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Automatización en hematología
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Automatización en hematología

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  • 1. AUTOMATIZACIÓN EN HEMATOLOGÍA
  • 2. AUTOMATIZACION Mecanizar todo o la mayoría de los pasos manuales en un proceso o en todo el procedimiento “Es una solución que combina varios procesos en un solo sistema eficiente que elimina el riesgo de error asociado a la operatividad humana. Las tareas intensivas en trabajo : etiquetado, manejo, preparación y almacenamiento de las muestras, que se realizan utilizando numeroso personal, cada uno de los cuales pueden introducir errores u otros problemas, pueden ser fácilmente automatizables” 1 1 JAMES,David “Selecting appropiate automation for the lab” IDVT Sep. 2007
  • 3. PROCESO Es un conjunto de actividades que utiliza recursos para transformar elementos de entrada en bienes o servicios capaces de satisfacer las expectativas de distintas partes interesadas: clientes externos, clientes internos, accionistas, comunidad, etcétera.
  • 4. PROCESO PRINCIPALES RECURSOS  MANO DE OBRA: Protagonista de todo proceso, por lo tanto sus actividades y aptitudes influyen directamente en los resultados o salidas del proceso.  MÉTODOS: Políticas, procedimientos, normas e instrucciones que se emplean para ejecutar un determinado trabajo.  MAQUINARIA O EQUIPO: Viene a ser el elemento que complementa el esfuerzo del personal en la agregación de valor. Su adecuada calibración, correcto mantenimiento y oportuno reemplazo definirán apropiados niveles de precisión y exactitud.
  • 5. PROCESO PRINCIPALES RECURSOS  MATERIALES O SUMINISTROS: Entradas que serán transformadas por un proceso (materiales, partes en proceso y la información).  MEDIO AMBIENTE: Condiciones en las cuales se desarrolla un trabajo: espacio, ventilación, seguridad, iluminación, etcétera.  MEDIOS DE CONTROL: Instrumentos o recursos utilizados para evaluar el cumplimiento de los requisitos establecidos.
  • 6. ENFOQUE BASADO EN PROCESOS
  • 7. DIVISIONES DEL PROCESO DE ANALISIS TOMA DE MUESTRA TRANSPORTE DE LA MUESTRA RECEPCION POR EL LABORATORIO MUESTRA PARA ANALISIS MUESTRA PARA ALMACENAMIENTO ANALISIS CONTROL DE CALIDAD EMISION DE RESULTADOS EVALUACION DE LOS RESULTADOS MANTENIMIENTO Y/O REPARACION DEL ANALIZADOR ORDEN DE ANALISIS PREPARACION DE LA MUESTRA FASE PREANALITICA FASE ANALITICA FASE POSTANALITICA
  • 8. CRITERIOS PARA EVALUAR LA AUTOMATIZACIÓN  Complejidad del nivel hospitalario  Volumen de trabajo ( Rutina y Especiales )  Visión de futuro ( Perspectivas )  Infraestructura  Recursos Económicos  Soporte Técnico Garantizado
  • 9. ¿PORQUÉ AUTOMATIZAR? Reducir costos operativos Obtener mayor eficiencia Aumentar la productividad Competir en un ambiente globalizado Sobrevivir en el mercado
  • 10. ¿QUÉ BUSCAN LOS LABORATORIOS HOY? Mejor productividad y mejor calidad Flujo de muestras mas rápido y eficiente Reducción de costos
  • 11. AUTOMATIZACIÓN VENTAJAS  Incremento del número de pruebas realizado por una persona en un período de tiempo  Minimiza las variaciones en los resultados  Minimiza errores de la parte manual (e.g. pipeteo)  Usa menos muestra y reactivo por cada prueba
  • 12. AUTOMATIZACIÓN LIMITACIONES Metodología varía con el tipo de instrumento Costo del equipo, mantenimiento, CC Personal debe conocer operatividad y cuidados de rutina
  • 13. OBTENCIÓN DE LA MUESTRA Sangre total con anticoagulante EDTA K2 (K3)en tubo al vacío
  • 14. ELEMENTOS CELULARES
  • 15. PRINCIPIOS BÁSICOS Impedancia electrónica Radiofrecuencia Dispersión óptica
