Extracción y separación de pigmentos de los cloroplastos.

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Extracción y separación de pigmentos de los cloroplastos.

  1. 1. EXTRACCIÓN Y SEPARACIÓN DE PIGMENTOS DE LOS CLOROPLASTOS. CURSO : COMPOSICIÓN BIOQUÍMICA DE ………… ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..PRODUCTOS AGROINDUSTRIALES GRUPO : “B” DOCENTE : ING. CASTRO ZAVALETA VICTOR º…………………………………………………………………………………………………………….ºººººººAUGUSTO. ALUMNO : VEGA VIERA JHONAS ABNER. CICLO: “V” NUEVO CHIMBOTE - PERÚ UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA FACULTAD DE INGENIERIA E.A.P AGROINDUSTRIAL
  2. 2. UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA FACULTAD DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL extrae secar colocan retiran las placas calcular la Rf Macerar. agregar El producto iluminándolo resultados. EXTRACCIÓN Y SEPARACIÓN DE PIGMENTOS DE LOS CLOROPLASTOS.  Fluorescencia  realizar la cromatografía de (TLC) [Más alcohol etílico, seguir macerando y repetir el proceso (No usar más de 60 ml)]. [Se utilizará para observar la fluorescencia de la clorofila]. [Decantar y filtrar (con gasa y/o algodón)]. Espinaca con un poco de alcohol etílico al 95 % 10g [Con el secador de cabello con aire frío, para que no se difunda las gota. Luego se coloca la segunda gota y se repite las operación. Colocar en total no más de 5 gotas]. [Placas en la cuba de cromatografía, se tapa o se cubre con vidrio para no perder la saturación de la misma y se coloca en oscuridad hasta que ascienda el solvente hasta 3/4 partes de la placa (aproximadamente 1 hora)]. [Parte del extracto con una jeringa y aguja para insulina, se coloca una gota del extracto en la parte inferior de la placa a 1 cm del borde blanco inferior]. [luego de haber verifique la separación siempre tomándolas de los bordes, sin tocar la zona blanca].
  3. 3. UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA FACULTAD DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL activan las placas separar Poner extracción de clorofilas y carotenoides Pesar. triturar. Filtrar con vacío Pasar el extracto Esperar unos minutos Añadir  Cromatografía en capa fina, ascendente simple (TLC). [Colocan en el desecador el cual contiene una caja de Petri con sílica gel, hasta que se enfríe]. [Mezcla de los solventes (75:25 éter de petróleo-acetona), en la cuba de cromatografía hasta saturar (tiempo estimado de 1 a 1:30 hs)]. [En una estufa colocándolas a una temperatura de alrededor de 100º C, durante 15 minutos]. Material vegetal (peso fresco) 2g [Mortero con una mezcla de acetona-hexano a partes iguales]. [Reextrayendo si es necesario hasta que la pulpa quede incolora y aforar el filtrado a 25 ml con la mezcla de extracción]. [Obtenido a un embudo de decantación que contiene 10 ml de hexano y añadir unos 25 ml de agua destilada].alcohol metílico saturado de KOH 5ml [Agitar y dejar reposar hasta que se separe la fase alcohólica con las clorofilas saponificadas, y desechar éstas últimas.].
