Your SlideShare is downloading. ×
teknologi dna rekombinan
teknologi dna rekombinan
teknologi dna rekombinan
teknologi dna rekombinan
teknologi dna rekombinan
teknologi dna rekombinan
teknologi dna rekombinan
teknologi dna rekombinan
teknologi dna rekombinan
teknologi dna rekombinan
teknologi dna rekombinan
teknologi dna rekombinan
teknologi dna rekombinan
teknologi dna rekombinan
teknologi dna rekombinan
teknologi dna rekombinan
teknologi dna rekombinan
teknologi dna rekombinan
teknologi dna rekombinan
teknologi dna rekombinan
teknologi dna rekombinan
teknologi dna rekombinan
teknologi dna rekombinan
teknologi dna rekombinan
teknologi dna rekombinan
teknologi dna rekombinan
teknologi dna rekombinan
teknologi dna rekombinan
teknologi dna rekombinan
teknologi dna rekombinan
teknologi dna rekombinan
teknologi dna rekombinan
Upcoming SlideShare
Loading in...5
×

Thanks for flagging this SlideShare!

Oops! An error has occurred.

×
Saving this for later? Get the SlideShare app to save on your phone or tablet. Read anywhere, anytime – even offline.
Text the download link to your phone
Standard text messaging rates apply

teknologi dna rekombinan

5,355

Published on

0 Comments
3 Likes
Statistics
Notes
  • Be the first to comment

No Downloads
Views
Total Views
5,355
On Slideshare
0
From Embeds
0
Number of Embeds
0
Actions
Shares
0
Downloads
238
Comments
0
Likes
3
Embeds 0
No embeds

Report content
Flagged as inappropriate Flag as inappropriate
Flag as inappropriate

Select your reason for flagging this presentation as inappropriate.

