of DNA fragmented sperm Acridine OrangeGreen fluorescence = denatured DNA DFI= total DNAnative DNA DFI Red fluorescence = denatured DNA
  47. 47. COMET o SCGE, Single Cell Gel Electrophoresis•  Sperm inclusion in agarose gel, lysis and electrophoresisin high salt conditions•  fluorescence Microscopy•  high sensitivity (50 single-strand breaks per cell)•  results as percentage of damaged cells and measure of the damage in a single cells Fragmented sperm non fragmented sperm ? Electrophoresis time ? ? Neutral vs alkaline conditions ?
  48. 48. TUNELterminal deoxynucleotidyl transferase–mediated fluorescein–dUTP nick end labeling • evaluated by fluorescence microscopy and cytofluorimetry • results expressed as percentage of DNA fragmented sperm DNA Fragmentation
  49. 49. TUNELSTEPS VARIANTS REFERENCESLack of standardization of the procedures Fresh Muratori et al. 2000; Sergerie et al. 2005; Greco et al. 2005; Chohan et al. 2006; Smith et al. 2006; Domínguez-Fandos et al. 2008; Varum et al. 2007; Piasecka et al. 2007; Zhang et al. 2008; Cohen-Bacrie et al. 2009 Frozen Bian et al. 2004; Xia et al. 2005; Sepaniak et al. 2006; Stronati et al. 2006; LongSAMPLE At -20°C, -70°C, -80°C et al. 2007; OFlaherty et al. 2008 Cryopreserved Ramos et al. 2008; Avendaño et al. 2009a; Pecou et al. 2009 With or without cryoprotectant Alcohols Muciaccia et al. 2007; OFlaherty et al. 2008; Cohen-Bacrie et al. 2009; Tunc et al. 2008; Martin et al. 2005 EtOH, MeOH, MeOH-EtOHFIXATION Formaldeyde Muratori et al. 2003; Caglar et al. 2007; Tarozzi et al. 2009; Domínguez-Fandos et al. 2008; Young et al. 2003; Avendaño et al. 2009a and 2009b; Stronati et al. At 1; 2; 3.5; 3.7% 2006; Ramos et a. 2008; Tesarik et al. 2004 Absent Martin et al. 2005; OFlaherty et al. 2008; Young et al. 2003; Said et al. 2006PERMEABILIZATION Presentwith detergents 0.1; 1; 0.5 and 2% Triton X at different Chohan et al. 2006; Aoki et al. 2006; Caglar et al. 2007; Varum et al. 2007; Muratori et al. 2008a and 2009; Tunc et al. 2008; Frydman et al. 2008; Avendaño et al. 2009a and 2009b times Direct labeling OFlaherty et al. 2008; Zhang et al. 2008; Aoki et al. 2006; Torregrosa et al. 2006; Young et al. 2003; Muratori et al. 2008a;.Greco et al. 2005; Paasch et al. Many commercial kits 2004; Brugnon et al. 2006; Donelly et al. 2000LABELLING Indirect labeling Varum et al. 2007; Sargerie et al. 2005; Piasecka et al. 2007; Younglai et al. 2001; Frydman et al. 2008; Muciaccia et al. 2007; Long et al. 2007; Martin et al. Many commercial kits 2005; Zini et al. 2001 Chohan et al. 2006; R. Smith et al. 2006; Tesarik et al. 2004; Borini et al. 2006; Fluorescence microscopy Young et al, 2003; Avendaño et al. 2009a and 2009b; Smith et al. 2006; Tunc et al. 2008; Caglar et al. 2007DETECTION Muratori et al. 2008a, Sepaniak 2006; Frydman et al. 2008; Martin et al. 2005; Flow cytometry Sergerie et al. 2005; Varum et al. 2007; Stronati et al. 2006; Ramos et al. 2008; Younglai et al. 2001; OFlaherty et al. 2008 Threshold setting method Cohen-Bacrie P 2009; Muratori et al. 2000 and 2008a; Domínguez-Fandos DFLOW CYTOMETRY 2008; Zhang et al. 2008DATA ANALYSIS Subtraction method Shen et al. 2000; Sergerie et al. 2005; Frydman et al. 2008; Pecou et al. 2009 Muratori et al, SBRM 2010
