1. 25/09/2007
Título de la práctica:
Reconocimiento y uso del material de laboratorio
Fundamento de la práctica:
Familiarizarse con el material de laboratorio, aprender como se utiliza, sus
posibles usos y la localización de los distintos materiales dentro del aula.
Materiales utilizados:
Bateas
Olla
Autoclave
Estufa de cultivos
Estufa de secado del material
Matraz aforado
Embudo de líquidos y embudo de sólidos
Matraz Erlenmeyer
Mortero
Cubetas para tinción
Vaso de precipitados
Pipetas, micropipetas
Centrífuga
Placa Petri
Fotocolorímetro
Fotodensitómetro
Quitasato
Frasco lavador
Tubos Eppendorf
Cámaras de Neubauer
Microscopio
Probeta
Bureta
Vidrio de Reloj
Contenedor desechable
Papel Parafilm
Portapreparaciones
Reflotrón
Procedimiento:
A continuación se señalan los materiales anteriormente
citados que se observaron en el laboratorio y se citan ciertas
características de ellos:
Matraz aforado: Son generalmente de forma ovoide,
fondo plano y cuello estrecho y alto con tapón esmerilado,
construido en vidrio fino. En el cuello llevan un trazo circular
que marca el aforo o enrase y que indica la capacidad del mismo.
En las paredes se indica además de la capacidad del mismo, la
1
2. temperatura a la que debe utilizarse. Se utilizan para preparar soluciones valoradas o de
concentración definida y para diluir muestras a volumen fijo.
Probetas: Son vasos altos graduados, de forma cilíndrica con un pie que les confiere
cierta estabilidad; las hay de tamaño variables, generalmente
desde 5 cc hasta 1 litro. Presentan un pico que sirve para
verter los líquidos más fácilmente. Su uso más frecuente es
para medir y dispensar volúmenes de líquido que requieren
poca precisión.
Pipetas: Son tubos de vidrio de poco diámetro, abiertos a
ambos lados, terminando en punta por el inferior de salida del
líquido, regulando esta con el dedo índice, que rapa el orificio
de la parte superior. Se utilizan pata transferir o verter un
volumen determinado de líquido. Existen de varios
volúmenes. Deben llevar
grabada en su pared la
capacidad y un código de color distinto según el
volumen al que están calibradas.
Micropipetas: Son pipetas utilizadas para
transferir pequeñas
cantidades de líquido.
Contienen volúmenes desde
1 a 1000 microlitros y
pueden ser de volumen fijo
o variable.
Buretas: Son largos tubos graduados con una
llave en un extremo denominada robinete u otro elemento para detener el
flujo de líquido y un extremo afinado en la punta para dispensar el
líquido. En su parte superior está ligeramente ensanchada en forma de
embudo a lo largo de ella va grabada la graduación, generalmente en cc
y décima de cc. Se utilizan para dispensar volúmenes conocidos de
líquido en un recipiente.
Matraz Erlenmeyer: Son matraces de fondo redondo y cuello estrecho,
llevan una escala volumétrica orientativa y se fabrican de varios
tamaños. Los kitasatos son matraces Erlenmeyer que llevan una boquilla
lateral para poder conectar a vacío. Se utilizan
para filtración esterilizante de sustancias o muestras que
contienen elementos que no soportan las altas temperaturas del
autoclave.
Vaso de precipitados: Son anchos de
paredes anchas y cilíndricas. Presentan
un pico que sirve para verter los líquidos
más fácilmente. Se utilizan para la
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3. preparación de reactivos como contenedores de soluciones que haya que someter a
agitación mecánica.
Embudos: Los más utilizados se emplean para transferir
líquidos o sólidos a otros recipientes y como soporte del papel
de filtro en el proceso de filtración.
Mortero: Se utiliza para pulverizar y homogeneizar sustancias
sólidas.
Frascos lavadores: Se utilizan para contener agua destilada
Vidrio de reloj: Láminas cóncavas para pesar sólidos.
Cubetas de tinción: Se utilizan para teñir por inmersión.
Tubos de ensayo: Se utilizan para contener la muestra o
analizar o efectuar reacciones en ellos.
Gradillas: Sirven de soporte para tubos de ensayo.
Contenedor desechable: Se utiliza para retirar el material
potencialmente contaminante
Papel Parafilm: Se utiliza para tapar los tubos de ensayo.
Baños de calentamiento: Se utilizan para mantener a temperatura constante material y
sustancias que así lo requieran.
Estufas: La estufa de desecación se utiliza para el
secado del material, la estufa de cultivos se utiliza en
microbiología para incubar los cultivos de
microorganismos.
Centrífugas: Se utilizan para separar sangre coagulada
o celular del suero o plasma y para aclarar líquidos
orgánicos.
Fotocolorímertro: Se utiliza sobre todo para la
determinación de hemoglobina.
Cámara de Neubauer: Se utiliza para el recuento de glóbulos rojos, blancos y plaquetas.
Procedimiento:
Se ha examinado el material y se han aprendido nociones básicas sobre su
utilización.