  • 16. IMPEDANCIA ELECTRÓNICA (PRINCIPIO COULTER) Electrodo interno Electrodo externo Flujo del diluyente Vacío regulado Cubeta de conteo Micro orificio Diámetro apertura aprox. 4mm 1 pulso = 1 partícula
  • 17. DISCRIMINACION DE PULSOS a = Ruido Eléctrico b = Discriminador bajo c = Separación de células grandes y pequeñas a b c Señal células grandes Señal células pequeñas
  • 18. 60 70 80 90 100 110 120 fl  Pilas: Células son agrupadas con similar tamaño de pulso.  La Pila con el mayor número de células es el 100% de altura relativa.  Eje X = tamaño celular  Eje Y= número de células HISTOGRAMAS
  • 19. RADIOFRECUENCIA ( impedance) Conductividad (RF) – proporcional a la densidad interior de la célula (gránulos y núcleo)
  • 20. DISPERSIÓN ÓPTICA Desvía la luz •Cel. en solución corren a través de una celda de cuarzo •Enfoque hidrodinámico (líquido envolvente, “flujo laminar”) •Enfoque del láser •Análisis por computadora de los grupos (citogramas)
  • 21. ABBOTT - MAPSS (MULTI ANGLE POLARIZED SCATTER SEPARATION) Numeración Tamaño Complejidad del núcleo Láser ARGON 7° 0° 90°, Polarizado PMT2 Complejidad del citoplasma Granulaciones Eosinófilos 90° ,Depolarizado PMT1
  • 22. Parte Inf. (fija) Pipeta VÁLVULA DE SEGMENTACIÓN Parte Int. (movible) Parte sup. (fija)
  • 23. VÁLVULA DE SEGMENTACIÓN Parte sup. (fija) Parte Inf. (fija) Pipeta Parte Int. (movible)
  • 24. Parte Int. (movible) Parte sup. (fija) Parte Inf. (fija) Pipeta VÁLVULA DE SEGMENTACIÓN
  • 25. SEPARACIÓN DE LA MUESTRA 12µl (WBC) 4 µl (RBC) 6 µl (Hb)
  • 26. DILUCIÓN - RBC Bomba del diluyente Cámara de mezcla 4 µl (RBC)
  • 27. DILUCIÓN WBC - HGB 12µl (WBC) 6 µl (HGB) Bomba del Diluyente Bomba de HGB Canal WBC Celda HGB
  • 28. Stromatolyser-3WP Sulfolyser Mixing- Chamber 1:500 SampleRotorValve (SRV) RBC Channel 1:25.000 40 µl 2,0 ml Cellpack
  • 29. Stromatolyser-3WP Sulfolyser Mixing- Chamber 1:500 SampleRotorValve (SRV) WBC Channel 1:250 1,0 ml 0,5 ml 6 µl Cellpack
  • 30. Stromatolyser-3WP Sulfolyser Mixing- Chamber 1:500 SampleRotorValve (SRV) Hgb Photometer 1:500 3 µl 1,0 ml 0,5 ml Cellpack
  • 31. HISTOGRAMA WBC Discriminadores posicionados en el pico y valle para separar las células Células clasificadas como: Neutrofilos, Linfocitos y Mixtas (M, E y B) Alturarelativa LD T1 T2 UD Células mixtas (Monos, Eos y Basos) Células grandes (neutrófilos) Células pequeñas (linfocitos)
  • 32. MEDICIÓN DE LA HEMOGLOBINA • RBC son lisados (amonio cuaternario, ferricianuro, etc.), permite la liberación de Hb CianMetHb • Una parte de la dilución de los WBC pasa a una cubeta espectrofotométrica para la medición a 540 nm • Existen otros métodos libres de cianuro, donde ocurre lísis de los RBCs seguido de la formación de un complejo imidazol-hemoglobina que posee un pico de absorción a 540 nm. Fuente luminosa LED C. de medición Filtro Foto-detector
  • 33. • Aglutininas frías: • Bajos contajes de RBC y altos MCV pueden ser causados por las aglutininas de los hematíes. Si están presentes, también el hematocrito y los MCHCs pueden ser también incorrectos. • Pueden presentarse en la mononucleosis infecciosas y en las infecciones por mycoplasma (neumonía). • Si se observan RBC aglutinados en el frotis de sangre periféricas, calentar la muestra a 37°C, mezclarla y analizarla mientras esté caliente. FUENTES DE ERROR
  • 34. • RBC fragmentados o microcíticos: • Pueden causar conteos bajos de RBC y pueden dar un aviso en el conteo de las plaquetas puesto que se vuelven muy cercanas al tamaño de las plaquetas y pueden originar un histograma plaquetario anormal.