  50. 50. TUNELSTEPS VARIANTS REFERENCES Lack of standardization of the procedures Fresh Muratori et al. 2000; Sergerie et al. 2005; Greco et al. 2005; Chohan et al. 2006; Smith et al. 2006; Domínguez-Fandos et al. 2008; Varum et al. 2007; Piasecka et al. 2007; Zhang et al. 2008; Cohen-Bacrie et al. 2009 Frozen Bian et al. 2004; Xia et al. 2005; Sepaniak et al. 2006; Stronati et al. 2006; LongSAMPLE At -20°C, -70°C, -80°C et al. 2007; OFlaherty et al. 2008 Cryopreserved Ramos et al. 2008; Avendaño et al. 2009a; Pecou et al. 2009 With or without cryoprotectant Alcohols Muciaccia et al. 2007; OFlaherty et al. 2008; Cohen-Bacrie et al. 2009; Tunc et al. 2008; Martin et al. 2005 EtOH, MeOH, MeOH-EtOHFIXATION Papers Formaldeyde from 2000-2009, Tunels SDF in i subfertile Muratori et al. 2003; Caglar et al. 2007; Tarozzi et al. 2009; Domínguez-Fandos et al. 2008; Young et al. 2003; Avendaño et al. 2009a and 2009b; Stronati et al. At 1; 2; 3.5; 3.7% 2006; Ramos et a. 2008; Tesarik et al. 2004 subjects Absent Martin et al. 2005; OFlaherty et al. 2008; Young et al. 2003; Said et al. 2006PERMEABILIZATION Presentwith detergents Chohan et al. 2006; Aoki et al. 2006; Caglar et al. 2007; Varum et al. 2007; 2.36±1.37%, n=29 0.1; 1; 0.5 and 2% Triton X at 39.82 ± 23.75%, n=66 Tunc et al. 2008; Frydman et al. 2008; different Muratori et al. 2009a and 2009b Avendaño et al. 2008a and 2009; times Younglai et al, 2001 Domínguez-Fandos D et al, 2007 Direct labeling OFlaherty et al. 2008; Zhang et al. 2008; Aoki et al. 2006; Torregrosa et al. 2006; Young et al. 2003; Muratori et al. 2008a;.Greco et al. 2005; Paasch et al. Many commercial kits 2004; Brugnon et al. 2006; Donelly et al. 2000LABELLING Indirect labeling Varum et al. 2007; Sargerie et al. 2005; Piasecka et al. 2007; Younglai et al. 2001; Frydman et al. 2008; Muciaccia et al. 2007; Long et al. 2007; Martin et al. Many commercial kits 2005; Zini et al. 2001 Chohan et al. 2006; R. Smith et al. 2006; Tesarik et al. 2004; Borini et al. 2006; Fluorescence microscopy Young et al, 2003; Avendaño et al. 2009a and 2009b; Smith et al. 2006; Tunc et al. 2008; Caglar et al. 2007DETECTION Muratori et al. 2008a, Sepaniak 2006; Frydman et al. 2008; Martin et al. 2005; Flow cytometry Sergerie et al. 2005; Varum et al. 2007; Stronati et al. 2006; Ramos et al. 2008; Younglai et al. 2001; OFlaherty et al. 2008 Threshold setting method Cohen-Bacrie P 2009; Muratori et al. 2000 and 2008a; Domínguez-Fandos DFLOW CYTOMETRY 2008; Zhang et al. 2008DATA ANALYSIS Subtraction method Shen et al. 2000; Sergerie et al. 2005; Frydman et al. 2008; Pecou et al. 2009 Muratori et al, SBRM 2010
  51. 51. Effect of the different TUNEL variants Effect of: CV% PFA concentration 15.1±11.2 (1% vs 3.7%) Time storage 22.7±11.2 (0 vs 24 h) Labelling kit 26.0±16.0 (TMR vs FITC) Intra-assay CV=4.3±1.4%, n=12 Data analysis 21.2±16.4 Muratori et al, J Androl, 2010
  52. 52. Effect of PFAC: 1 immediately after fixation , 2 24 h after fixation in 4% PFAD: 1 fresh sample, 2 24 h after fixation in 4% PFA
  53. 53. Effect of data analysisSB: subtraction methodTS: treshold setting method
  54. 54. Data analysis with SB method may resultsin loss of correlation with semen quality
