TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR

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TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR: se denomina así a todas las técnicas de laboratorio que se usan para aislar ADN o extraerlo en alta pureza, visualizarlo para ver su estado, cortarlo y pegarlo, amplificar una región en una enorme cantidad de moléculas.

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TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR

  1. 1. II Semestre Facultad de me medicina ZOHAR ESTRADA CASSIANI DANIELA CASTILLO CRISMATT FRANCO ALANDETE VICTOR HUGO
  2. 2. En principio se denomina así a todas las técnicas de laboratorio que se usan para aislar ADN o extraerlo en alta pureza, visualizarlo para ver su estado, cortarlo y pegarlo, amplificar una región en una enorme cantidad de moléculas (clonación de fragmentos en bacterias u otros vectores como virus , PCR Etc.
  3. 3. Todas estas técnicas tiene diversas aplicaciones generalmente en el diagnóstico de enfermedades hereditarias, búsqueda de alelos mas o menos frecuentes asociados a una característica que nos interesa seleccionar, diagnóstico de contaminación bacteriana en alimentos , diagnóstico viral o de infección viral (VIH, Hepatitis C, PIF, otros), selección de marcadores moleculares para asistir en el mejoramiento genético de una especie, test de paternidad, diagnóstico de identidad forense, etc.
  4. 4. La primera técnica que todas las demás necesitan es la extracción del ADN, y para ello es necesario purificarlo desde cualquier tejido aunque usualmente se hace a partir de sangre. Se basa en una serie de lavados de la muestra y agregado de proteinasas que eliminan las proteínas del medio, detergentes para eliminar las membranas plasmáticas y luego ir purificando el ADN de esa mezcla de ARN proteínas y restos celulares.
  5. 5. La figura muestra el pellet de células a partir del cual se obtendrá el ADN Así se ve el ADN recién extraído en alcohol.
  6. 6. Conocer: • Los fundamentos de la técnica de amplificación de ADN por PCR • Usos y aplicaciones de PCR • Ventajas y desventajas del PCR
  7. 7. • Es la amplificación de ADN in vitro por medio de la polimeracion de cadena de ADN utilizando un termociclador. • Es propósito del PCR es hacer muchas copias de un fragmento de ADN • Se realiza la amplificación de un segmento especifico de ADN, teniendo poco material disponible.
  8. 8. • Fue diseñada por el Dr. Kary Mullis en 1987 • Gano el premio nobel de química en 1993 por su invento • Utilizo el PCR para amplificación del gen de β- hemoglobina humana, y el diagnostico prenatal de anemia falciforme.
  9. 9. • La PCR se realiza en un “ thermo cycler” o termociclador * Es una maquina que calienta y enfría la reacción de periodos cortos de tiempo.
  10. 10. 1: DESNATURALIZACION: Consiste en separar la doble hebra de ADN y convertirla en hebra sencilla. Típicamente se usa a una temperatura de 25°C – 95°, Por 15 a 40 segundos El tiempo depende del tamaño del genoma
  11. 11. 2: APAREAMIENTO O “ANNELING”: Los cebadores “primers” previamente diseñados, reaccionan con la hebra sencilla del ADN y se pega a lugares específicos por complementariedad de base. Por eso se deja bajar la temperatura Ej: 55° C por 30 segundos. La temperatura y el tiempo puede variar entre cebadores según sea el caso.
  12. 12. 3. POLIMERACION O EXTENSION. Una polimerasa de ADN extiende los “primers” en el espacio comprendido entre ambos “primers”, y coloca dinucleotidos trifosfatados (dNTP´s) de 5´a 3´leyendo el ADN de 3´a 5. de esta forma se sintetiza la secuencia complementaria de las hebras de ADN molde.
  13. 13. • En un principio, la polimerasa de ADN que se utilizaba era de bacterias E.Coli, pero esta es sensitiva a altas temperaturas, por lo que había que añadir enzimas fresca al comenzar el tercer ciclo. • Se remplazo la enzima por la de la bacteria “ thermus aquaticus” conocida como Taq pol
  14. 14. • La detección del producto de la PCR se realiza normalmente mediante corrido electroforético. • Dependiendo del tamaño de la amplificación y la resolución que deseamos utilizaremos diferentes medios (agarosa, poliacrilamida) a distintas concentraciones.
  15. 15. La posterior visualización se puede realizar por bromuro de etidio (lámpara de luz UV) Tinción de plata, fluorescencia, radioactividad
  16. 16. • Detección de agentes infecciosos como : hepatitis B y C, papiloma virus, VIH, entre otros. • Análisis de ADN de cualquier organismo vivo o muerto, análisis de fósiles. • Mutagénesis dirigida (cambios en la información contenida a través de los “primers” con mutaciones) • Investigación forense • Pruebas de paternidad