  • 35. • Acúmulo de plaquetas y satelitosis: • Esto causa un conteo falsamente disminuido de las plaquetas y se puede confirmar revisando el frotis. Siempre tratar de examinar el borde del frotis cuand se tienen contajes bajos de plaquetas.
  • 36. • Plaquetas gigantes: • Se aproximan al tamaño de un hematíe. Pueden causar que la cola derecha del histograma permanezca elevada y pueda verse a la izquierda del histograma de los RBC.
  • 37. RBC Nucleados: Estos pueden interferir con los WBC en algunos instrumentos y ser contados como leucocitos(linfocitos)
  • 38. • Cualquier elemento que pueda causar turbidez e interferir con el método espectrofotométrico. • Como ejemplos: Alto contaje de WBC, lipemia y hemoglobinas resistentes a la lisis (Hb S y C) FUENTES DE ERROR EN LA MEDICIÓN DE LA HEMOGLOBINA
  • 39. • HISTOGRAMA RBC – Histograma normal de 36- 360 fl – (24- 36 fl ) Aviso puede deberse: 1- RBC fragmentos 2- WBC fragmentos 3- Plaquetas gigantes 4- Microcitos – Desviación a la derecha: - Leucemia - Anemia Macrocítica - A. Megaloblastica – Desviación a la izquierda: - Anemia microcítica – Bimodal - Aglutininas frías - Anemia Megaloblástica con transfusión. - A. Sideroblástica. – Trimodal - Anemia con transfusión.
  • 40. • HISTOGRAMA PLAQUETAS – Histograma normal de 2-20 fl. • 0-2 fL – Burbujas de aire – Polvo – Ruido eléctrico • > 20 fL – Microcitos – Scishtocitos – Fragmentos WBC – Plaquetas gigantes – Aglutinación
  • 41. Luz dispersada frontal ( Volumen Celular ) Luz dispersada lateral (Estructura celular interna) WBC Canal WBC/Baso Baso Side scatter Forwardscatter RBC ghost Mono Canal Diff Side scatter Lymph Neut + Baso RBC ghost Fluorescence Eo
  • 42. Canal DIFF DISPERSIÓN LATERAL (Estructura Celular Interna) FLUORESCENCIA (informacióndelRNA/DNA)
  • 43. LINFOCITOS MARCAJE DE CD4/CD8
  • 44. BECKMAN COULTER • Principios de Medición – Medición directa: • RBC – Impedancia • WBC - Impedancia, enfoque hidrodinámico • Plaq. – Impedancia (2-20 fl) • Hb – Cianometamoglobina modificado (525 nm) • MCV – media del volumen de RBC (histograma) – Medición indirecta: • Hct, MCHC, y MCH (calculados) – RDW y MPV (CV de sus respectivos histogramas) – WBC Diferencial • VCS – volumen, conductividad, dispersión – Reticulocitos • Coloración Supravital (nuevo azul de metileno) • VCS
  • 45. SYSMEX • Principios de Medición – Medición directa: • RBC – Impedancia, enfoque hidrodinámico • WBC – Impedancia, enfoque hidrodinamico • Platelets –Impedancia, enfoque hidrodinamico • Hb – SLS-Hb (555 nm) (oxihemoglobina + sodio lauril sulfato) • Ht – Detección de pulsos acumulativos – Medición indirecta: • MCV, MCHC y MCH (calculados) – RDW y MPV(CV de sus respectivos histogramas) – WBC Diferencial • Detección con DC/RF • Emplea lísis diferencial – Reticulocitos • Colorante Supravital (Aramina O) • Detección Fluorescente