  55. 55. M540 Bodies: apoptotic bodies of testis origin? Staining Propidium Iodide, Bright field PI May-Grunwald Giemsa    Muratori et al, 2004 ; Marchiani et al, 2007
  56. 56. M450 bodies in subfertile subjects %  M540  bodies  sul  totale  dei  bodies  e  spermatozoi     %  M540  bodies  vs  sperm   N=Normozoospermic, AT= Asthenotheratozoospermic T=Theratozoospermic, OAT=OligoasthenotheratozoospermicMuratori et al, 2004 ; Marchiani et al, 2007
  57. 57. M540 Bodies interfere with cytofluorimetric analysis of spermMuratori et al, 2004 ; Marchiani et al, 2007; Muratori et al, SYBR 2010
  58. 58. TUNEL/PI allows M450 bodies subtraction Controllo negativo Campione testPI Frammentazione del DNA Frammentazione del DNA Muratori et al, 2008
  59. 59. SIMPLE TUNEL versus TUNEL/PI Simple TUNEL underestimates Simple TUNEL -­‐50   -­‐40   -­‐30   -­‐20   -­‐10   0   10   overerestimatesPercentuale ricavata dal semplice TUNEL meno percentuale ricavata dal TUNEL/PI Muratori et al, Hum Reprod 2008 Muratori et al, Cytometry A, 2008
  60. 60. TUNEL/PI REVEALS THE OCCURRENCE OF TWO DIFFERENT SPERM POPULATION BRIGHTER 50   45   40   *p<0.00001   35   30   25   20   15   10   5   0   Pibr population is only partially fragmented and do not correlate with semen quality DIMMERPI     32     30   28   26 NS   24   Pidim population is 100% DNA 22   20   18   16 fragmented, DNA fragmentation in the   14     PIdim sperm is related to bad quality of 12 10 8 6     semen analysis whereas it is unrelated in 4     the PIbr sperm 2 0 PATIENTS FERTILE MEN TUNEL n=39 n=38 (Muratori  et  al,  2008)  
  61. 61. OXIDATIVE STRESS AND MALE INFERTILITY
  62. 62. Oxidative stressCocuzza et al, 2007 Base adducts
  63. 63. 2-­‐DEOXYGUANOSINE     8-­‐HYDROXY-­‐DEOXYGUANOSINE       (8-­‐OHdG)    
  64. 64. Two main methods to evaluate 8-OH-dG levels IMMUNOFLUORESCENCE   OxyDNA  TEST   using a specific a commercial kit antibody anti-8OHdG with a binding protein* and a secondary conjugated to FITC antibody conjugated to FITC *unknown
  65. 65. Two main methods to evaluate 8-OH-dG levels OxyDNA  TEST   IMMUNOFLUORESCENCE   Bright  field   8-­‐OHdG   PI   PI   8-­‐OHdG   Bright     field  
  66. 66. Two main methods to evaluate 8-OH-dG levels IMMUNOFLUORESCENCE  PI  fluorescence   Isotype   Test   Pre-­‐adsorbed   control   sample   Ab   Green  fluorescence  of  8-­‐OHdG   OxyDNA  TEST  PI  fluorescence   Binding   Pre-­‐adsorbed   Autofluorescence   protein   protein   Green  fluorescence  of  Binding  protein  
  67. 67. Two main methods to evaluate 8-OH-dG levels Pre-­‐adsorption  with  8-­‐hydroxy-­‐guanosine:  OxyDNA  Test 100 n.s.  p=0.26 90 80 86.37+/-­‐7.49 77.97+/-­‐16.48 n=5 70 n=5 Oxidative  stress  (%) 60 50 40 30 20 10 0 Basal  level Pre-­‐adsorbed
  68. 68. Two main methods to evaluate 8-OH-dG levels Pre-­‐adsorption  with  8-­‐hydroxy-­‐guanosine:  Anti-­‐8-­‐hydroxy-­‐guanosine 20 15 Oxidative  stress  (%) More specific 10 8.95+/-­‐6.99,  n=5 5 *  p<0.05 1.62+/-­‐1.1,  n=5 0 Basal  level Pre-­‐adsorbed
  69. 69. POSITIVE  CONTROL  %8-­‐OHdG -­‐H2O2   +H2O2   n  =  11  
  70. 70. The percentage of sperm exhibiting 8-OH-dG in the ejaculate Pa7ent  1   Oxidative stress marker (8-OHdG) Mean±SD= 10,6±7,6% PIbrighter Range= n=98   Pa7ent  2   1,03÷36,09% PIdimmer Mean= <1% Only PIbrighter exibits 8-OH-dG !!!
