Cromatografía líquida de alta resolución (2)

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Cromatografía líquida de alta resolución (2)

  1. 1. CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN
  2. 2. INTRODUCCION A comienzos del año 1903, el botánico ruso Mijaíl Tsweet usó columnas de adsorción de líquidos para separar pigmentos vegetales (por ejemplo, clorofilas). Las disoluciones se hacían pasar a través de una columna de vidrio rellena de carbonato de calcio, que finamente dividido de un material poroso que interacciona de forma diferente con los componentes de la mezcla, de forma que éstos se separaban en distintas bandas coloreadas a lo largo de la columna. Los primeros equipos de cromatografía de gases aparecieron en el mercado a mediados del siglo XX. A su vez, la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC: High pressure liquid chromatography) comenzó a desarrollarse en los años 1960, aumentando su importancia en las décadas siguientes, hasta convertirse en la técnica cromatográfica más empleada. Sin embargo esto se irá modificando con el paso de los años
  3. 3. DEFINICIÓN La cromatografía es un método físico de separación basado en la distribución de los componentes de una mezcla entre dos fases inmiscibles, una fija o estacionaria y otra móvil. En cromatografía líquida la fase móvil es un líquido que fluye a través de una columna que contiene a la fase fija. La cromatografía líquida “clásica” se lleva a cabo en una columna generalmente de vidrio, la cual está rellena con la fase fija. Luego de sembrar la muestra en la parte superior, se hace fluir la fase móvil a través de la columna por efecto de la gravedad. Con el objeto de aumentar la eficiencia en las separaciones, el tamaño de las partículas de fase fija se fue disminuyendo hasta el tamaño de los micrones, lo cual generó la necesidad de utilizar altas presiones para lograr que fluya la fase móvil. De esta manera, nació la técnica de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), que requiere de instrumental especial que permita trabajar con las altas presiones requeridas.
  4. 4. OBJETIVOS • Aprender y dar a conocer el proceso de una cromatografía líquida de alta resolución y sus diferentes tipos. • Conoceremos la funcionalidad de las diferentes partes del equipo.
  5. 5. IMPORTANCIA • La cromatografía líquida es una técnica instrumental utilizada ampliamente en los laboratorios, por su excelencia cualitativa y cuantitativa, siendo, por tanto, necesaria su comprensión. Sus distintas modalidades y las técnicas operativas existentes, junto a los aspectos prácticos que permitirán realizar análisis cualitativos y cuantitativos, optimizarlos y cumplir con ellos los protocolos de calidad.
  6. 6. TÉCNICA La cromatografía de líquidos de ultra-alta resolución (UHPLC) es una técnica que permite separar, identificar y cuantificar los componentes de una mezcla compleja. ANÁLISIS Se realizan análisis cualitativos y cuantitativos de polifenoles y carotenos.
  7. 7. REVISIÓN DE CONCEPTOS BÁSICOS. Deposito Matriz porosa solida (fase estacionario) Fase móvil Soporte poroso efluido CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA
  8. 8. CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA
  9. 9. ESQUEMA DEL HPLC
  10. 10. MÉTODOS DE CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA Método Abreviatura Mecanismo predominante Liquida, solida o de adsorción LSC Adsorción sobre la superficie Líquido LLC Reparto entre fases líquidas, una móvil y la otra estacionaria. Fase enlazada BPC Reparto y / o adsorción entre las fases móvil y enlazada. Afinidad -- Uso de la estructura de ligantes inmovilizados para unir bioselectivamente la proteína deseada.
  11. 11. CLASIFICACIÓN DE CROMATOGRAFÍA SEGÚN EL MECANISMO DE SEPARACIÓN
  12. 12. CROMATOGRAFÍA DE FILTRACIÓN EN GEL (EXCLUSIÓN MOLECULAR) La cromatografía de filtración molecular es un método de cromatografía en columna por el cual las moléculas se separan en solución según su peso molecular.
  13. 13. CROMATOGRAFÍA DE FILTRACIÓN EN GEL (EXCLUSIÓN MOLECULAR)
  14. 14. CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO En este tipo de cromatografía la F.E tiene grupos cargados que interaccionan electrostáticamente con iones de signo contrario de fase móvil.