3
4. 2/10/2007
Título de la práctica:
Pipeteo
Fundamento de la práctica:
Aprender a utilizar todo tipo de pipetas
Materiales utilizados:
Pipeta de 10 cm3
Pipeta de 5 cm3
Pipera de 1 cm3
Pipeta Pasteur
Vaso de precipitados
Batea
Chupete o prepipeta
Tubos de Ensayo
Gradilla
Procedimiento:
En primer lugar se procede a la elaboración de la solución que se va a pipetear;
en una probeta de 1l. se vierten aproximadamente 1l. de agua, a continuación se echan
una cierta cantidad de lugol (Yodo + Yoduro potásico), no hace falta verter un
determinado volumen, ya que solo es para darle un color al agua y así poder apreciar
mejor las cantidades pipeteadas.
El procedimiento es sencillo, con las distintas pipetas se van cogiendo distintos
volúmenes, dependiendo de la capacidad
de cada pipeta, y se van echando en los
tubos de ensayo, p ej. con una pipeta de 1
ml. procedemos a coger su valor máximo
de medida,1 ml. ,observamos que no
haya error de paralaje (es aquel que se
produce en la lectura del aforo, al parecer
que esta línea se mueve dependiendo de
la altura a la que sea observada) y una
vez comprobado esto se procede a pasar
el volumen al tubo de ensayo.
Hay que tener especial cuidado con las
micropipetas que son las más sensibles y
su mala utilización puede llevar a la
pérdida del material.
4
5. 4/10/2007
Título de la práctica:
Observación de una muestra en el microscopio
Fundamento de la práctica:
Familiarizarse con el funcionamiento del microscopio, aprender a enfocar
muestras en fresco, diferenciar en la muestra los Gr,,gb, y plaquetas
Materiales utilizados:
Microscopio
Portaobjetos
Cubreobjetos
Lanceta
Alcohol
Gasa
Procedimiento:
1. Con una lanceta se pincha al paciente en el
dedo, normalmente el dedo índice, para que
aumente el riego sanguíneo ha de calentarse la
zona.
2. Antes de puncionar se limpia la zona con
alcohol y se seca con una gasa estéril.
3. Se desecha la primera gota, una vez echa la
extracción, la sangre se recoge en un capilar o
tubo de ensayo.
4. Se deposita una gota de sangre en el
portaobjetos
5. Inmediatamente después se coloca el cubre
encima del porta, evitando la formación de
bolsas de aire en la muestra.
6. Procedemos a colocar la muestra en el microscopio.
7. Accionando el revolver, seleccionar el objetivo adecuado. Se sabe que el
objetivo esta correctamente seleccionado cuando se percibe un audible clic.
Generalmente se empieza enfocando con un objetivo de poco aumento y luego
se pasa a otro de mayor aumento. Si se hace esto, basta con mover ligeramente
el micrométrico para enfocar la muestra con este ultimo objetivo.
8. Bajar completamente la platina y colocar la preparación sobre ella, teniendo
cuidado de no ponerla al revés.
9. Accionando los tornillos reguladores de la platina, desplazar la preparación
hasta situar la muestra sometida a estudio sobre el orificio de paso de luz.
Encender la fuente de luz y regularla a una intensidad media para evitar que se
sobrecaliente.
10. Situar el condensador:
- Bajo, si se utiliza un objetivo de poco poder de ampliación (10 x).
- En la mitad de su recorrido, si se emplea un objetivo de gran
5
6. poder de ampliación (40 x).
- Alto, si se usa un objetivo de inmersión (100 x).
También conviene ascender el condensador si se observa una
muestra desecada y tenida, y descenderlo si se estudia una muestra
"en fresco".
11. Mirando por fuera de los oculares, hacer ascender la platina con el
tornillo
macrométrico hasta
que el objetivo este
muy cercano a la
preparación.
Cuando se utiliza un
objetivo de poco poder
de ampliación, el
aparato tiene un tope
que impide un acer-
camiento excesivo de
aquel a la
preparación.
Sin embargo, si se emplea el objetivo de inmersión, previamente
hay que depositar una pequeña gota de aceite sobre la
preparación y, posteriormente, hacer ascender la platina hasta que
aquel toque el aceite pero no la preparación.
12. Ajustar la distancia interpupilar.
13. Moviendo el tornillo macrométrico, hacer descender lentamente la
platina hasta que se vea, mirando por los oculares, la imagen de la
muestra.
Con el objetivo de inmersión, este nunca debe separarse tanto de
la preparación como para perder el contacto con el aceite.
14. Afinar el enfoque con el tornillo micrométrico.
15. Desplazando horizontalmente la platina con movimientos en zig-zag,
recorrer con el objetivo toda la preparación, para realizar una
correcta observación de la misma.
16. Durante la observación, mover continuamente el tornillo
micrometrico, para enfocar
sucesivamente todos los pianos de la
muestra.
17. Una vez finalizada la observación,
hacer descender totalmente la platina
y retirar la preparación.