  71. 71. Only live sperm show 8-OH-dG L23+      8OH-­‐   L23+      8OH+  %8-­‐OHdG L23101  
  72. 72. CORRELATIONS BETWEEN 8-OH-dG (%) and STANDARD SEMEN PARAMETERS CONCENTRATION   250 r  =-­‐0,2   p<0,05  (number  of  sperm  x106/ml)   200 NUMBER   Sperm  concentraBon     150 Y Axis Title 100 r  =-­‐0,2   Number  of    sperm  (x106/ejaculate)   1000 p<0,04   50 800 0 600 Y Axis Title 0 5 10 15 20 25 30 35 40   X Axis Title %8-­‐OHdG   400 200 0 n=98   0 5 10 15 20 25 30 35 40 %8-­‐OHdG   X Axis Title
  73. 73. CORRELATIONS BETWEEN 8-OH-dG (%) and STANDARD SEMEN PARAMETERS TOTAL  MOTILITY   800 r  =-­‐0,2  Number  of  Total  moBle  sperm   700 p<0,04   600 (x106/ejaculate)   500 Y Axis Title 400 PROGRESSIVE  MOTILITY     300 200 100 800 r  =-­‐0,2   Number  of  Progressive  moBle  sperm   0 700 p<0,03   -100 600 0 10 20 30 40 X Axis Title 500 %8-­‐OHdG   (x106/ejaculate)   Y Axis Title 400 300   200 100 n=98   0 -100 0 10 20 30 40 %8-­‐OHdG   X Axis Title
  74. 74. CORRELATIONS BETWEEN 8-OH-dG (%) and STANDARD SEMEN PARAMETERS MORPHOLOGY   Number  of  sperm  with  normal   250 r  =  -­‐0,3   p  <  0,02   (x106/ejaculate)   200 morphology   150 Y Axis Title   100 50 0 0 10 20 30 40 X Axis Title %8-­‐OHdG  
  75. 75. Comet may reveal oxidative damage and DNA fragmentation in the same assay = 8-hydroxy, 2 deoxy guanosine (8-OHdG)Formamidopyrimidine-DNA Glycosylase =FPG COMET Simon et al, 2010
  76. 76. Oxidative damage and DNA fragmenation in the same assay better discriminate between fertile and infertile couplesFPG
  77. 77. Lara Marta Tamburrino Cambi Chiara AzzariMonica Muratori Sara Marchiani Biagio Olivito Dipartimento di PediatriaErminio FilimbertiSelene Degl’Innocenti
  78. 78. HOMOCYSTEINE Homocystéine Chairpersons : Dr K. ELDER Dr A. HAZOUT
  79. 79. Novel classification for human SpermatozoaIndications and consequences Dr. N.G. Cassuto Altérations du Spermatozoide et ses Conséquences
  80. 80.    Human  spermatozoa  altera7ons      Indica7ons  and  Consequences  Nino Guy Cassuto André Hazout Unité AMP Drouot Paris
  81. 81. Dogma  •  Biologists had long time assumed that sperm is just a carrier of fathers genes to oocyte•  The idea was that the oocyte is supplying everything (protein and mRNA) and spermatozoa were just coming with its DNA Krawetz Just  a  vehicle  cell,  but  so  many  failures  in   ICSI  !!!!!  
  82. 82. The  secret  life  of  sperm   Ainsworth Claire Nature 2005  •  Sperm contains almost 3000 different kinds of mRNA –  Coding for proteins needed for early embryo development –  The others are still unknown and have no equivalent in the oocyte
  83. 83.       SPERM    PARAMETERS      Male  fer7lity  cant  be  inves7gated  just  by  the      sperm  parameters  Today  it’s  necessary  to  explore  the  func7onal      capacity  of  the  spermatozoa  and  its  DNA  
  84. 84. Sperm  DNA  damage    •  During  spermatogenesis   –  Chroma7n  compac7on:    Histones                    Protamines   –  Quan7ta7ve  or  qualita7ve  chromosomal  abnormali7es  •  By  reac7ve  oxygen  species  (ROS)   –  Infec7ons  ,Inflammatory  reac7on   –  Tobacco   –  Pollu7on    •  Consequences  
  85. 85.        SPERMATOGENESIS  Quality  control  of  the  ChromaBn:  EpigeneBc  informaBon  Chromosomes:  GeneBc  informaBon                                                                                                                                                                                                  APOPTOSIS      AND        R  O  S                                                                      DNA  FragmentaBon                                                              ChromaBn  DecondensaBon                                                                              Abnormal  maturity  of    DNA  +  PROTAMINES                                                  DNA  fragmentaBon  and  SCD  tests                                                                          
  86. 86. Histone  ModificaBons  •  DNA  compac7on  around  histones  nucleus  and  no  histones   is  variable  on  the  chromosome  and  chroma7n  •  Condensa7on  by  modifica7ons  of  N-­‐terminal  of  histones   like  phosphoryla7ons,  acetyla7ons,  methyla7ons….  
