Molbiol 2011-wetlab

463 views
382 views

Published on

0 Comments
0 Likes
Statistics
Notes
  • Be the first to comment

  • Be the first to like this

No Downloads
Views
Total views
463
On SlideShare
0
From Embeds
0
Number of Embeds
0
Actions
Shares
0
Downloads
6
Comments
0
Likes
0
Embeds 0
No embeds

No notes for slide

Molbiol 2011-wetlab

  1. 1. Wet Lab Смирнов АрсенийПензенцева Евгения
  2. 2. 2
  3. 3. ДНК(4 нуклеотида: А, Т, G, C) 3
  4. 4. Выделение ДНК 4
  5. 5. Выделение ДНК 5
  6. 6. Оценка качества и количества ДНК• Электрофорез• Спектрофотометрия• Флуорометрия спектрофотометрия элетрофорез С*µg/ml] = А260 x K K (dsDNA) = 50 K (ssDNA) = 37 K (ssRNA) = 40 А260 /А280 = 1,8-1,9 – чистая ДНК 6
  7. 7. Электрофорез 7
  8. 8. ПлазмидыСостав вектора:• Ориджин репликации• Селективный маркёр• Полилинкер 8
  9. 9. pBluescript II SK (+) 9
  10. 10. Севенирование ДНК - прочтение последовательностиКлассические методы:• Максам-Гилберт (химическое)• Сэнгер (энзиматическое) 10
  11. 11. Секвенирование (Сэнгер) 11
  12. 12. Автоматическое секвенирование 12
  13. 13. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)– метод, позволяющий избирательно синтезировать большие количестваопределённых фрагментов ДНК• «Полимеразная» - используется фермент ДНК-полимераза• «Цепная» - состоит из повторяющихся циклов,количество ДНК с каждым циклом увеличивается вгеометрической прогрессии 1983 г, Кэри Муллис 13
  14. 14. Компоненты ПЦР Праймеры Определяют амплифицируемый участок dNTP «Строительный материал» Моновалентные катион необходим для оптимальной KCl гибридизации праймеровБуфер Tris Поддержание оптимального для ферментативной реакции рН MgCl2 Бивалентный катион необходим для работы фермента Полимераза Осуществляет синтез ДНК Матрица Анализируемый образец ДНК 14
  15. 15. Суть ПЦР 15
  16. 16. Этапы ПЦР Предварительная ~950C 1-10 мин денатурация Денатурация ~950C 10-60 сек25-50 циклов Отжиг 50-700C 10-60 сек Элонгация 68-720C 10-180 сек Финальная 68-720C 7-10 мин элонгация 16
  17. 17. АмплификаторыТермостатирование:• твёрдый термоблок (элемент Пельтье)• жидкость• поток воздуха 17
  18. 18. ПЦР в реальном времени (Real-time PCR)• одновременная амплификация и измерение количества продукта• наличие флюоресцентного красителя в смеси• наличие оптического блока в амплификаторе линейный lg 18
  19. 19. Системы детекции1. Неспецифичные – интеркалирующие красители (SYBR Green и др.)2. Специфичные – линейные разрушаемые пробы (TaqMan) – «молекулярные маячки» (beacons) – примыкающие пробы 19
  20. 20. Линейные разрушаемые пробы (TaqMan = Taq-polymerase + Pac-Man) 20
  21. 21. Фармакогенетика препаратов для лечения тромбозов Непрямые антикоагулянты: варфарин кумарин аценокумарол фенпрокумон 21
  22. 22. Заболевания, при которых назначают непрямыеантикоагулянты:•Венозные тромбозы•Легочная тромбоэмболия•Тромбоэмболические осложнения, связанные с мерцательной аритмией итрансплантацией сердечных клапанов•Инфаркт миокарда: снижение риска смерти, повторного инфаркта миокардаи случаев тромбоэмболических осложнений 22
  23. 23. Нежелательные лекарственные реакции (НЛР) – кровотечения.МНО (международное нормализованное отношение).При применении варфарина частота кровотечений достигает 25%.Факторы риска кровотечений при применении непрямыхантикоагулянтов:• Сопутствующие заболевания• Применение других препаратов• Нарушение дозировки• Индивидуальная чувствительностьНепрямые антикоагулянты – антагонисты витамина К1 23
  24. 24. Метаболизм витамина К1 (factor II, VII, IX, X, protein C, S, Z) 24
  25. 25. Полиморфизм гена CYP2C9Аллельные варианты гена:– CYP2C9*1 – нормальная каталитическая активность 1075 430 CGT ATT Exon 3 Exon 7 Arg Ile– CYP2C9*2 (Arg144Cys) - пониженная каталитическая активность 1075 430 TGT ATT Exon 3 Exon 7 Cys Ile– CYP2C9*3 (Ile359Leu) – выраженная пониженная каталитическая активность 1075 430 CGT CTT Exon 3 Exon 7 Arg Leu 25
  26. 26. Снижение дозы варфарина в зависимости от генотипа CYP2C9 (Lindh et al.,2009)Частоты аллелей в европейской популяции:CYP2C9*2 – 10%, CYP2C9*3 – 6% 26

×