  • 46. ABBOTT • Principios de Medición – Medición directa: • RBC – Impedancia • WBC – Dispersión óptica (primaria), Impedancia (secondaria) • Plaquetas – Impedancia (2-30 fl) • Hb – Cianomethemoglobina modificada (540 nm) • MCV – volumen medio de RBC (histograma) – Medición Indirecta: • Hct, MCHC y MCH (calculados) – RDW (valor relativo equivalente al CV) – WBC Diferencial • MAPSS – Reticulocitos • Coloración proprietaria • Dispersión Multiángulo • Detección Fluorescente
  • 47. SIEMENS • Principios de Medición – Medición directa: • RBC – Enfoque hjdrodinámico, láser de bajo y alto ángulo • WBC - Enfoque hjdrodinámico, dispersión óptica y absorpción • Platequetas – Enfoque hidrodinámico, láser de ángulo bajo y alto(1-60 fL) • H¡b – Cianomethemoglobina modificada (546 nm) • MCV – volumen medio de RBC (histograma) – Medición indirecta: • Ht, MCHC y MCH (calculados) – RDW y MPV (CV de sus respectivos histogramas) – WBC Diferential • VCS – volumen, conductividad, dispersión – Reticulocitos • Coloración Supravital (Oxazina 750) • Dispersión óptica de bajo y alto ángulo
  • 48. Pentra 120 Retic Horiba-ABX Sysmex XT-4100i CELL-DYN RUBY Abbott Laboratories LH 780 Beckman Coulter CELL-DYN 3700 ADVIA 2120 SIEMENS
  • 49. LH 1500 Series Automation Beckman Coulter CELL-DYN WorkCell Abbott Laboratories
  • 50. MANTENIMIENTO • Limpieza diaria • Conteo del lecturas de fondo • Chequeos electrónicos • Comparar los modos abierto y cerrado (usando muestra normal) • Correr controles (dentro de lo límites especificados)
  • 51. ASEGURAR FUNCIONAMIENTO ADECUADO 1. Chequear los contenedores de reactivo:  Verificar cantidad suficiente  Verificar fecha de vencimiento  No deben visualizarse precipitados, ni turbidez ni mostrar un color inusual  Conecciones adecuadas entre el instrumento y los contendedores
  • 52. 2. Chequear contenedor de desecho:  Capacidad suficiente  Conecciones adecuadas 3. Realizar inicio diario 4. Verificar que exista una aceptable:  Reproducibilidad  Arrastre  Resultados de control ASEGURAR FUNCIONAMIENTO ADECUADO
  • 53. AUTOMATIZACIÓN EN HEMOSTASIA
  • 54. HEMOSTASIA = BALANCE plaquetas Coagulación Fibrinólisis Organismo HemorragiaTrombosis
  • 55. FASES DE LA HEMOSTASIA • Hemostasia primaria formación de un trombo plaquetario • Coagulación o hemostasia secundaria formación de un trombo de fibrina • Fibrinólisis rotura del coagulo de fibrina
  • 56. Factores procoagulantes Factores anticoagulantesFXI I FXIIa FXI FXIa FIX FIXa FIXa FXa FVIIIa FX FVa FII TROMBINA Fibrinógeno Fibrina FT FVIIa AT PCa PS TFPI Si hay déficit, HEMORRAGIA Si hay déficit, TROMBOSIS CASCADA DE LA COAGULACIÓN
  • 57. OBTENCIÓN DE LA MUESTRA Plasma con anticoagulante citrato trisódico Na3C6H5O7 . 2H20 al 0.109 mol/L (3.2%) Sangre venosa recolectada en un tubo con citrato de sodio a una proporción de 1:10 ( 1 parte de citrato y 9 partes de sangre). Tiempo de compresión no mayor a 60 seg. Un tiempo mayor puede elevar los valores de fibrinógeno.