  87. 87. Sperm  DNA  damage  •  During  spermatogenesis   –  Chroma7n  compac7on:    Histones                  Protamines   –  Quan7ta7ve  or  qualita7ve  chromosomal   abnormali7es  •  By  reac7ve  oxygen  species  (ROS)     –  Infec7ons,  Inflammatory  reac7on     –  Tobacco     –  Pollu7on    •  Consequences  
  88. 88. Chromosomal abnormalities and spermatogenesis Number Abnormalities Structure AbnormalitiesKlinefelter Robertsonian Chromosomal InversionsSyndrome Translocation Markers XXY Double Y Reciprocal Turner X0 Translocation
  89. 89. Sperm shape and Genetic status Abnormal morphology sperm increase the risk of aneuploidyand diploidy  Some  head  abnomaliBes  and  aneuploïdies  .  Lee  HR1996      Macrocephalic  increase  aneuploïdies  .  Kahraman  HR  1999;    Yakin  HR  2001    CorrelaBon  between  Teratosperm  and  FISH.  Bernardini  HR  1998      In  OTAS  and  OTS  aneuploïdies  increase  .  FS  1999  Colombero;    Calogero  HR  2001;    Rubio  HR  2001;  Viville  HR  2000;  Templado  Mol  Rep  Dev  2002          
  90. 90. Aim of our first study Correlation between normalcy of the sperm; fertilization and early embryo developmentWhich  sperm  defects  affect  this  development  ???      
  91. 91.                                                    SCORE    0                                    Head  +  Vacuole  +  Base  
  92. 92. HVB morphology criteria and embryo development Spermatozoon  S=0   Embryo  arrested  at  Day  4  
  93. 93.  Film  3
  94. 94.      HVB Score    •  Logistic regression was used for fertilization as the dependant variable of motile sperm•  Coefficients were calculated and tested by comparing ROC curves: Best area give the formula: Head x2 + Vacuole x3 + Base x1 = 6
  95. 95.            Scored  Intra  Cytoplasmic  Sperm  InjecBon:  SICSI  
  96. 96. Sperm  DNA  damage  •  During  spermatogenesis   –  Chroma7n  compac7on:    Histones                  Protamines   –  Quan7ta7ve  or  qualita7ve  chromosomal  abnormali7es  •  By  reac7ve  oxygen  reac7on  species  (ROS)   –  Infec7ons,  Inflammatory  reac7on   –  Tobacco     –  Pollu7on    •  Consequences  
  97. 97. Toxics  factors  •  Pollu7on  •  Pes7cides:  Organochlorines  and  Phosphores  •  Solvants  Paint  and  Plas7cs;  Phtalates  •  Tobacco        
  98. 98. 100   TUNEL:  Terminal  Uridine  Nick          End     Labeling   0   100  
  99. 99. Morphology test and scoring test Sperm  morphology    through  Kruger  or  David  classifica7on  is   not  so  precise  regarding  the  scoring  test   Which  correlaBon  between  them???    NONE  !!!     A  new  approach  to  perform  sperm  morphology    
  100. 100. Score 0 and fertilization rate in IVF 120 100 80 FR 60 40 20 0 0 1 Score  0   CLASIII.44N= 217 IVF Variable FR , Factor Score 0 = 45%Score 0 = 45% n Mean SD Median Min Max 45% 198 77.62 24.49 83 0 125 45% 19 54.58 33.59 60 0 100 Kruskal-Wallis chi-squared = 9.63 p= 0.0019
  101. 101. r -0.261 Score 0 and fertilization rate in IVF 120 100 80 FR60 40 20 0 20 40 60 80 SCORE  0   CLASIII.10
  102. 102. First Questions ??? •  Why score 0 does not give us blastocyst ?•  Which abnormality could be select by score 0 ?•  We compare and analyze total migrated sperm and score 0 spermatozoa for 26 patients
  103. 103. Material and Methods Which  head  abnormality  we  selected  in  score  0  ?            Aneuploidy  ?        FISH                                                      DNA  Fragmenta7on  ?  Tunel                                                                          Chroma7n  decondensa7on  ?  Aniline  blue  
  104. 104. 18   18   Х   Х  Х   Х   18   18  
  105. 105. Ejaculate  sperm   n=26   Density  Gradient     HM   n=26   x6600   Score  0  S=  0,  1,  2,  3,  4,  5,  6     Total  migrated  Spz   100  Spz   DNA    FRAG   DNA    FRAG   Total  migrated  Spz   100  Spz   Decond  ChromaBn   Decond  ChromaBn   5200  Spz  analyzed  in   5200  Spz  analyzed  in   the  group  control   the  study  group  
  106. 106. Score  0        Ecart  Type   TMS              Ecart  Type   p  Chroma7ne  cond  (%)   19.5  %            (8.7)   10.1%                    (6.0)    0.0001   Frag  DNA  (%)   0.5%                  (2.5)   0.5%                        (2.5)   0.41  
  107. 107. Conclusion I •  Score  0,  with  an  abnormal  chroma7n  compac7on,   must  be  discarded  ………..No  blastocyst  •  Packaging,    Histone  /  Protamine  
  108. 108. Second Questions ???  Can  we  select  a  spermatozoon  with  a  normal       gene7c  status  by  high  magnifica7on  ???      Balanced  transloca7on  by  FISH  spermatozoon         FFER,  PARIS,  2010  
  109. 109.          Spermatozoa  selected  at  high  magnificaBon  X6100   Migrated  sperm    ClassificaBon     Cassuto-­‐Barak   White  blood  cells  1 Slide 3 Slides (35 spermatozoa) 1 Slide(3 mitoses) (300 spermatozoa) Score 6 5 4 Score 1 2 3 Score 0    FISH    on  mitose     FISH FISH  on  spermatozoa                                  FISHER  TEST  
  110. 110. Results        No  correlaBon  between  the  sperm  head  morphology  at          high  magnificaBon  and  the  sperm  geneBc  status      We  cannot  select  a  geneBcally  normal  spermatozoon  by       high  magnificaBon  
  111. 111. Conclusion II •  No correlation with FISH•  No correlation with DNA Fragmentation•  Positive correlation with chromatin decondensation Is an abnormal chromatin condensation: Histone / Protamine: Packaging…Apoptosis….????