  4. 4. UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA FACULTAD DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL 1. INTRODUCCIÓN. La clorofila es un pigmento de las plantas, que les proporciona su color verde y que absorbe la luz necesaria para la fotosíntesis. La clorofila absorbe principalmente luz violeta roja y azul y refleja luz verde. La abundancia de clorofila en hojas y su ocasional presencia en otros tejidos vegetales es la causa de que esas partes de las plantas aparezcan verdes, pero en algunas hojas la clorofila es enmascarada por otros pigmentos. La extracción y reconocimiento de estos pigmentos es interesante para es estudio y conocimiento de sus propiedades. Los Pigmentos vegetales, que se encuentran en los cloroplastos, son moléculas químicas que reflejan o transmiten la luz visible, o hacen ambas cosas a la vez. El color de un pigmento depende de la absorción selectiva de ciertas longitudes de onda de la luz y de la reflexión de otras. Constituyen el sustrato fisicoquímico donde se asienta el proceso fotosintético. Hay diversas clases de pigmentos: • Clorofilas (a, b, c, d y bacterioclorofilas) de coloración verde. • Accesorios: • Carotenoides (carotenos y xantofilas) de coloración amarilla y roja. • Ficobilinas de coloración azul y roja presentes en las algas verdeazuladas, que comprenden el filo de los Cianofitos. La Clorofila, es el pigmento que da el color verde a los vegetales y que se encarga de absorber la luz necesaria para realizar la fotosíntesis, proceso que posibilita la síntesis de sustancias orgánicas a partir de las inorgánicas (CO2, H2O y sales minerales), mediante la transformación de la energía luminosa en energía química. La clorofila absorbe sobre todo la luz roja, violeta y azul, y refleja la verde. Generalmente la abundancia de clorofila en las hojas y su presencia ocasional en otros tejidos vegetales, como los tallos, tiñen de verde estas partes de las plantas.  PIGMENTOS VEGETALES Los colores que presentan los vegetales son debidos a unos compuestos químicos llamados pigmentos. El color que presenta un determinado órgano vegetal depende generalmente del predominio de uno u otro pigmento o la combinación de ellos. Además, algunos de los pigmentos que condicionan el color están estrechamente ligados a las actividades
  5. 5. UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA FACULTAD DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL fisiológicas del propio vegetal. El color verde en los vegetales es debido a la presencia de dos pigmentos estrechamente emparentados llamados clorofila A y clorofila B. Se encuentran prácticamente en todas las plantas con semilla, helechos, musgos y algas. También aunque aparentemente falten en algunas hojas de color rojo o amarillo, cuando se extraen las otras sustancias colorantes de estas, puede comprobarse incluso allí la presencia de las clorofilas, que estaban enmascaradas por los demás pigmentos. Asociados con las clorofilas, existen también en los cloroplastos dos clases de pigmentos amarillos y amarillo-anaranjados que son los xantofilas y carotenos.  CLOROFILAS En las plantas superiores, la fotosíntesis es posible debido a la presencia en el cloroplasto, concretamente en las membranas tilacoidales, de una serie de pigmentos que tienen capacidad para captar la luz. Existen dos tipos básicos de pigmentos fotosintéticos: Clorofilas. Compuestas por una porfirina que lleva incorporado un átomo de magnesio en el centro del núcleo tetrapirrólico . El ión Mg2* está coordinado con los cuatro átomos de nitrógeno centrales, lo que hace de la clorofila un complejo extraordinariamente estable. La "cabeza" que acabamos de describir, está unida a una "cola", el fitol, que es un alcohol de 20 átomos de carbono. Cabeza y cola se unen a través de un enlace éster en el que intervienen el grupo alcohólico del fitol y el grupo carboxilo de un ácido propiónico que está unido al anillo IV del núcleo tetrapirrólico. Existen varios tipos de clorofilas, las más importantes de las cuales son la "a", y la "b". La clorofila a tiene un grupo -CH3 en el anillo II mientras que la clorofila b tiene un grupo -CHO en esa misma posición. Carotenoides. Actúan como pigmentos accesorios en el proceso de la fotosíntesis. Existen dos tipos de pigmentos carotenoides: carotenos y xantofilas. Los carotenos son hidrocarburos isoprenoides que no contienen oxígeno y están formados por largas moléculas con un sistema de enlaces conjugados alternantes, dobles y sencillos, rematados en cada extremo por un anillo de ciclohexano insaturado- tienen color amarillo-anaranjado.