18. Apagar la fuente de luz.
Resultados:
Los glóbulos rojos frescos son de
color anaranjado verdoso sin movilidad
intrínseca. Pueden observarse aislados o
agrupados en "pilas de monedas", que son
mas frecuentes en ciertas patologías de las proteínas plasmáticas.
Los glóbulos blancos o leucocitos vivos si son células móviles, ya que tienen un
extremo activo que produce seudópodos y facilita el desplazamiento. Los que tienen esta
6
7. capacidad mas desarrollada son los linfocitos.
Las plaquetas no tienen movilidad y tienden a agregarse formando acúmulos.
Interpretación de los resultados:
En la muestra de sangre podemos observar la forma normal de los eritrocitos y
las formas patológicas si las hubiera (drepanocitos, acantocitos, etc.).
También es posible ver la presencia de parásitos hemáticos vivos, como puede ser el
tripanosoma o las microfilarias.
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8. 9/10/2007
Título de la práctica:
Realización y tinción de un frotis sanguíneo
Fundamento de la práctica:
Las extensiones sanguíneas se llevan a cabo deslizando un porta sobre otro en
el que se ha depositado previamente una gota de sangre.
Con esto se obtiene una fina capa de células sanguíneas que puede ser
adecuadamente observada con el microscopio.
En la tinción el frotis se sumerge durante un tiempo determinado, 5 inmersiones
de 1 segundo en cada cubeta, y se utiliza un fijador que es el metanol.
Materiales utilizados:
Tubo con EDTA
Portatubos
Aguja
Alcohol
Algodón
Compresor
2 Portaobjetos
Guantes
Pipeta Pasteur
Solución alcohólica de metanol
Solución tamponada de eosina
Solución tamponada de azul de metileno
Procedimiento:
En primer lugar precederemos a la extracción de sangre para a continuación
hacer la extensión o frotis sanguíneo, actuaremos de la siguiente manera:
1. Palpar el sitio donde queremos
puncionar(venas cefálica, basílica o cubital
media)
2. Desinfectar con alcohol.
3. Para escoger el lugar de punción, se escogen
venas que sintamos, no venas que veamos.
4. El compresor, el cual debemos de colocar,
no puede esta puesto mucho tiempo ya que
puede provocar un éxtasis sanguíneo.
5. Realizar un análisis de la dirección de la
vena.
6. Si pincho y no sale sangre puede ser debido
a:
• Pinchar al lado de la vena pero no la vena
• Pinchar superficialmente
• Pinchar la vena pero atravesada
7. Pinchar siempre en la dirección de la vena.
Si se pincha mal, sacar el compresor, la aguja y volver a intentarlo.
8
9. Con jeringa se retira un poco el émbolo para saber si se ha pinchado bien viendo
sangre.
El puño se abre una vez encontrada la canalización de la vena.
Este procedimiento se repite en todas las prácticas hechas en el laboratorio en
las que necesitemos sangre.
La técnica para realizar la extensión sería la siguiente:
A. Con los dedos índice y pulgar de una mano, sujetar un extremo del porta
normal (porta soporte), a nivel de sus bordes, y situarlo sobre una mesa.
También puede apoyarse, simplemente, el porta soporte sobre el
extremo del dedo corazón de la mano que lo sujeta. De esta forma, el
porta soporte forma un ángulo con la mesa.
B. Con una pipeta pasteur
coger un poco de
sangre problema,
depositar una pequeña
gota de esta (de unos 5
µl) en la cara superior de
ese porta, a no menos de 2
cm del extremo opuesto al
que agarra la mano.
C. Colocar un extremo del porta esmerilado (porta difusor o extensor) un
poco por delante de la gota de sangre y formando un ángulo de 45° con
el porta soporte. Es conveniente utilizar siempre el mismo porta
extensor, para adaptarlo a esta función.
D. Desplazar suavemente hacia atrás el porta extensor, hasta que alcance la
gota de sangre.
E. Dejar que la gota se extienda, por capilaridad, a lo largo del extremo del
porta extensor que toca el porta soporte.
F. Antes de que la sangre alcance los bordes de ese extremo, deslizar el porta
extensor hacia delante, con un movimiento firme y uniforme, y a una
velocidad media. Este deslizamiento debe acabar, aproximadamente, a
1 cm del extremo final del porta soporte, con un movimiento de
ascensión del porta extensor.
G. Secar rápidamente la extensión, agitándola al aire, para que sus células
no se distorsionen.
H. Escribir el nombre del enfermo, en el porta que soporta la extensión.
Una vez hecha la extensión comenzar con la tinción, usaremos la tinción panóptica:
1. Colocar la muestra en un cestillo para portas
2. Introducir la
muestra en la
primera cubeta
para tinción que
contiene
metanol, esto
fijará la
extensión, 5
inmersiones de 1
segundo,
escurrir.
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10. 3. Introducir la muestra en la segunda cubeta para tinción que contiene
eosina, 5 inmersiones de 1 segundo también, escurrir.
