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• Arditti, J. 2008. Micropropagation
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Volumen 1. pp. 61.
• García, F., Roselló, J. y Sant...
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Cultivo in vitro de meristemo apicales de Phragmipedium peruvianum “Zapatito rojo” para la obtención de plantas libres de virus.

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Cultivo in vitro de meristemo apicales de Phragmipedium peruvianum “Zapatito rojo” para la obtención de plantas libres de virus.

  1. 1. Cultivo in vitro de meristemo apicales de Phragmipedium peruvianum “Zapatito rojo” para la obtención de plantas libres de virus. 1 ÁVILA, José.; 1 PEDRAZA, Ana.; 1 ROJAS, Stefany.; 1 SALAS, Marysabel.; 2 QUIÑONES, Mauro. 1 Investigadores. Laboratorio de Biotecnología y Fisiología Vegetal. Facultad de Ciencias Biológicas. Universidad Ricardo Palma. 2 Asesor. Especialista en Biotecnología y Fisiología Vegetal. Laboratorio de Biotecnología Vegetal. Universidad Ricardo Palma RESUMEN Phragmipedium peruvianum (Orchidaceae: Cypripedioideae) conocido como “Zapatito rojo” es una orquídea terrestre de gran importancia económica debido a la belleza de su inflorescencia. En el presente trabajo se tiene como objetivo principal realizar el cultivo in vitro de meristemos apicales de Phragmipedium peruvianum “Zapatito rojo” para la obtención de plantas libres de virus. Para ello se empleó un protocolo estandarizado. Los explantes utilizados fueron estrictamente esterilizados y los meristemos aislados fueron introducidos en tubos de ensayo con medio de cultivo MS enriquecido con 6-BAP. Los tubos fueron llevados al cuarto de cultivo para ser incubados a una temperatura entre 24 – 27 ° C y en condiciones de fotoperiodo de 14 horas. Los meristemos sembrados se mantuvieron en observación, para descartar la presencia de agentes contaminantes o fenolización, todo el procedimiento fue realizado en condiciones asépticas. De los 6 explantes sembrados, tan solo uno presentó cambios mínimos en su coloración y tamaño. Los explantes restantes no presentaron cambios, contaminación ni necrosis del tejido luego de seis semanas de cultivo Palabras claves: Phragmipedium, meristemo, in vitro, virus. ABSTRACT Phragmipedium peruvianum (Orchidaceae: Cypripedioideae) known as "Red Slipper" is a terrestrial orchid of great economic importance due to the beauty of its inflorescence. In the present paper's main objective is to perform the in vitro culture of apical meristems Phragmipedium peruvianum "Red Slipper" to obtain virus free plants. To do this we used a standardized protocol. The explants used were strictly sterilized and isolated meristems were introduced into test tubes with MS medium supplemented with 6-BAP. The tubes were taken to the grow room to be incubated at a temperature between 24 to 27 ° C and under photoperiod of 14 hours. Planted meristems were kept under observation to rule out the presence of contaminants or Phenolization, the entire procedure was performed under aseptic conditions. Of the 6 explants planted, only one had minimal changes in color and size. The
  2. 2. remaining explants were unchanged, contamination and tissue necrosis after six weeks of culture. Key words: Phragmipedium, meristem, in vitro, virus.