  6. 6. UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA FACULTAD DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL Las xantofilas tienen una estructura muy similar a la de los carotenos y su diferencia estriba en la incorporación de oxígeno en los extremos de la molécula. Según el grupo que se incorpore existen variedades dentro de las xantofilas. Son de color amarillo. Como se señalo anteriormente la energía lumínica pueda ser utilizada por los sistemas vivos, primero debe ser absorbida y quienes realizan esta función son los pigmentos fotosintéticos. Los pigmentos son sustancias que absorben luz; algunos absorben luz de todas las longitudes de onda y, por lo tanto, parecen negros. Otros, solamente absorben ciertas longitudes de onda, transmitiendo o reflejando las longitudes de onda que no absorben. La clorofila, el pigmento que hace que las hojas se vean verdes, absorbe luz en las longitudes de onda del violeta y del azul y también en el rojo. Dado que refleja la luz verde, parece verde.  CROMATOGRAFÍA Las técnicas cromatográficas para el análisis y purificación de los productos de reacción son ampliamente utilizadas en el laboratorio orgánico. La técnica cromatográfica de purificación consiste en separar mezclas de compuestos mediante la exposición de dicha mezcla a un sistema bifásico equilibrado. Todas las técnicas cromatográficas dependen de la distribución de los componentes de la mezcla entre dos fases inmiscibles: una fase móvil, llamada también activa, que transporta las sustancias que se separan y que progresa en relación con la otra, denominada fase estacionaria. La fase móvil puede ser un líquido o un gas y la estacionaria puede ser un sólido o un líquido. Las combinaciones de estos componentes dan lugar a los distintos tipos de técnicas cromatográficas que aparecen en la siguiente tabla:  Cromatografía de adsorción. Dentro de esta técnica pueden diferenciarse dos tipos de cromatografías de adsorción denominadas cromatografía cromatografía de columna y de capa fina (abreviada TLC, del inglés Thin Layer Chromatography). Para la técnica de cromatografía de adsorción en columna se emplean columnas verticales de vidrio cerrada en su parte inferior con una llave que permita la regulación del flujo de la
  7. 7. UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA FACULTAD DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL fase móvil. Las columnas se rellenan con un adsorbente, como alúmina o gel de sílice (fase estacionaria), mojado con el disolvente que se vaya a emplear en el proceso cromatográfico. En la parte superior de la columna se pone la disolución de la mezcla a separar y a continuación un depósito que contenga el eluyente (fase móvil) que se va a utilizar en la separación. Se abre la llave inferior de manera que el eluyente comience a bajar por la columna. En este proceso, los componentes de la mezcla son adsorbidos por la fase estacionaria con diferente intensidad, de manera que el proceso de adsorción- desorción hace que unos componentes avancen más rápidamente que otros. El líquido que sale por la parte inferior de la columna se recoge de manera fraccionada. Si los componentes de la mezcla avanzan a muy diferente velocidad se podrán obtener fracciones cromatográficas constituidas por un solo componente. En toda cromatografía hablaremos de los siguientes términos: • matriz de la columa. Sustancia que está empapada de solvente y que se empaqueta en la columna. También se denomina el lecho de la columna. • longitud de la columna. Longitud del dispositivo en el que se empaqueta la columna. Es importante en algunos tipos de cromatografía como la de filtración en gel y poco importante en otras como la cromatografía de afinidad. • volumen de la columna. Volumen total de gel que se empaqueta en una columna cromatográfica. • volumen muerto de la columna. Cantidad de solvente que tiene que atravesar la columna para asegurar que se ha reemplazado completamente. Coincide con el volumen de solvente que sale de la columna desde que se aplica la muestra hasta que empieza a salir la primera proteína. En general, y dependiendo del tipo de cromatografía puede ser de 1 a varias veces el volumen de la columna. • 'Run Throught'. Es, en columnas de intercambio iónico o de afinidad, el volumen de solvente más proteínas que atraviesa la columna sin quedar retenido en ella. Correspondería en el caso de la cromatografía de afinidad al volumen de solvente que contiene las proteínas no afines al ligando. 2. OBJETIVOS  Escoger el material adecuado para extraer clorofilas  Aplicar experimentalmente la extracción por solventes  Empacar y desarrollar una columna de fraccionamiento  Indicar los diferentes pigmentos fotosintéticos en la columna de acuerdo a su polaridad
  8. 8. UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA FACULTAD DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL 3. MATERIAL  2 vasos de precipitado de 250 ml  1 vaso de precipitado de 150mL  1 probeta de 100ml  Papel filtro  1 mechero  1 columna cromatografíca (2X20cm)  1 lana de vidrio 1. MATERIAL BIOLÓGICO Hojas de espinaca frescas. 4. PROCEDIMIENTO Se tomar algunas hojas verdes y tiernas de espinacas Se separó los pecíolos y venas grandes de las hojas y posteriormente se picó cada uno de ellas. Se llegó a cortar en pequeñas partes la espinaca Se pesó aproximadamente 10g de espinaca
  9. 9. UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA FACULTAD DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL 4.1. FLUORESCENCIA. Colocar en un mortero trozos de hoja lavadas (quitando las nerviaciones) Se agregó a la espinaca triturada menos de 60ml de alcohol de 99.7° luego se siguió Triturando sin golpear hasta que el líquido adquiera una coloración verde intensa. Filtrar, recogiendo el filtrado en un vaso precipitado. Se obtiene así una solución en alcohol de pigmentos. Se utilizó una gota del líquido de espinaca en la placa.