4. Introducir la muestra en la tercera cubeta que contiene azul de metileno, 5
inmersiones de 1 segundo, escurrir
5. Lavar con agua y esperar a que seque.
Resultados:
Depositamos una gota de aceite de inmersión sobre el frotis y observamos con
el objetivo de 100X.
Analizamos si el frotis y la tinción están bien realizados.
El frotis será correcto si:
• Tiene las dimensiones adecuadas
• No tiene artefactos provocados por anticoagulantes
• No tiene artefactos provocados por técnicas defectuosas de extensión
• No tiene artefactos provocados por defectuosa fijación o coloración
• No tiene artefactos provocados por defectos del portaobjetos
• Otros defectos a la hora de realizarlo, contaminación por polvo,
hemólisis...
La tinción será correcta si:
• La tinción no es excesivamente rosada o azulada
• Tiene ausencia de precipitados
• Se diferencian bien las estructuras subcelulares en los leucocitos.
Interpretación de los resultados:
Dependiendo de la zona del frotis podemos leer, linfocitos, realizar la
fórmula leucocitaria y visualizar neutrófilos y monocitos.
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11. 11/10/2007
Título de la práctica:
Hematocrito
Fundamento de la práctica:
El HCT puede determinarse por métodos manuales o por métodos automáticos.
Los métodos manuales consisten en la centrifugación de la sangre, aplicándola una
fuerza de 2.000 a 5.000 g (macrometodo) o de 12.000 a 15.000 g (micrometodo).
Los métodos automáticos pueden basarse en 2 principios:
• El calculo matemático del HCT a partir de los valores de RBC y de volumen
corpuscular medio, obtenidos electrónicamente con anterioridad.
• El análisis de la sombra que produce la población eritrocitaria, al reflejarse en un
campo oscuro.
Con los métodos manuales también se cuentan, junto con el volumen de los
hematíes, el de los leucocitos, el de las plaquetas y el del plasma que queda
atrapado entre los hematíes. Por ello, el valor de HCT conseguido con métodos
automáticos es mas exacto y suele ser 1 o 2 unidades mas bajo que el logrado con
métodos manuales.
Materiales utilizados:
• Tubos capilares.
Si la muestra es sangre capilar, estos han de estar heparinizados interiormente;
mientras que si la muestra es sangre venosa y ha sido adecuadamente
anticoagulada, pueden no estar heparinizados. Los heparinizados tienen una franja
roja en uno de sus extremos.
• Plastilina.
• Algodón o gasas.
• Una centrifuga de microhematocrito. Esta consta de una
especie de plato horizontal-con unos surcos para colocar
los capilares, y permite aplicar una fuerza centrifuga de
12.000 a 15.000 g durante un tiempo controlado
automáticamente.
Una regla milimetrada o un lector de microhematocrito.
Procedimiento:
1°. La determinación ha de hacerse por duplicado.
2°. Llenar cada tubo capilar con la sangre, hasta las 3/4 partes de su longitud. El
Llenado se efectúa por capilaridad y se realiza poniendo en contacto uno de los
extremos del tubo capilar con la gota de sangre, o introduciéndolo en el tubo de
sangre e inclinando este, posteriormente, para facilitar el proceso.
3°. Limpiar el exterior de cada tubo con un trozo de algodón o con una gasa.
4°. Sellar el extremo de cada tubo por el que ha entrado la sangre con plastilina. Para
11
12. ello, se hace penetrar el tubo en la plastilina, o incluso se atraviesa esta con aquel.
5°. Colocar, debidamente equilibrados, los tubos en la centrifuga. En ella los
tubos se sitúan con su extremo tapado hacia afuera, ajustados al borde exterior y
adecuadamente encajados en sus surcos.
6°. Centrifugar los tubos a unas 12.000 g durante 5 minutos.
Resultados:
Puede realizarse de 2 maneras:
• Midiendo las columnas formadas en el interior de cada tubo con una simple
regla milimetrada y calculando, seguidamente, el porcentaje que le corresponde a
la columna de eritrocitos, mediante una sencilla regla de tres
• Mediante un lector de
microhematocrito
Interpretación de los resultados:
El valor normal del HCT
esta comprendido entre el 42 y
el 47% en las mujeres, y entre el
45 y el 52% en los varones.
Un valor bajo del HCT suele
ser signo del padecimiento de
una anemia. Sin embargo, hay
falsos descensos del HCT
ocasionados por hemodilucion
Paradójicamente, el HCT suele
ser normal en la fase más
temprana de las hemorragias agudas, pues en estas se pierden células y plasma en la
misma proporción.
Un valor alto del HCT suele ser signo del padecimiento de una poliglobulina. Sin
embargo, también hay engañosos ascensos del HCT producidos por
hemoconcentracion (por ejemplo, el de la deshidratación).