  3. 3. INTODUCCIÓN La especie Phragmipedium peruvianun “zapatito rojo” es una orquídea cespitosa, litófita, de tres a más hojas basales de posición dística, endémica de la región de San Martín – Perú (Millán et al. 2007). Posee un alto valor económico por la belleza de su inflorescencia por lo que su alta demanda ha hecho que esta especie sea extraída indiscriminadamente de su hábitat natural, trayendo como consecuencia que, actualmente, se encuentre en amenaza de extinción. La propagación de esta especie se realiza a través de sus semillas, sin embargo este cultivo tradicional no satisface su actual demanda. La biotecnología nos permite reproducir plantas y por ende salvar aquellas que están en peligro de extinción. Una de las formas más eficaces para la conservación de cualquier especie es la propagación in vitro (Mckendrick, 2002). La micropropagación presenta grandes ventajas sobre otros métodos, como por ejemplo permite el incremento acelerado del número de plantas por genotipo y la reducción del período de multiplicación, lo que permite un ahorro considerable en espacio y energía (Mendieta M. 2002). De igual manera se pueden enunciar ventajas a la micropropagación de orquídeas, como el establecimiento de híbridos y el mejoramiento de la industria y del comercio de orquídeas (Quiñonez, 200) El presente trabajo tiene como objetivo la obtención de plantas in Vitro para la micropropagación clonal de P. peruvianum mediante el cultivo de meristemos. MATERIALES Y MÉTODOS Las plantas de Phragmepidium peruvianum “zapatito rojo”, fueron adquiridas en el Vivero Manrique, ubicado en Surquillo, y posteriormente trasladadas al Laboratorio de Biotecnología Vegetal de la Universidad Ricardo Palma. A partir de estas se tomaron los explantes (yemas axilares de la base de las hojas) y se colocaron en beakers para ser lavados con agua y detergente. Luego se trasladaron a la cámara de flujo laminar y fueron sumergidos en hipoclorito de Sodio por 10 minutos. Después fueron enjuagados 5 veces con agua destilada, con intervalos de 5 minutos entre cada enjuague. Una vez esterilizados los explantes se transfirieron a una placa petri estéril y, con ayuda de un estereoscopio binocular, se procedió a aislar el meristemo retirando todos los primordios foliares. Los meristemos aislados (1mm) se introdujeron en tubos de ensayo con medio de cultivo MS enriquecido con 6-BAP, utilizando pinzas y bisturís estériles. Los tubos fueron sellados con papel platino y llevados al cuarto de cultivo para ser incubados a una temperatura entre 24 – 27 ° C y en condiciones de fotoperiodo de 16 horas. El cultivo de los explantes tuvo una duración de 5 semanas. Adicionalmente se practicó la micropropagación con la orquídea Cattleya sp., separando y trasladando plántulas obtenidas in vitro, a nuevos frascos con medio de cultivo MS, colocando 4 por cada frasco. Finalmente estos se sellaron con papel platino y fueron llevados al cuarto de
  4. 4. cultivo a las condiciones adecuadas. El cultivo de las plántulas in vitro tuvo una duración de 4 semanas. RESULTADOS De los 6 explantes sembrados, tan solo uno presentó cambios mínimos en su coloración y tamaño (Fig. 1). Los explantes restantes no presentaron cambios, contaminación ni necrosis del tejido luego de seis semanas de cultivo. Las plántulas de Cattleya sp. que fueron micropropagadas no presentaron contaminación alguna luego de cuatro semanas de haber sido introducidas in Vitro (ver Fig. 2). DISCUSIÓN El género Phragmipedium sp. se caracteriza por ser uno de los géneros de orquídea más difíciles de ser cultivados in vitro, careciendo, por lo tanto, de una metodología adecuada para su cultivo (Arditti, 2008). Para el cultivo in Vitro de meristemos, se suele mantener 1 a 3 primordios foliares junto al domo meristemático (Salazar et al., 2009). En otros casos, el tamaño del explante es vital para el éxito del cultivo. Kaur y Bhutani en 2009 demostraron que explantes de Vanda testacea mayores a 1 cm. no producían respuesta alguna, mientras que aquellos que presentaban dimensiones mucho menores tan solo respondían a ciertas combinaciones de suplementos en el medio de cultivo. En el presente trabajo, los explantes utilizados fueron de menos de 1 cm. (aproximadamente 1 mm.) y no se conservó ningun primordio foliar. En general, la extracción del domo meristemático es un procedimiento dificil, de la cual resulta muy complicado obtener una planta completa. Para ello, es necesario un medio de cultivo con concentraciones de hormonas y sales equilibradas y condiciones ambientales estrictas, por consiguiente, esto ha llevado a que los resultados en ese sentido sean muy pobres. Por esta razón, en la mayoría de los casos, se utiliza el domo meristemático acompañado de 1 ó 2 primordios foliares (Conci, 2010). Los primordios foliares juegan un rol importante durante el desarrollo de la planta. Estas estructuras sirven como protección para el domo meristemático, provee de productos fotosintéticos a la zona meristemática, la cual carece de Fig 1. Tubo conteniendo el meristemo axilar de hojas de P. peruvianum. Luego de seis semanas de cultivo no se aprecian cambios significativos Fig. 2. Plántulas de Cattleya sp. Luego de cuatro semanas de haber sido micropropagadas. No se observa indicio alguno de contaminación.