  17. 17. • A partir de una muestra pequeña de ADN se puede obtener una cantidad considerable para el estudio que se vaya a realizar. • El proceso se puede utilizar para clonar, secuenciar y análisis. • Se puede amplificar el ADN de cualquier organismo vivo o muerto. • Sus aplicaciones son multiples, análisis prenatales, etc. medicina forense, diagnostico,
  18. 18. • Se puede reproducir solamente parte del genoma en donde se conoce por lo menos una mínima secuencia 20 – 40 pd • Se necesitan “primers” específicos que sean complementarios al fragmento que se desea sintetizar. • La polimeracion puede tener errores al sintetizar el ADN. • Puede contaminarse con otro ADN (puede ser del mismo investigador o de cualquier otro)
  19. 19. Electroforesis en gel es una de las principales herramientas de la biología molecular. El principio básico es ADN, ARN, y proteínas que pueden ser separadas por medio de un campo eléctrico. El ADN y ARN pueden separarse de tamaño ejecutando el ADN a través de un gel de agarosa. Las proteínas pueden separarse de tamaño mediante el uso de un gel de SDS-PAGE Se utiliza generalmente con propósitos analíticos, pero puede ser una técnica preparativa para purificar moléculas parcialmente antes de aplicar espectrometría de masa, PCR, clonación o secuenciación de ADN.
  20. 20. Son un tipo de biochip : es un dispositivo a pequeña escala, análogo a un circuito integrado, ensamblado de moléculas orgánicas asociadas a organismos vivos En este caso las moléculas orgánicas son fragmentos de ADN seleccionados del genoma. Estos microrrays son pequeños dispositivos de cristal con orificios rellenos de ADN marcados con sustancia fluorescente
  21. 21.  Para detectar anomalías del ADN (delecciones , duplicaciones, etc.)  Para diagnosticar enfermedades que causan alteraciones en el ADN: ( Cáncer, Esquizofrenia, Autismo etc.)  Para simples diagnósticos.  Para reparar genes alterados.
  22. 22. EDWIN SOUTHERN DESARROLLO ESTA TECNICA EN 1975
  23. 23.  Sirve para detectar por hidrolisis la presencia de una porción de ADN en una muestra.  Fundamento: complementariedad de bases  Se diseña una sonda con nucleótidos marcados que sean complementarios al sector de ADN buscado.  El sector de ADN buscado puede ser un gen, o parte del mismo. Se puede utilizar para el diagnostico molecular de patologías genéticas.
  24. 24. HIBRIDACION.  La doble hebra de ADN se forma por complementariedad SONDAmuestra (una de las hebras es la sonda en simple cadena y la otra es la muestra en simple cadena)  Los nucleótidos de la sonda están marcados P 32 (radiactivos) si al revelar hay marcador radiactivo presente, esta en la muestra analiza la secuencia complementaria a la sonda.
  25. 25.  Se agrega la sonda sobre la membrana y se incuba  Se lava para quitar el máximo de hibridaciones inespecificas.  Se revela por auto radiografía.
  26. 26.  Extracción del ADN Fragmentar en ADN en porciones mas pequeñas (enzimas de restricción) Separo los fragmentos realizando una corrida electroforética usando como sustrato de migración un gel (separación por tamaño)
  27. 27.  Desnaturalización con solución salina alcalina ( SIMPLE CADENA)  Transferencia a soporte solido (membrana de nylon / nitrocelulosa): por capilaridad o electroforesis: pasan del gel a la membrana.  Se agrega solución (NaCl) para evitar rehibridación previa al colocar la sonda.
  28. 28.  Es una técnica analítica usada para detectar proteínas especificas en una muestra determinada. Mediante una electroforesis en gel se separan las proteínas.  Las proteínas son transferidas desde el gel a la membrana electroforética
  29. 29. Se utiliza para estudiar los patrones de expresión de un tipo específico de la molécula de ARN como comparación relativa entre un conjunto de diferentes muestras de ARN. Es esencialmente una combinación de desnaturalización electroforesis en gel RNA y una mancha. En este proceso de ARN está separado basado en tamaño y es transferido a una membrana que luego es sondeada con un etiquetado como complemento de una secuencia de interés.
  30. 30.  Seminario de fundamento y procedimiento de las pruebas de WESTERN BLOT http://www.slideshare.net/tratamiento1/fundamento-y-procedimiento-de-las-pruebas-de-westernblot?from_search=4  Newmwdical : técnicas de biología molecular http://www.news-medical.net/health/Molecular-Biology-Techniques-(Spanish).aspx  Blot educativo de genética clásica y estructural (técnicas de biología molecular) http://genmolecular.wordpress.com/tecnicas-de-biologia-molecular/  Amplificación de ADN in vitrio: PCR (polymerase chain reaction) http://www.slideshare.net/svls89/pcr-2899058  Seminario de genética : técnicas de biología molecular http://www.slideshare.net/BernardoOro/tecnicas-de-biologa-molecular  MICRORRAYS DESENMASCARAN ENFERMEDADES ESCONDIDAS http://www.slideshare.net/jkv/micro-arrays-presentation  Wikiperdia: Western blot http://es.wikipedia.org/wiki/Western_blot

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