Se puede hacer un cálculo aproximado del n° de hematíes por mm3 de sangre, silos
hematíes son de forma, tamaño y contenido en hemoglobina normal. La relación entre
el n° de hematíes y el hematocrito es una constante K
Hematocrito x K = N° hematíes / mm3 siendo K = 110.000
Resultados obtenidos:
Hemos obtenido un hematocrito de 44, por tanto la concentración de hematíes será
44 x 110.000= 440.000 hematíes/ mm3
Para saber si se ha procedido correctamente, tendremos que comparar nuestro resultado
con el obtenido en la cámara de recuento.
12
13. 11/10/2007
Título de la práctica:
Recuento de hematíes
Fundamento de la práctica:
Para el recuento en cámara de glóbulos rojos, se diluye la sangre problema en
un líquido apropiado y posteriormente se deposita en la cámara de recuento, donde
se cuentan las células presentes en algunos cuadrados de uno de los retículos.
Materiales utilizados:
• Unoppete de 1,99 ml.
• Capilar de 10
μl
• Una cámara
de recuento
Neubauer..
• Un cubre
(hay unos
cubres
especiales
para su use
en recuentos
con cámara).
• Un
microscopio.
• Líquido de dilución. Este debe ser isotónico con el plasma, para evitar la
alteración morfológica e incluso la lisis de los hematíes. El mas utilizado
es el de Hayem, que se compone de las siguientes sustancias:
- 2,5 g de sulfato sódico.
- 0,5 g de cloruro sódico.
- 0,25 g de cloruro mercúrico.
- 100 ml de agua destilada.
• Sangre capilar obtenida por punción del pulpejo de un dedo o sangre
venosa procedente de una punción venosa y anticoagulada con EDTA.
Procedimiento:
1. Situar un cubre sobre el retículo de la cámara. Para facilitar su
adhesión a esta, se ejerce una ligera presión al tiempo que se desliza el
cubre sobre las bandas laterales, previamente humedecidas con H2O, de su
porción central.
2. Aspirar la sangre con la pipeta hasta llenarle al tope.
3. Limpiar cuidadosamente el exterior de la pipeta con un algodón y sin
hacer bajar el nivel de sangre.
13
14. 4. Se echa la sangre en el unoppete y se diluye con el líquido de
Hayen.
5. Una vez disuelta se
aspira con la pipeta
el líquido necesario
para la cámara.
6. Desechar las
3 primeras gotas
emitidas por la
pipeta. Estas
corresponden al
líquido presente en
el tubo capilar largo
de la pipeta de
Thoma, que no esta
mezclado con la
sangre.
7. Depositar la
siguiente gota entre
la cámara y el
cubre. Esto se
realiza ubicándola
en uno de los
bordes no
adheridos del cubre
y dejándola que
penetre por
capilaridad, en el
espacio existente
entre ambas
estructuras. Durante
esta operación hay que evitar que se formen burbujas y que rebose la
sangre diluida por fuera de los bordes del cubre. Para ello, se coloca la
pipeta en posición casi vertical, se sitúa la punta de la pipeta en el borde
apropiado, se disminuye algo la presión ejercida por el dedo índice sobre
el otro extremo de la pipeta y se retira esta justo antes de que se llene
completamente el espacio comprendido entre el cubre y la cámara.
8. Dejar reposar la sangre diluida, contenida en la cámara, durante
unos minutos, para que las células presentes en ella puedan sedimentarse.
9. Enfocar el retículo con el objetivo de 40 x y con el condensador a
baja altura, y verificar que la distribución de los hematíes es homogénea.
10. Contar los hematíes presentes en 80 cuadrados pequeños del cuadrado
grande central. Esto se logra, por ejemplo, contando los hematíes que hay
en los 4 cuadrados medianos de las esquinas y en el del centro.
Resultados:
Calcular el n° de hematíes que hay por mm3 de sangre. Para ello primero hemos
de calcular el volumen de la solución en la que hemos contado los hematíes:
Superficie de un cuadrado pequeño 0.05 x 0,05 = 0,0025 mm2.
Superficie de 80 cuadrados pequeños 80 x 0,0025 = 0,2 mm2.
14
15. Volumen de 80 cuadrados pequeños 0,2 x 0,1 = 0,02 mm2.
Siendo R el n° de hematíes contados en los 80 cuadrados pequeños, vamos a calcular la
cantidad de sangre de la que provienen estos hematíes, teniendo en cuenta que la
dilución hecha es de 1/200, tendremos:
200,mm 3 de solución___________1 mm3= de sangre
0,02 mm 3 de solución__________x mm3 de sangre
x = 1/110.000 mm 3 .de
sangre
1110.000 mm 3 de sangre__________R hematíes
I mm 3 de sangre________________Y hematíes
Y=R•10.000.
Esto quiere decir que debemos multiplicar el no de hematíes que hemos contado
en los 80 cuadrados pequeños por 10.000 y obtendremos los hematíes por mm3 sangre.
Interpretación de los resultados:
La disminución del RBC se produce en las anemias y su aumento se da en las
policitemias.
VALORES NORMALES:
Hombre: 4.600.000 a 5.180.000 hematíes/ mm3.de sangre.
Mujer: 4.200.000 a 5.400.000 hematíes/ mm3.de sangre.