  • 58. ALMACENAMIENTO DE LAS MUESTRAS Las muestras deben mantenerse a temperatura ambiente (18 – 25°C). El almacenamiento en hielo o en la nevera puede provocar la activación de los factores VII y XII. Estabilidad de las muestras (18 – 25°C) : TP : 8 horas APTT : 4 horas (terapia con heparina 2 horas) Factores : 4 a 8 horas
  • 59. CONGELAMIENTO DE LAS MUESTRAS Los plasmas libres de plaquetas se pueden alicuotar y congelar. El congelamiento se debe realizar tan pronto como sea posible, de preferencia a –80°C; es suficiente a –20°C si es por un período corto ( 6 meses PT y APTT; 3 meses TT y Factores). Las muestras se deben descongelar a 37° C por 15 minutos y sólo una vez.
  • 60. PRUEBAS DE LABORATORIO RUTINA PT APTT T. TROMBINA FIBRINÓGENO ESPECIALES FACTORES TROMBOSIS LA – AC. ANTICARDIOLIPINA PROTEÍNA C PROTEÍNA S APC – R ANTITROMBINA FIBRINÓLISIS DÍMERO D PLASMINÓGENO TPA (Activ.Plasm.Tisular) PAI – 1 (Inhib.Act. Plasm.)
  • 61. MÉTODOS DE DETECCIÓN
  • 62. MÉTODO MANUAL Detección por aparición del coágulo
  • 63. MÉTODO MECÁNICO Método del garfio de Koller
  • 64. MÉTODO MECÁNICO Método KC Amelung Billa de metal estacionaria
  • 65. MÉTODO FOTOMÉTRICO
  • 66. SISTEMA DE DETECCIÓN BASADO EN LA VISCOSIDAD
  • 67. La detección está basada en el incremento de la viscosidad del plasma analizado. El incremento de la viscosidad es medido a través del movimiento de la billa de metal
  • 68. Cuando se añade el reactivo, inmediatamente se inicia la detección.
  • 69. El cronómetro inicia la medición cuando la billa inicia la oscilación de derecha a izquierda.
  • 70. Cuando el coágulo aparece, la viscosidad se incrementa y la amplitud disminuye.
  • 71. MÉTODO Coagulométrico: formación de fibrina Fibrinógeno ----------------> Fibrina Tiempo de Coagulación : Tiempo empleado para detectar la formación de fibrina. TROMBINA turbidimetría
  • 72. ANÁLISIS CENTRÍFUGO  Pipeteo automático de muestra + reactivo.  Mezcla por centrifugación  Nefelometría hasta 1200 lecturas por cada determinación (ej. TP)
  • 73. Sistema Centrífugo Reactivo Muestra Rotor
  • 74. MÉTODO • Cromogénico: incremento de color Peptido-pNa ---------------> Peptido + pNa ENZIMA Color (Sust. Cromogénico)
  • 75. Sustratos Cromogénicos Luz transmitida Cubeta de reacciónFuente de luz 405 nm Detector180º
  • 76. MÉTODO • Inmunológico: incremento de la turbidez Plasma + reactivo de látex--> aglutinación Reacción del antígeno presente en el plasma con anticuerpo (unido a las partículas de látex) específico al analito a estudiar. turbidimetría
  • 77. Reacción inmunológica Luz transmitida Cubeta de reacciónFuente de luz 671/405 nm Detector180º
  • 78. Partículas de Latex con anticuerpo sensible al Dímero-D Las partículas de látex se aglutinan, la suspensión tiene mas absorbancia INMUNOTURBIDIMETRIA INMUNOENSAYO TURBIDIMÉTRICO
  • 79. Dímero-D ▬ Dímero-D +
  • 80. Tiempo CURVA DE REACCIÓN INMUNOTURBIDIMÉTRICA Delta Medida de la turbidez inicial y de la turbidez final producida por la aglutinación de las partículas de latex Turbidez (mAbs) Inicial Final
  • 81. SIEMENS BCS XP
  • 82. STA – COMPACT
  • 83. STA – COMPACT
  • 84. STA – COMPACT
  • 85. ACL ELITE PRO
  • 86. Fluídrica • Botella de 1 L de solución de lavado/referencia con sensor nivel y medición de líquido en tiempo real. • 2 dilutores de pistón para dispensado y aspiración de muestras/reactivos.
  • 87. Inlet T- Line Centrifuga Destapador Outlet Conexiones Hematología Stockyard
  • 88. ¡MUCHAS GRACIAS ! jcaceres1@terra.com.pe jcacerestorres@yahoo.com