  10. 10. UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA FACULTAD DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL Cuidadosamente colocamos las placas e el microscopio. Podrimos observar en el microscopio la clorofila α, la cual se obtuvo en mayor cantidad ya que esta es la que constituye aproximadamente el 75% de toda la clorofila en las plantas verdes y se pudo observar de color verde azulado. Seguida por la clorofila beta que fue la que se obtuvo en segundo lugar en cantidad en color verde amarillento.
  11. 11. UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA FACULTAD DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL 4.2. CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA, ASCENDENTE SIMPLE (TLC) Posteriormente añadimos 5ml de alcohol metílico saturado de KOH, previamente agitando y dejando reposar hasta que se separe la fase alcohólica con las clorofilas saponificadas, y luego desechamos los estados últimos quedandándonos de esta manera. Pesamos 2g Trituramos Filtramos En el embudo decantación que contiene 10ml de hexano añadimos 25ml de agua destilada Podrimos observar un arito en la parte inferior de la mezcla de sustancias y esos son los carotenos que la sustancia contenía.
  12. 12. UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA FACULTAD DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL 4.1. REALIZAR LA CROMATOGRAFÍA (TLC) Posteriormente calculamos RF. Luego en el espectrofotómetro medimos la cantidad de energía radiante que absorbe un sistema químico en función de la longitud de onda de la radiación, y a las mediciones a una determinada longitud de onda. La teoría ondulatoria de la luz propone la idea de que un haz de luz es un flujo de cuantos de energía llamados fotones; la luz de una cierta longitud de onda está asociada con los fotones, cada uno de los cuales posee una cantidad definida de energía. Con la solución donde está contenido los carotenos Se procedió extraer todo el liquido. Carotenos Una vez que se verifique la separación se retiran las placas, siempre tomándolas de los bordes, sin tocar la zona blanca; se las coloca sobre una mesa, se marca sobre los costados el frente del solvente (para luego calcular la Rf), luego se seca la placa con el secador de aire frío.