  15. 15. CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD (POR LIGANDOS)
  16. 16. CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD (POR LIGANDOS) Polímero con ligando Proteína de interés matriz ligando Inmovilizador ligando Complejo purificado complejo
  17. 17. CARACTERISTICAS CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN
  18. 18. • Elevada sensibilidad. • Elevada aplicabilidad. • Permite realizar análisis cualitativos exactos. • Es adecuada para la separación de especies termolábiles y no volátiles. • Aplicaciones principales: Técnica de separación para los materiales menos volátiles e iónicos; análisis cuantitativo de multicomponentes. • Fenómeno molecular: Reparto entre una solución líquida y un substrato. • Ventajas en el análisis cualitativo: Separa materiales para su examen por medio de otras técnicas. • Ventajas en el análisis cuantitativo: Aplicación amplia a los materiales menos volátiles, análisis de multicomponentes. • Muestra promedio deseable: 10 mg • Limitaciones del método: Se tarda en desarrollar el método • Limitaciones para la muestra: Ninguna
  19. 19. INSTRUMENTACIÓN PARA CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS
  20. 20. La Figura :muestra un esquema de los componentes fundamentales de un cromatografía de líquidos de alta resolución típico • Con objeto de alcanzar un caudal de eluyente razonable con rellenos de tamaño de partícula entre 3 y 10 µm, se requieren presiones de algunos cientos de kilos por centímetro cuadrado. Como consecuencia de estas elevadas presiones, el equipo necesario para la HPLC tiende a ser más sofisticado y caro que el que se utiliza en otros tipos de cromatografía.
  21. 21. Un aparato moderno de HPLC se equipa con uno o más recipientes de vidrio o de acero inoxidable, cada uno de los cuales contiene unos 500 mL de un disolvente. Los recipientes a menudo se equipan con un sistema para eliminar los gases disueltos en general oxígeno y nitrógeno- que interfieren formando burbujas en los sistemas de detección. • RECIPIENTES PARA LA FASE MÓVIL Y SISTEMAS PARA EL TRATAMIENTO DE LOS DISOLVENTES.
  22. 22. • Con frecuencia estos sistemas también contienen un dispositivo para la filtración del polvo y de las partículas sólidas en suspensión de los disolventes. Por ejemplo, una forma conveniente de tratar los disolventes antes de introducirlos en el recipiente, consiste en filtrarlos mediante el vacío a través de un filtro de poro muy pequeño. Este tratamiento elimina los gases además de la materia en suspensión.
  23. 23. • Los instrumentos en la moderna HPLC están equipados con unos dispositivos que permiten introducir los disolventes desde dos o más recipientes en una cámara de mezcla a una velocidad que varía continuamente y la relación de volumen de los disolventes se puede modificar lineal o exponencialmente con el tiempo.
  24. 24.  Los requisitos para un sistema de bombeo en HPLC son rigurosos e incluyen: La generación de presiones por encima de 400 kg/cm2 Un flujo libre de pulsaciones Un intervalo de caudales de 0.1 a 10 mL/min El control y reproducibilidad del caudal mejor del 0,5% relativo componentes resistentes a la corrosión (juntas de acero inoxidable o teflón). •SISTEMAS DE BOMBEO
  25. 25. Bombas reciprocas: • TIPOS DE BOMBAS: .  Son las mas utilizadas  Movimiento cíclico de uno o mas pistones con válvulas de entrada y salida.  Elementos comprensibles en el circuito atenúan variaciones.  2 pistones es la opción mas adecuada. .  Desventaja: Producen un flujo con pulsaciones.  Ventajas: Pequeño volumen interno (35 a 400 mL), sus altas presiones de salida (por encima de los 500 kg/cm2), su fácil adaptación a la elución con gradiente, y sus caudales constantes.
  26. 26. • Bombas de desplazamiento: .  Cámara con un embolo impulsado por un motor. Ventajas: flujo libre de pulsos, independientemente de viscosidad y contrapresión. Desventajas: capacidad de bombeo limitado ( 0.25l), poco practica para reposición y cambio de disolvente.
  27. 27. • Bombas neumáticas: . Ventajas: Baratas. Exentas de impulsos. Desventajas: capacidad limitada y de presión de salida. Caudal dependiente de la viscosidad del disolvente y de la contrapresión. No sirven para elución con gradientes. Presiones menores a 2000psi.