6 4 8 7
8 6 6 2
7 8 6 7
5 3 7 5
Cuadrado 1
15
17. 18/10/2007
Título de la práctica:
Resistencia Globular Eritrocítica
Fundamento de la práctica:
El estudio de la fragilidad osmótica de los hematíes valora la resistencia de los
eritrocitos a soluciones de presión osmótica decreciente, en condiciones constantes de
pH y de temperatura. Para ello, se enfrentan los hematíes problema a soluciones
tamponadas de cloruro sódico cuya concentración es decreciente a partir de 9 gramos
por mil (soluciones hipotónicas).
Cuando los eritrocitos están en contacto con soluciones hipotónicas, penetra agua a
través de su membrana y se hinchan. Al hincharse los hematíes, una parte de la Hb que
contienen puede salir al exterior a través de los poros de su membrana. Si la entrada de
liquido es excesiva, los hematíes se rompen y dejan libre toda la Hb que engloban
(hemólisis).
En condiciones normales, un eritrocito puede aceptar sin hemolizarse una entrada de
agua que incremente su volumen en un 70% como máximo.
Esta prueba evalúa por tanto la capacidad que tienen los glóbulos rojos de soportar un
incremento tenido acuoso (resistencia osmótica eritrocitaria o ROE).
Dentro de una misma sangre la ROE de los hematíes varia de unos a otros.
Materiales utilizados:
• Tubos de hemólisis.
• Pipetas de 1 o 2 ml. graduadas para medir cantidades del orden de 0,01 mL
• Solución de NaCl al 1% (preparada mediante desecación del NaCl y
agua destilada hervida de 5 a 10 minutos para eliminar el oxigeno) y
agua destilada.
• La muestra será sangre preferiblemente heparinizada.
Procedimiento:
Partiendo del sodio cloruro al 1% preparamos las siguientes diluciones:
10 ml a10,85%, 10ml al 0,75%..., es decir diluciones cada vez mas hipotónicas.
Para ello se puede aplicar C1.V1= C2.V2
Se pipetea en 13 tubos de hemólisis 2ml de cada dilución en cada uno de ellos, a
cada tubo añadimos 0,02 ml=20 microlitros de sangre. Mezclamos por inversión e
incubamos a temperatura ambiente durante 30 minutos.
Se homogenizan suavemente y se centrifugan durante 5 minutos a 2000 r.p.m.
LECTURA:
Se anota la concentración del primer tubo donde comienza la hemólisis, que se
percibe par la aparici6n de una tonalidad roja en la solua6n y la concentración
primera del tubo donde se produce la hemólisis total, que se percibe por un intenso
color rojo en la solución y escasa o ningún sedimento de hematíes.
Resultados:
VALORES NORMALES
Resistencia mínima o inicial no debe aparecer a concentraciones superiores al
17
18. 0,45% ya que indicaría que la resistencia osmótica estaría disminuida.
Resistencia máxima o total en condiciones normales corresponde concentraciones
inferiores al 0,3%
En general los hematíes más jóvenes (recién salidos de MO) son más resistentes
que los viejos ya circulantes. Después de grandes hemorragias, la resistencia está
aumentada debido a la mayor cantidad de células jóvenes en sangre.
A la hora de la lectura, según avanzamos en el número de tubos el depósito de hematíes
es menor, llegando al número 13 donde no hay número de hematíes. La hemólisis va
aumentando según disminuye la concentración.
Hayamos la resistencia mínima en torno al 0,42-0,46 % y la resistencia máxima en torno
al 0,30-0,34 %.
Interpretación de los resultados:
Cuando la ROE baja, aumenta la hemólisis en los tubos que contienen solución
salina a mayor concentración. Esto sucede en la esferocitosis hereditaria, en la
eliptocitosis u ovalocitosis congenita y en la estomatocitosis hereditaria, debido a que
en estas enfermedades la superficie de los hematíes esta disminuida con respecto a su
volumen, por lo que estos toleran peor la entrada de agua y tienen aumentada su
fragilidad osmótica.
Cuando la ROE sube, la aparici6n de la hemólisis se retarda y empieza a
18
19. nivel de tubos que contienen solución salina a una concentración menor que lo
previsto. Esto acontece con los reticulocitos y con los glóbulos rojos propios de la
talasemia minor y de la anemia ferropenica, debido a que estas células tienen
incrementada su superficie en relación con su volumen, por lo que toleran mejor la
entrada de agua y tienen disminuida su fragilidad osmótica.
19
20. 8/11/2007
Título de la práctica:
Recuento de Glóbulos blancos
Fundamento de la práctica:
Se efectúa igual que el de hematíes, con la diferencia de que usaremos la pipeta de blancos y
el líquido de Turk para hacer la dilución. Debemos dejar la pipeta en reposo unos
minutos para dejar que actué el agente hemolizante y destruya los hematíes. A continuación
mezclaremos el contenido de la pipeta agitando un poco y desechando las primeras gotas
cargaremos la cámara de la misma forma que para el recuento de hematíes. Seguidamente,
después de dejar sedimentar las células, la llevaremos al microscopio y procederemos a
hacer el recuento de la misma manera que se hace el de hematíes, contando en este caso
los 4 cuadrados grandes de las esquinas.