  13. 13. UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA FACULTAD DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL Muestra Nº1
  14. 14. UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA FACULTAD DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL Muestra
  15. 15. UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA FACULTAD DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL CLROFILA A: rojo CAROTENO: anaranjado CLROFILA A: azul CLROFILA B:
  16. 16. UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA FACULTAD DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL CLROFILA B: CLROFILA A: azul CAROTENO: anaranjado CLROFILA A: rojo
  17. 17. UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA FACULTAD DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL 5. DISCUSIÓN Y ANÁLISIS DE DATOS: En esta práctica pudimos observar los distintos pigmentos fotosintéticos que se encuentran dentro de las hojas de espinaca a través de la cromatografía, En primer lugar al romper las células en el mortero los pigmentos que se hallaban encerrados en los cloroplastos dentro de ellas pasan al metanol. En numerosas ocasiones uno de los pigmentos es más abundante y enmascara a los demás que no se pueden observar. como vimos en nuestra introducción, el pigmento más soluble en el metanol es el que forma una banda coloreada en la parte superior. Según Bedui 1993 El color de los alimentos es un atributo que tiene mucho peso dentro del juicio del consumidor, este puede llegar a ser determinante para que un comestible sea aceptado o rechazado. Según Vázquez, 2001 El colorante obtenido de las semillas de achiote (Bixa orellana), esta compuesto en su mayoría por el carotenoide bixina, que se utiliza en la industria láctica, cárnica, condimentaría, cosmética, farmacéutica, etc.; es un colorante natural exento de certificación. La extracción más rudimentaria se basa en un lavado con agua en ebullición y a escala industrial se ha implementado un proceso de extracción alcalino que es de fácil aplicación, pero que tiene el inconveniente de que el producto final contiene al máximo 30 a 40% de pigmentos. Según Richter, 1972 y Barceló Coll et al., 1992 Cuando una solución de clorofila es iluminada con luz blanca o azul se produce un fenómeno de excitación molecular, observable por la emisión de luz de color rojo vinoso intenso. La luz emitida por fluorescencia es siempre de mayor longitud de onda y de menor energía que la luz incidente, pues siempre algo de esa energía se disipa en forma de calor. 6. CONCLUSIONES  Se obtuvieron los pigmentos fotosintéticos de la clorofila, que son los que le dan color a las hojas de las plantas ya que la fotosíntesis es un proceso que permite a los vegetales obtener la materia y la energía que necesitan para desarrollar sus funciones vitales, se lleva a cabo gracias a la presencia en las hojas y en los tallos jóvenes de pigmentos, capaces de captar la energía lumínica.  Se obtuvieron los pigmentos fotosintéticos de la clorofila, que son los que le dan color a las hojas de las plantas ya que, como vimos en nuestra introducción, la fotosíntesis es un proceso que permite a los vegetales obtener la materia y la energía que necesitan para desarrollar sus funciones vitales, se lleva a cabo gracias a la presencia en las hojas y en los tallos jóvenes de pigmentos, capaces de captar la energía lumínica. Gracias a esta práctica, se logró observar cómo cambian las tonalidades de estos pigmentos fotosintéticos que componen a las plantas y se encuentran en los cloroplastos de la célula vegetal y les dan color al reflejar o transmitir la luz visible, además de que son los que constituyen el sustrato fisicoquímico de la fotosíntesis.  Gracias a esta práctica, se logró observar cómo cambian las tonalidades de estos pigmentos fotosintéticos que componen a las plantas y se encuentran en los
  18. 18. UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA FACULTAD DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL cloroplastos de la célula vegetal y les dan color al reflejar o transmitir la luz visible, además de que son los que constituyen el sustrato fisicoquímico de la fotosíntesis.  Los diferentes pigmentos existentes en los alimentos captan diferentes longitudes de onda, de acuerdo a la color aunque pueden coincidir en algunos colores como es el caso de la clorofila a y b que pueden captar colores entre azul y violeta, a diferencia de los carotenos que se encuentran en amarillo y naranja 7. RECOMENDACIONES  Para observar los colores en su naturaleza se recomienda usar papel absorbente para filtrar la cual nos mostrara los colores donde podremos observar de forma natural. Los resultados de colores fueron obtenidos atraves del espectrofotómetro conectado a una computadora que da una lectura de barrido desde 300nm hasta los 900nm.  Se recomienda utilizar alcohol en lugar de agua porque la clorofila no es soluble en agua.  Recomendamos hacer un escurrido con mas calma y repetirlo varias veces ya que no obtuvimos clorofila sino que también los grumos, eso podría ser porque se vertió todo al mismo tiempo y como consecuencia todo bajó. CONTRASTAR He buscado páginas para comparar; en las páginas encontradas que se utiliza alcohol, agua y también una mezcla al 50% de acetona y alcohol para la cromatografía de tinta verde. Y se comprobó que es más eficaz con alcohol que con agua, ya que ésta no es disolvente de la tinta. El alcohol permite separar los diferentes colorantes de la tinta y los pigmentos de la clorofila. En otra página se utiliza el agua salada como disolvente y la hoja se frota al papel de cromatografía en lugar de macharla y extraer la clorofila. También se pueden utilizar otras vegetales que contengan clorofila como la lechucha, el apio, acelga etc Papel absorbente Espectrofotómetro

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