  28. 28. Un método sencillo de amortiguación contiene un fuelle flexible o un gas compresible en la porción superior cerrada de un tubo en T para absorber parte de la energía de pulsación. Cuando la bomba se rellena esta energía se libera para ayudar a suavizar la pulsación de presión. • AMORTIGUADORES DE PULSOS
  29. 29. • Los volúmenes que se emplean han de ser muy pequeños, de unas pocas decimas de micro litro a tal vez 500microlitos. Para evitar en ensanchamiento de picos. • SISTEMAS DE INYECCIÓN DE MUESTRA Inyección manual Inyección con bucles • Sencilla. • Evitar despresurizació n (micro jeringas capaces de resistir 1500psi.) • Inyecciones a flujo detenido. • Inyección a presiones de hasta 7000psi. • Precisión de decimas por ciento. • Volúmenes de bucles entre 0.5 y 500microlitros.
  30. 30. Características: Tubos rectos de acero inoxidable. Longitud entre 10 y 30 cm. Acoplables Diámetro interno entre 4 y 10 mm. Tamaño de partículas entre 5 y 10 um. Columnas comunes: longitud 25cm, diámetro interno 4.6mm, rellenos de partículas de 5um, : 40000 a 60000 platos/metro. • COLUMNAS PARA CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS
  31. 31. • Eliminación en materia de suspensión y los contaminantes de los disolventes. • Sirve para saturar la fase móvil con la fase estacionaria y así minimizar las perdidas de relleno. • La composición del relleno debe ser semejante al de la columna analítica sin embargo el tamaño de partícula es mayor al de la columna para minimizar la caída de presión. Pre columnas: • Muchas veces se controla la temperatura de la columna en unas pocas decimas de grado centígrado; y se obtienen mejores cromotogramas. • Controlan la temperatura entre la temperatura ambiente y 100° - 150°C. Termostatos: • PECULIAR: • Bolas de vidrio o polímero, no porosas y esféricas con diámetros de 30 y 40um. • Recubrimiento con una capa delgada y porosa de distintos compuestos y recubrimiento adicional de fase estacionaria liquida y retenida por absorción. • PARTICULAS POROSAS: • Micro partículas porosas con diámetros entre 3 y 10um. • Preparadas por aglomeración a partir de partículas pequeñas • Recubrimiento con peliculas orgánicas unidas químicamente o físicamente. Tipos de rellenos de la columna:
  32. 32. DETECTORES A diferencia de la cromatografia de gases, en la cromatografía de líquidos no hay detectores tan aplicables universalmente ni tan fiables como los detectores de ionización de llama y de conductividad térmica. Uno de los mayores retos en el desarrollo de la cromatografía de líquidos ha sido el perfeccionamiento de los detectores.
  33. 33. • Un detector ideal para cromatografía de líquidos debería poseer todas las propiedades listadas en relación con la cromatografía de gases, con la excepción de que un detector para cromatografía de líquidos no es necesario que sea sensible en un intervalo tan grande de temperaturas. Además, un detector de HPLC debe tener un volumen interno mínimo a f i n d e r e d u c i r e l e n s a n c h a m i e n t o d e b a n d a . • L o s d e t e c t o r e s e n c r o m a t o g r a f i a de líquidos son de dos tipos básicos. Los detectores basados en una propiedad de la disolución responden a una propiedad de la fase móvil, tal como el índice de refracción, la constante dieléctrica, o l a d e n s i d a d , q u e s e m o d i f i c a p o r l a p r e s e n c i a d e l o s a n a l i t o s . P o r c o n t r a s t e , l o s d e t e c t o r e s b a s a d o s e n u n a p r o p i e d a d d e l s o l u t o r e s p o n d e n a a l g u n a
  34. 34. En la Tabla 4.1 se indican los detectores más comunes empleados en HPLC y algunas de sus propiedades más importantes.