Materiales utilizados:
• Una pipeta diluidora de glóbulos blancos, para recuento de glóbulos
blancos.
• Un tubo de goma con boquilla, adaptable a la pipeta diluidora.
• Una cámara de recuento Neubauer.
• Un cubre (hay unos cubres especiales para su use en recuentos con
cámara).
• Un microscopio.
• Líquido de dilución. El liquido de dilución mas utilizado es el de Turck,
que se compone de las siguientes sustancias:
- 2 ml de acido acético glacial.
- 1 ml de solución acuosa de violeta de genciana al 1%.
- 100 ml de agua destilada.
El acido acético produce la lisis de los eritrocitos sin alterar a los
leucocitos. El violeta de genciana tiñe el núcleo de los leucocitos para que estos puedan
observarse mejor. El violeta genciana puede ser sustituido por azul de metileno.
• Sangre capilar obtenida por punción del pulpejo de un dedo o sangre
venosa procedente de una punción venosa y anticoagulada con EDTA.
Procedimiento:
Es el mismo procedimiento que
para el recuento de glóbulos rojos, pero se
cuentan los 4 cuadrados, más grandes, de
las esquinas de la cámara.
Resultados:
Volumen de 4 cuadrados grandes = 0,4 mm3.
Siendo B en n° de leucocitos contados en
los 4 cuadrados grandes y teniendo en cuenta
que la dilución en este caso es de 1/20,
tendremos:
20
21. 20 mm 3 de solución___________1 mm 3 de sangre
0,4 mm 3 de solución___________ x mm 3 de sangre
x = 0,02 mm 3 de
sangre
0,02 mm 3 de sangre_______________ B leucocitos
1 mm 3 de sangre_________________ leucocitos
Y leucocitos = B •
50.
Esto quiere decir que multiplicando por 50 el n° de leucocitos contados en 4
cuadrados gran - des obtenemos directamente el n° de leucocitos por mm'.de sangre.
Interpretación de los resultados:
La disminución del R.G.B se produce en las leucopenias, su aumento se da en
leucocitosis.
VALORES NORMALES:
De 4.500 a 11.000 leucocitos /mm3.de sangre.
1 2 4 4
1 1 2 4
1 3 5 1
2 3 1 5
Cuadrado 1
1 4 3 4
2 4 2 4
3 2 1 4
8 2 1 5
Cuadrado 2
3 4 3 1
2 3 2 0
4 1 1 1
3 2 2 1
Cuadrado 3
21
22. 4 7 3 8
4 3 0 1
3 4 3 1
3 2 3 2
Cuadrado 4
20 mm 3 de solución___________1 mm 3 de sangre
0,4 mm 3 de solución___________ x mm 3 de sangre
x = 0,02 mm 3 de
sangre
0,02 mm 3 de sangre_______________ 177 leucocitos
1 mm 3 de sangre_________________ Y leucocitos
Y leucocitos = 177
• 50= 8850.
El resultado final del recuento de Glóbulos Blancos es 8850 leucocitos/mm 3 de sangre,
los resultados están dentro de la normalidad, de 4.500 a 11.000 leucocitos /mm3.de
sangre.
13/11/2007
22
23. Título de la práctica:
Determinación de la Hemoglobina
Fundamento de la práctica:
Se basa en la transformación de la hemoglobina en cianmetahemoglobina
mediante los siguientes pasos:
En primer lugar el Fe2+ de la hemoglobina, en presencia de ferricianuro
potásico, se oxida a Fe3+, dando lugar a la metahemoglobina.
Posteriormente, y en presencia de cianuro potásico, la metahemoglobina pasa a
cianmetahemoglobina. Este es un compuesto estable, de color rojo, con un pico de
absorción máximo a 540 nm y cuya concentración puede ser determinada por métodos
calorimétricos empleando un patrón de concentración conocida.
Materiales utilizados:
• tubos de ensayo
• Pipetas de seguridad
• Espectrofotómetro o
fotocolorimetro
• Cubetas para colorimetría
• Reactivo de Drabkin:
-Ferricianuro potásico 20 mM
-Cianuro potásico 43 mM
-Conservantes y estabilizantes
• Estándar equivalente a 20 mg de
hemoglobina/dl.
• Sangre total anticoagulada con
EDTA.
Procedimiento:
Preparamos tres tubos rotulados como B y P y M. Tendremos gran precaución al
pipetear el reactivo de Drabkin, ya que contiene cianuro potásico y es muy toxico.
B P M
Muestra (ml) - 0'01 0'01
Reactivo (ml) 5'0 5'0 5'0
El tubo B es el blanco de reactivos, porque el reactivo de Drabkin es de color
amarillo y, aunque en condiciones normales su absorbancia debe ser cero, nos
aseguramos de no incluir errores en la técnica. Lo utilizamos como blanco de la técnica
y hacemos la lectura del problema frente a el.