  112. 112. Morphology test and scoring test You  can  think  globaly:  Sperm       But  you  must  act  locally:  Spermatozoon  
  113. 113. Sperm  DNA  damage  •  During  spermatogenesis   –  Chroma7n  compac7on:    Histones                    Protamines   –  Quan7ta7ve  or  qualita7ve  chromosomal  abnormali7es  •  By  reac7ve  oxygen  species  (ROS)   –  Infec7ons,  Inflammatory  reac7on     –  Tobacco     –  Pollu7on    •  Consequences  
  114. 114. Genomic  imprin7ng    The  imprin7ng  is  a  chemical  process  through  methyla7on  and  acetyla7on  histone,  without  altering  the  DNA  sequence  
  115. 115. INTRODUCTION  Many  arBcle  showed  birth  defects  prevalence  in  ICSI  and  IVF  compared  with  spontaneously  conceived  infants.    There  is  an  increased  risk    of  major  congenital  malformaBons.   Ø   Wen  SW  et  al  ;  Eur  J  Obstet  Gynecol  Reprod  Biol.  2010  Jun     Ø   Hvidtjørn  D  et  al  ;  Hum  Reprod.  2010  Aug;25(8):     Ø   Reeuuis  J  Honein  MA  et  al  ;  Hum  Reprod.  2009  Feb;24(2):360-­‐6.   Ø   Hansen  M,  Bower  C  et  al  ;  Hum  Reprod.  2005  Feb;20(2):     Ø   Hansen  M,  Kurinczuk  JJ  ;  N  Engl  J  Med.  2002  Mar  7;346(10):    
  116. 116. AIM  OF  THE  STUDY  To  determine  whether  the  IMSI  with  microinjecBon  of    morphologically  normal  nuclei  decrease  the  prevalence  of    major  malformaBons  and  geneBc  syndromes  in  children     A  prospecBve  study  from  October  2005  to  March  2010  for  children  born  aser   ICSI  and  IMSI  
  117. 117. PATIENTS  Inclusion  criteria    :    ♦  Woman  under  39  years  ♦  Singletons,  twins  and  triplet  pregnancies  from  fresh  ejaculated  sperm  ♦   Pregnancies  that  resulted  in  the  birth  of  a  child  in  live  ♦   Children  born  aser  ICSI  and  IMSI  Exclusion  criteria      ♦  Frozen  semen  and  sperm  of  tes7cular  and  epididymal  ♦   Abor7ons  (19,61%),  fetal  deaths  and  MIP  (0,81%)   A  TOTAL  OF  914  children  including  904  children  informaBve  (98,9%)                                                                                                                  and  10  children  lost  follow  up  (1,09%)  
  118. 118. AGE    DISTRIBUTION   0.06   0.08   0.10   0.08   freq.  /  prob.  freq.  /  prob.   0.06   0.04   0.04   0.02   0.02   0.00   0.00   20   25   30   35   40   20   30   40   50   60   Age  Mother   Age  Father   32,82  ±    3,6  years     33,34  ±    5,7  years  
  119. 119. LogisBc  regression  of  Age  and  techniques   with  mother’s  age  39  -­‐   Age  father  /Birth  defect      =  MM  +  GS    p=  0.7119  -­‐   Age  mother/  Birth  defect  =  MM  +  GS    p=  0.1611    Æ  No  correla7on  between  the  presence  of  major  malforma7ons  and  gene7c  syndromes  and  parental  age          
  120. 120. LogisBc  regression  of  techniques  with  mother’s  age    39)     IVF / ICSI / IMSI IVF / ICSI IVF / IMSI ICSI / IMSI chi2- squared 5,0234 1,73 1,1315 4,5479 p 0,0785 0,2495 0,3691 0,0335 Æ  Correla7on  between  the  major  malforma7ons  and  gene7c   syndromes  and  the  technique  used  (p  =  0.0357)  significant   increase  of  MM  +  GS  in  ICSI  versus  in  IMSI  
  121. 121. 23   600   6   Number  of  children   500   400   521   300   354   200   100   0   ICSI   IMSI   Major  malformaBons  +  GeneBc  syndromes   Healthy  Child    X-­‐squared  =  4.5479,  p-­‐value  =  0.03350  Fisher  test  (x,simulate.p.value=T,B=2000)  ,  p-­‐value  =  0.03428  
  122. 122. SECONDARY  OBJECTIVE  OF  STUDY      To  compare  low  weight  birth  and  the  risk  of  preterm  delivery       between  children  born  by  IVF,  ICSI  or  IMSI  
  123. 123. DistribuBon  of  birth  weight  using  the  technique   Médiane  :  3250  g   IMSI   N=221   Médiane  :  3200  g       ICSI  N=353   Médiane  :  3150  g   IVF  N=324   1000   2000   3000   4000   5000   Weight    birth,  g        