Cancel
No notes for slide

Transcript

  • 1. PRINSIP TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN DEBBIE S. RETNONINGRUM SEKOLAH FARMASI INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNGSekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 1
  • 2. PUSTAKA 1. Glick, BR and JJ Pasternak, 2003, Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA,hal. 47-89 dan 101-110 2. Groves MJ, 2006, Pharmaceutical Biotechnology, hal. 44-55 3. Brown TA, 2006, Gene Cloning & DNA analysis, hal. 3-6 dan 8-12; 54-80 dan 87-97Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 2
  • 3. TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN • Rekombinasi antara molekul DNA dari organisme berbeda: fenomena umum di alam. • Corynebacterium diphtheriae yang diinfeksi oleh virus β menghasilkan toksin yang bertanggung jawab terhadap gejala difteri. • Perubahan genetik dalam bakteri ini disebabkan oleh virus dan merupakan suatu rekayasa genetik dalam alam.Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 3
  • 4. TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN • Duplikasi fenomena alam di laboratorium • Mengembangkan metode introduksi berbagai informasi genetik ke dalam suatu organisme. • Manipulasi genetik E. coli dan Bacillus subtilis (bakteri) Saccharomyces cerevisiae (ragi) • Produksi bahan mahal atau tidak mungkin dibuat secara tradisional.Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 4
  • 5. CONTOH PRODUK REKOMBINAN – ANTIBODI REKOMBINAN – PROTEIN TERAPEUTIK: insulin, interferon, albumin serum manusia, hormon pertumbuhan manusia, aktivator plasminogen jaringan, antithrombin, faktor pembekuan darah, limfokin, faktor nekrosis tumor, dismutase superoksida, dan gonadotropin manusia – VAKSIN: hepatitis B, herpes, influenza, malaria – VAKSIN DNA – TERAPI GENSekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 5
  • 6. CONTOH PRODUK REKOMBINAN – PRODUK PERTANIAN: tanaman tahan penyakit, resistensi pestisida, bioinsektisida, fiksasi nitrogen – PRODUK BIOREMEDIASI: pengurai lemak/minyak, penghilangan herbisida, pendegradasi pestisidaSekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 6
  • 7. TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN (KLONING GEN)• PENYEDIAAN DNA: SISIPAN DAN VEKTOR (Ex: PLASMID)• LIGASI: PENGGABUNGAN DNA SISIPAN DAN VEKTOR (= VEKTOR REKOMBINAN)• TRANSFORMASI: TRANSFER INFO GENETIK KE SEL INANG & PERBANYAKAN DNA• SELEKSI: SEL YG MENGANDUNG PLASMID/ VEKTOR REKOMBINAN• DETEKSI: KEBERADAAN DNA SISIPAN, KEBENARAN DNA SISIPAN (UKURAN DAN URUTAN NUKLEOTIDA) 1972 Stanley Cohen dan Herbert BoyerSekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 7
  • 8. TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN (KLONING GEN) DNA kromosom DNA Potong dengan enzim restriksi plasmid ligasi DNA rekombinan transformasi sel transforman 1 sel tumbuh jadi 1 koloni klonSekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 8
  • 9. Kloning DNA ke PlasmidSekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 9
  • 10. SUMBER DNA SISIPAN • TIGA PENDEKATAN: – KEPUSTAKAAN DNA (DNA LIBRARY): DNA GENOMIK – PRODUK PCR – mRNA cDNA (eukariot)Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 10
  • 11. Kepustakaan genomik (genomic library) • Koleksi klon yang jumlahnya cukup mencakup semua gen dari suatu organisme • Contoh ukuran genom: – Bacillus anthracis: 5,1 – 5,2 Megabasa – Escherichia coli: 4 Megabasa – Pseudomonas putida: 6,0 – 6,1 Megabasa – Staphylococcus aureus: 2,9 MegabasaSekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 11
  • 12. KROMOSOM vs PLASMIDSekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 12
  • 13. PLASMID • DNA UNTAI GANDA • BERBENTUK LINGKARAN • BERSALINAN TINGGI • BERUKURAN KECIL (MUDAH DIMANIPULASI) • DAPAT BEREPLIKASI SENDIRI DI DALAM SEL • DAPAT DISISIPI DNA ASING (DNA SISIPAN) • ADA DUA GEN MARKER: – UNTUK MENDETEKSI ADANYA VEKTOR – UNTUK MENDETEKSI ADANYA DNA SISIPANSekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 13
  • 14. VEKTOR (Plasmid) • VEKTOR KLONING HANYA UNTUK MENDAPATKAN DNA • VEKTOR EKSPRESI UNTUK MENDAPATKAN PROTEIN (tambahan komponen untuk mempermudah proses “downstream”/pemurnian)Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 14
  • 15. Beberapa contoh vektor kloningNama Tipe Sel inang KeteranganpBR322 Plasmid E. coli Resistensi terhadap ampisilin, tetrasiklin. Vektor untuk tujuan umumpUC8 Plasmid E. coli Resistensi terhadap ampisilin, skrining lac. Vektor untuk tujuan umumpBluescript Plasmid E. coli Resistensi terhadap ampisilin, skrining lac.λgt10 Bakteriofaga E. coli Kloning cDNAYEp24 Plasmid E. coli/ragi Resistensi ampisilin. Vektor ragi shuttleSekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 15