  5. 5. capacidad fotosintética, y se ha demostrado que estimulan la diferenciación del xilema en el procambium (García, 2006; McAdam, 2008). Montero et al. en 2006 demostraron que los primordios foliares presentan una rápida respuesta organogénica directa ante la incubación con fitohormonas, pasando a formar yemas y vástagos individuales (BAP 9mM + ANA 1.5mM) o múltiples (MS complementado con BAP 2mg/L (8.7 uM)). Debido a las razones expuestos, la falta de respuesta de los explantes introducidos in Vitro se debería a la ausencia de primordios foliares acompañando al domo meristemático, los cuales facilitan el cultivo de meristemos y juegan un rol importante en el desarrollo de la planta in Vitro. CONCLUSIONES • Los domos meristemáticos de las yemas axilares de P. peruvianum por si solos no pudieron producir plantas in Vitro. • Debido a la falta de respuesta de los explantes, se utilizó plántulas de la orquídea Cattleya sp. para la micropropagación. • La ausencia de primordios foliares acompañando al domo meristemático habría impedido el desarrollo de plantas in Vitro. RECOMENDACIONES • Mantener las yemas el menos tiempo posible expuestas al ambiente luego de la desinfección, para evitar el ennegrecimiento y posibles oxidaciones de las yemas. • Disminuir los errores de trabajo en la etapa de lavado, desinfección, extracción y sembrado; ya que estos afectan directamente el resultado para la obtención de plantas libres de virus • El corte del meristemo debe ser de mayor tamaño. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS • McKENDRICK, S. 2000. Manuel para la germinación in vitro de orquídeas, ceiba foundation. USFQ. Quito, Ecuador. 76p • MENDIETA MARIA. 2002. Estudio técnico para la planificación y el diseño de un laboratorio artesanal para la produccion de orquideas in vitro. Trabajo de graduación. Universidad earth. Guácimo, Costa Rica. • QUIÑÓNES, M. 2000. Micropropagación de orquídeas Peruanas a escala piloto. Universidad Ricardo Palma. CONCUTEC. Lima, Perú. 98 p. • Millán B., R. Bravo, M. Chocce & A. Coz. 2007. Evaluación poblacional, distribución y estado de conservación de Phragmipedium kovachii en el Perú. SERIE DE PUBLICACIONES DE FLORA Y FAUNA SILVESTRE. Instituto Nacional de Recursos Naturales, Lima, Perú.
  6. 6. • Arditti, J. 2008. Micropropagation of orchids. Blackweel Publishing. Volumen 1. pp. 61. • García, F., Roselló, J. y Santamaría Mª. 2006. Introducción al funcionamiento de las plantas. Ed. Universidad Politécnica de Valencia. 88 pp. • Kaur, S. y Bhutani, K.K. 2009. In vitro Propagation of Vanda testacea (Lindl.) Reichb.f. A Rare Orchid of High Medicinal Value. Plant Tissue Cult. & Biotech. 19(1): 1-7. • Levitus, G., Echenique, V., Rubinstein, C., Hopp, E. y Mroginski, L (ed.). 2010. Biotecnología y mejoramiento vegetal II. ArgenBio. Cap. 1 y 5. • McAdam, J. 2008. Structure and function of plants. Ed. Wiley- Blackwell. 78 pp. • Montero, C., Macías, E. y Wong- Vega, L. 2006. Organogénesis directa y múltiple en tejidos juveniles de guandú o gandul [Cajanus cajan (L.) Millsp.]. Invet. pens. crit. 4:20-31. • Salazar, E., Gonzales, P. y Hernández, C. 2009. Multiplicacion in vitro de Agave cocui trelease a traves de yemas axilares. Agronomía Trop..59 (2): 129-135.
  7. 7. • Arditti, J. 2008. Micropropagation of orchids. Blackweel Publishing. Volumen 1. pp. 61. • García, F., Roselló, J. y Santamaría Mª. 2006. Introducción al funcionamiento de las plantas. Ed. Universidad Politécnica de Valencia. 88 pp. • Kaur, S. y Bhutani, K.K. 2009. In vitro Propagation of Vanda testacea (Lindl.) Reichb.f. A Rare Orchid of High Medicinal Value. Plant Tissue Cult. & Biotech. 19(1): 1-7. • Levitus, G., Echenique, V., Rubinstein, C., Hopp, E. y Mroginski, L (ed.). 2010. Biotecnología y mejoramiento vegetal II. ArgenBio. Cap. 1 y 5. • McAdam, J. 2008. Structure and function of plants. Ed. Wiley- Blackwell. 78 pp. • Montero, C., Macías, E. y Wong- Vega, L. 2006. Organogénesis directa y múltiple en tejidos juveniles de guandú o gandul [Cajanus cajan (L.) Millsp.]. Invet. pens. crit. 4:20-31. • Salazar, E., Gonzales, P. y Hernández, C. 2009. Multiplicacion in vitro de Agave cocui trelease a traves de yemas axilares. Agronomía Trop..59 (2): 129-135.

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