  124. 124.                    Preterm  and  Technique   40  GestaBonal  age,  weeks   35   30   25   IVF   ICSI   IMSI   38.9  ±  2.5  [25.1-­‐42]   39.3  ±  1.8  [29-­‐42.6]   39.4  ±  1.97  [27.6-­‐42]  
  125. 125. IVF   IMSI   0.20   0.20   0.15   0.15   0.10   0.10   0.05   0.05  probability   0.00   0.00   25   30   35   40   30   35   40   ICSI   0.00   0.05   0.10   0.15   0.20   0.25   Comparison  of  risk  of  preterm  delivery           between  children  born  by          IVF  /  ICSI  /  IMSI     30   32   34   36   38   40   42   GestaBonal  age,  weeks  
  126. 126. Results  Increased  risk  of  preterm  delivery  for  pregnancies  awer  IVF  and  ICSI  than  awer  IMSI  with  more  birth  at  term                            Kruskal-­‐Wallis  chi-­‐squared  =  7.9427,  p-­‐value  =  0.01885  
  127. 127.          THE    SPERMATOZOON    IS    ONLY     A    VEHICLE    CELL    !!!!  
  128. 128. Thanks Jean Michel PLOUCHART Sonia JELLAD Pierre VANDERZWALMEN Karine MEDRANO Farida KOURTAA Baya OMAIS Richard BALET Lionel LARUE Dominique BOURET Yona Barak
  129. 129. Homocysteineand miscarriages Pr JC. GrisHomocystéine et fausses couches
  130. 130.   Homocysteine     and     Miscarriages    Prof.  Jean-­‐Christophe  Gris,  MD,  PhD        
  131. 131. •  General  concerns/defini7ons  •  Epidemiology  •  Experimental  data  •  Therapeu7c  data  •  Conclusions  
  132. 132. CONCERNS/DEFINITIONS  MISCARRIAGES:  A  SYNDROME,  NOT  AN  ILLNESS…  STRONG  HETEROGENEITY  
  133. 133. Miscarriages…   or  clinically-­‐relevant  loss  subtypes?   Sequence   Primary  loss  Timing   Secondary  loss   Biochemical    loss   Early,  embryonic  los   Sporadic  loss   Late,  fœtal  loss   Recurrent  loss   SBllbith   Explained  loss   Current  unexplained  loss   Number   Unexplained  euploid  loss   AeBology      
  134. 134. Miscarriages…   or  clinically-­‐relevant  loss  subtypes?   Sequence   Primary  loss  Timing   Secondary  loss   MISCARRIAGES:   loss   Biochemical    loss   Early,  embryonic  los   Sporadic   HETEROGENEOUS   Late,  fœtal  loss   SBllbith   Recurrent  loss   Explained  loss   Current  unexplained  loss   Number   Unexplained  euploid  loss   AeBology      
  135. 135.   Heterogeneity:   a  ma@er  of  severity  !        Timing                                  Sequence                          Number                                        AeBology   Biochemical   Secondary   Sporadic   Explained          Early,  embryonic   Primary   Recurrent   Current  Unexplained       Late,  fœtal   Euploid  Unexplained     SBllbirth  
  136. 136.   Heterogeneity:   a  ma@er  of  severity  !        Timing                                  Sequence                          Number                                        AeBology   Hyper-­‐HCY   Secondary   vs.  Sporadic   Biochemical     Explained  Early,  embryonic           Late,  fœtal   miscarriages  as  a  whole:   Primary   Recurrent   Current  Unexplained     a  medical  nonsense     Euploid  Unexplained   SBllbirth  
  137. 137. 1-­‐  Gesta7onal  ages   PL  categories:  Farquharson  RG  et  al.,  Hum  Reprod  2005  •  Biochemical  PL   – Before  week  6  (0-­‐6)   – No  detec7on  of  fœtal  heart  ac7vity   – Pregnancy  lot  located  on  ultrasound  exams   – Serum  βHCG  levels  are  low,  then  fall    
  138. 138. PL  categories:  Farquharson  RG  et  al.,  Hum  Reprod  2005  •  Early  PL   –  Typically  between  weeks  6  and  8  (4-­‐10)   –  No  detec7on  of  fœtal  heart  ac7vity   –  Ultrasound  exam:   •  Empty  sac  /  large  sac  with  minimal  structures   –  Serum  βHCG  rise  then  fall  •  First  trimester  PLs  are  not  early  PLs!      