  • 16. PETA PLASMIDSekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 16
  • 17. ENZIM RESTRIKSI • MEMBATASI PERTUMBUHAN VIRUS PADA INFEKSI VIRUS PADA BAKTERI • TIPE II: DIGUNAKAN PADA DNA REKOMBINAN • MEMOTONG IKATAN FOSFODIESTERASE • MENGENALI URUTAN PALINDROM 5’ GAATTC 3’ 3’ CTTAAG 5’Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 17
  • 18. ENZIM RESTRIKSI & LIGASE DNA (enzim restriksi) DNA (ligase) 5’- NNNGAATTCNNN -3’ 5’- NNNGOH PAATTCNNN -3’ 3’- NNNCTTAAGNNN -5’ 3’- NNNCTTAAP OHGNNN -5’ EcoRI ligase 5’- NNNGOH PAATTCNNN -3’ 5’- NNNGAATTCNNN -3’ 3’- NNNCTTAA P OHGNNN -5’ 3’- NNNCTTAAGNNN -5’ • Sisi pengenalan enzim restriksi • Urutan nukleotida rantai atas = Urutan nukleotida rantai bawahSekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 18
  • 19. CONTOH ENZIM RESTRIKSI • EcoRI (Escherichia coli galur R): G↓AATTC (ujung lancip) • BamHI (Bacillus amyloliquefaciens): G↓GATCC (ujung lancip) • BglII (Bacillus globigii): A↓GATCT (ujung lancip) • SalI (Streptomyces albus): G↓TCGAC (ujung lancip) • PstI (Providencia stuartii 164): CTGCA↓G (ujung lancip) • HindIII (Haemophilus influenzae): A↓AGCTT (ujung lancip) • KpnI (Klebsiella pneumonia): GGTAC↓C (ujung lancip) • XbaI (Xanthomonas bradii): T↓CTAGA (ujung lancip) • HaeIII (Hemophilus aegyptius): GG↓CC (ujung tumpul)Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 19
  • 20. Kloning Produk PCR PCR Ligasi S. pyogenes M12 Gen ska pGEMT rekombinan SDM Transformasi E. coli XL-Blue pGEMT/skaSekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 20
  • 21. LIGASI PRODUK PCR KE pGEM-T ligasi Transformasi A A + Gen ska pGEM-T pGEM-T E. coli JM109 REKOMBINANStreptococcus pyogenes Kontrol – Kontrol + E. coli pGEM-T REK LB/Amp LB/Amp LB/Amp/X-Gal/IPTG Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 21
  • 22. Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 22
  • 23. Transformasi • info genetik ditransfer ke sel inang dengan metode transformasi • Sel inang dibuat kompeten (siap menerima “DNA asing”) → modifikasi struktur dinding sel • Metode transformasi : heat shock/elektroporasiSekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 23
  • 24. Seleksi Transforman Sel kompeten Transformasi Seleksi Biru-PutihSekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 24
  • 25. SELEKSI BIRU PUTIH • MENGETAHUI APAKAH DNA SISIPAN SUDAH ADA? • PADA MCS TERDAPAT GEN lacZ (MENGKODE GALAKTOSIDASE) • X-GAL → BIRU • DNA SISIPAN AKAN MERUSAK GEN lacZ → GALAKTOSIDASE TIDAK DIPRODUKSI → X-GAL TIDAK DIURAIKAN → PUTIHSekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 25
  • 26. Deteksi keberadaan DNA sisipan • Analisis migrasi • Analisis restriksi Elektroforesis gel • PCR • Penentuan urutan DNA sisipan (sekuensing)Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 26
  • 27. ELEKTROFORESIS GEL • Gel agarosa atau poliakrilamid • DNA bermuatan negatif (ada gugus fosfat): bergerak dari kutub negatif ke kutub positif • DNA bermigrasi tergantung dari ukurannya: migrasi DNA ukuran kecil > ukuran besar • Visualisasi: – etidium bromida / Syber Green (DNA berfluorosensi dengan pemaparan UV)Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 27
  • 28. Elektroforesis Gel AgarosaJoe Sambrook dan Bill Sugden: elektroforesis gel agarose untuk DNASekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 28
  • 29. KONFIRMASI pGEM-T REKOMBINAN 1 2 Isolasi pGEM-T/ska (kit Qiaprep, Qiagene) Ukuran plasmid tanpa DNA sisipan < 1 = pGEM-T rekombinan ukuran plasmid dengan DNA sisipan 2 = pGEM-T tanpa DNA sisipanSekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 29
  • 30. KONFIRMASI pGEM-T REKOMBINAN Isolasi Plasmid Rekombinan Analisis Restriksi pGEM-T rekombinan 1 2 3 1 2 Koloni PutihKoloni pGEM-T (3000 bp) Koloni BiruBiru 1419 pb 881 pb 517 pb DNA sisipan Elektrogram hasil isolasi plasmid koloni biru dan putih : 1. Koloni biru 2. Koloni putih 3. Koloni biru Elektrogram hasil restriksi Nde/BamHI 1. Marka pUC19/HinfI 2. Hasil Pemotongan NdeI/BamHI Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 30
  • 31. HASIL PENENTUAN URUTAN NUKLEOTIDA DNA SISIPAN (DNA Sequencing)Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 31
  • 32. HASIL SEKUENSING Bandingkan urutan hasil sekuensing dg urutan DNA sisipan asal (Analisis homologi/kesamaan – program BLAST dari NCBI)Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 32

×