El tubo P es el patrón, se lee directamente, ya que esta preparado como
cianmetahemoglobina equivalente a una concentración de hemoglobina de 20 g/dl.
Dado que no precisa manipulación, y que es estable en condiciones de conservación
adecuadas, no es necesario medir su absorbancia (D.O.) en cada determinaciónn.
23
24. El M es la muestra, donde se mezcla el problema con el reactivo de Drabkin.
Encendemos el fotocolorímetro o el espectofotómetro y procedemos de la
siguiente forma:
1. Introducimos la fecha
2. Pulsamos para la medición de absorvancias
3. Técnica colorimétrica monocomática
4.Utiliza
mos una
longitud
de3 onda
de 546
que es la
que más
se
acerca.
5.Selecci
onamos
para que
termostate una temperatura de 25 ºC
6. Esperamos 5 minutos mientras que está termostatando y luego
procedemos a la medición de las absorvancias
Cálculos:
Los cálculos para saber la concentración son una simple regla de 3, ya que conocemos
la concentración del patrón (indicada en la caja de él) y la absorbancia medida
anteriormente.
Procedemos así:
Concentración patrón absorbancia patrón
X= concentración muestra absorbancia de la muestra
15 g/dl patrón 0.145
X= 13,1 g/dl muestra 0,127
Interpretación de los resultados:
Los valores normales son:
Hombres: 14-18 g/dl.
Mujeres: 11-16 g/dl.
Niños: 10-14 g/dl.
24
25. La muestra medida daba como concentración 13,1 g/dl por lo tanto está dentro
de la normalidad.
En este caso, es preferible hablar de valores de referencia, ya que existen
diferencias notables entre zonas geográficas y grupos étnicos donde existen ciertas
anemias carenciales que afectan a un número elevado de la población.
15/11/07
Título de la práctica:
25
26. Determinación cuantitativa del hierro
Fundamento de la práctica:
En primer lugar, el hierro ferrico presente
en la muestra y unido a la transferrina es
liberado por la acción de guanidinio.
Seguidamente, el hierro ferrico libre es
reducido a ferroso por la
hidroxilamina.
Posteriormente, el hierro ferroso
reacciona con la ferrozina para producir
un complejo coloreado. Finalmente, la
intensidad de formación del complejo
coloreado es medida
espectrofotometricamente.
Material:
• tubos de plástico de un solo uso.
• Un rotulador de vidrio.
• 2 pipetas graduadas de 1 ml.
• 1 pipeta automática capaz de dispensar
200 µl.
• Puntas de pipeta automática.
• 3 cubetas de espectrofotometría.
• Un espectrofotómetro.
• Reactivos
R1 Citrato pH 2,2 50 mmol/L
Tampon
R2 Acido ascorbico 113,5 mmol/L
Reductor _
R3 TPTZ 9,6 mmol/L
Color
IRON CAL Patrón primario acuoso de Hierro 100 μg/dL
__
Reactivo de trabajo (RT): Disolver el contenido de un vial de R 2 Reductor en un
frasco de R 1 Tampón.
Tapar y mezclar suavemente hasta disolver su contenido. Estabilidad del reactivo
de trabajo: 1 mes en nevera (2-8 °C). R3: Listo para su uso.
Procedimiento:
Es una técnica que se desarrolla en dos pasos
Blanco Patron Muestra
RT (mL) 1,0 1,0 1,0
26
27. Patrón (μl) -- 250 -
Muestra (μl) - -- 250
1. Se vierte en la cubeta un poco de agua destilada y se mide su absorbancia
2. Se prepara la muestra patrón y se mide su absorbancia
3. Se prepara y se mide la absorbancia de la muestra problema
4. Se añade una gota de R3 (TPTZ) a cada tubo, se mide su absorbancia de cada
uno.
Longitud de onda: ..........595 nm (550-600)
Cubeta:...............................1 cm paso de luz
Temperatura .....................37°C / 30°C / 25°C Ajustar el espectrofotómetro a cero
frente a agua destilada. Pipetear en una cubeta.
Cálculos:
Absorvancias medidas:
Blanco Patron Muestra
1º Medicion 0,000 0.515 0.477
2º con TPTZ 0,000 0.021 0.105
(A2- A1) Muestra X 100 (conc. patrón) = μg/dl de Fe en muestra
(A2- A1) Patrón
(0,477- 0,105) Muestra X 100 (conc. patrón) = 83,3 μg/dl de Fe en muestra
(0,515- 0,021) Patrón
Interpretación de los resultados:
VALORES DE REFERENCIA
Hombres: 65 - 145 μg/dL (11,6- 31,3 μmol/L)
Mujeres: 40 - 150 μg/dL (7,16 - 26,85 μmol/L).
Estos valores son orientativos. Es recomendable que cada laboratorio establezca sus
propios valores de referencia.
El resultado obtenido ha sido 83,3 μg/dl de Fe en muestra, este resultado se
encuentra dentro de los valores normales
27