  139. 139. PL  categories:  Farquharson  RG  et  al.,  Hum  Reprod  2005  •  Late  PL  (fœtal)   –  Typically  from  week  12  (10-­‐20)   –  Ultrasounds:   •  Crown-­‐rump  lenght  CRL:  previously  measured   •  Heart  ac7vity:  previously  detected   –  Loss  of  fœtal  heart  ac7vity   –  Serum  βHCG  levels  rise,  then  are  sta7c  or  fall  •  Some  first  trimester  PLs  are  late  PLs!    
  140. 140. PL  categories:  Farquharson  RG  et  al.,  Hum  Reprod  2005  •  SBllbirth   – Death  of  a  viable  fœtus  before  the  complete   expulsion  or  extrac7on  from  its  mother   •  Weighing  at  least  500  g   •   If  birth  weight  unavailable:   –  Awer  20  completed  weeks  post  fer7lisa7on   –  Or  with  a  crown-­‐heel  lenght    25  cm   •  No  detec7on  of  fœtal  heart  ac7vity    
  141. 141. 2-­‐  Number:  of  PL,  of  children  •  Sporadic  vs.  Recurrent  PL   –  Ini7ally:  3  or  more.   –  Recently:  2  or  more  failed  pregnancies   •  Am.  Soc.  for  Reprod.  Medicine,  FerJl  Steril  2008;  89:  1603    •  Primary  vs.  Secondary  PL   –  Childless  women  vs.  mothers  
  142. 142. 3-­‐  Explained  vs.  «  idiopathic  »  PL    •  Recommenda7ons  for  the  tes7ng  of  couples   –  Diversely  applied;   •  Jauniaux  E  et  al.,  Hum  Reprod  2006;  21:  2216     –  CytogeneBc  abnormaliBes  in  the  conceptus?   •  Despite  normal  parental  karyotypes     •  Chromosomal  abnormali7es  in  early  PL:    50%     –  Aneuploidy:  early  sporadic  miscarriage   •  Normal  conceptus  karyotype:  predicts  subsequent  PL     •  Genomic  hybridisaJon  on  formalin-­‐fixed  miscarriage  Jssue  
  143. 143. CONCERNS/DEFINITIONS  HYPERHOMOCYSTEINAEMIA:  JANUS                  STRONG  HETEROGENEITY  
  144. 144. *   Methyl groups: DNA, Histones,… Epigenetics HCY  concentra7ons:   a  tote,  emblema7c  crossroad.   At  least….   HCY:   various  cofactors,   various  mechanisms,   various  puta7ve  impacts.  
  145. 145. HCY metabolism:Relevance of enzymatic polymorphisms / variants? MTHFR    C677T    A1298C   …and 16 other genetic polymorphisms   have been described… CBS        14037  31-­‐bp  VNTR    844ins68     MS  A2756G     Explain MTRR        A66G     Only 9% cSHMT      C1420T   of the variance of   TC      A67G    C776G   HCY plasma concentration   Kluijtmans, Blood 2003 GCPII        C1561T  
  146. 146. So:     really     Hyperhomocysteinaemia   as  a  whole,     or  some  precisely  defined,  mechanisJcally  homegeneous,   Hyperhomocysteinaemia   subtypes?    
  147. 147. HCY  during  normal  pregnancy  •  Lower  tHCY  plasma  concentra7ons   •  But  higher  in  1st  T  than  in  2nd  and  3rd  T  •  Héterogeneous  mechanism   –  Methionine  metabolism  (Dasarthy  J  et  al.,  Am  J  Clin  Nutr  2010):   •  Higher  rate  of  transsulfuraBon  in  early  gesta7on,  1st  T   •  Higher  rate  of  transmethylaBon  in  late  gesta7on,  3rd  T  

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