  35. 35. DETECTORES DE ABSORVANCIA: L a F i g u r a 4.5 m u e s t r a e l e s q u e m a d e u n a c u b e t a d e f l u j o e n f o r m a d e Z p a r a l a m e d i d a d e l a a b s o r b a n c i a d e l o s e f l u e n t e s d e u n a c o l u m n a cromatográfica. A f i n d e m i n i m i z a r e l e n s a n c h a m i e n t o d e b a n d a e x t r a c o l u m n a , el volumen de estas cubetas ha de ser lo menor posible, de modo que los volúmenes se limitan por lo común de 1 a 10 µL y l a s l o n g i t u d e s d e l a c u b e t a d e 2 a 10 m m . La utilización de cubetas de este tipo está r e s t r i n g i d a a p r e s i o n e s n o m a y o r e s d e u n o s 50 k g /c m 2
  36. 36. • D e t e c t o r e s d e a b s o r b a n c i a u l t r a v i o l e t a c o n f i l t r o s .- Los detectores de absorción UV más simples son los fotómetros de filtros con una lámpara de mercurio como fuente. Lo más común en estos casos es aislar la línea i n t e n s a a 254 n m por medio de filtros; en algunos equipos también se pueden utilizar las líneas a 250, 313, 334 y 365 n m e m p l e a n d o o t r o s f i l t r o s . • D e t e c t o r e s d e a b s o r b a n c i a u l t r a v i o l e t a c o n mo n o c r o r n a d o r e s .- La mayoría de los fabricantes de instrumentos de HPLC ofrecen detectores que consisten en un espectrofotómetro de barrido con óptica de red. Algunos se limitan a la radiación ultravioleta; mientras que otros abarcan la radiación u l t r a v i o l e t a y l a v i s i b l e . Una de las formas de presentación de los datos espectrales, que resulta útil para la identificación de las especies y para elegir las condiciones de la determinación cuantitativa, consiste en un gráfico t r i d i m e n s i o n a l t a l c o m o e l q u e s e m u e s t r a e n l a F i g u r a 4.6. En este caso, los espectros se obtuvieron a intervalos de cinco segundos. La aparición y desaparición d e c a d a u n o d e l o s e s t e r o i d e s e n e l e f l u e n t e d e l a c o l u m n a r e s u l t a e v i d e n t e .
  37. 37. • D e t e c t o r e s d e a b s o r b a n c i a e n e l i n f r a r r o j o . C o m e r c i a l m e n t e s e o f r e c e n d o s t i p o s d e d e t e c t o r e s d e i n f r a r r o j o . El primero con barrido de longitud de onda que proporcionan tres segmentos de filtro semicirculares. El segundo, mucho más s o f i s t i c a d o , e s u n t i p o d e d e t e c t o r i n f r a r r o j o q u e s e b a s a e n l o s i n s t r u m e n t o s d e t r a n s f o r m a d a d e F o u r i e r . U n a d e l a s m a y o r e s l i m i t a c i o n e s a l u s o d e l o s d e t e c t o r e s d e i n f r a r r o j o s e d e b e a l a b a j a t r a n s p a r e n c i a d e m u c h o s d e l o s d i s o l v e n t e s q u e s e u t i l i z a n . P o r e j e m p l o , l a s bandas anchas de absorción i n f r a r r o j a d e l a g u a y d e l o s a l c o h o l e s i m p i d e n prácticamente e l u s o d e e s t e d e t e c t o r p a r a m u c h a s a p l i c a c i o n e s . • D e t e c t o r e s d e f l u o r e s c e n c i a .- L o s detectores de fluorescencia para HPLC son semejantes en diseño a l o s fluorímetros y espectrofluorímetros. En la mayoría de ellos, la fluorescencia se detecta por medio de un detector fotoeléctrico colocado perpendicularmente respecto al haz de excitación. Los detectores más sencillos utilizan una fuente de excitación de mercurio, y uno o más filtros para aislar la radiación fluorescente. Los futuros desarrollos en los detectores de fluorescencia probablemente se basarán en el uso de fuentes de láser
  38. 38. • Detectores de índice de refracción Los detectores de índice de refracción tienen la ventaja de que responden a casi todos los solutos. Es decir, son detectores universales análogos a l o s d e t e c t o r e s d e l l a m a e n c r o m a t o g r a f i a de gases. Además, s o n f i a b l e s y n o d e p e n d e n d e l c a u d a l . Sin embargo, son muy sensibles a los cambios de temperatura, y se han de mantener a una temperatura constante en unas pocas milésimas de grado centígrado. Por otra parte, no son tan sensibles como la mayoría de los otros detectores, y por lo general no se pueden utilizar en la elución c o n g r a d i e n t e . • D e t e c t o r de dispersión d e l u z Recientemente, se ha comercializado un nuevo tipo de detector general para la HPLC, el detector de dispersión d e l u z (E L S D ). E n e s t e detector, el efluente de la columna se pasa a un nebulizador donde se convierte en una fina niebla mediante un flujo de nitrógeno o aire. Las finas gotitas se llevan a través de un tubo de conducción a temperatura controlada donde tiene lugar la evaporación de la fase móvil, lo que origina unas finas partículas d e a n a l i t o . La nube de partículas d e a n a l i t o pasa a través de un haz láser. Mediante un fotodiodo de silicio se detecta la radiación d i s p e r s a d a p e r p e n d i c u l a r m e n t e a l f l u j o .
  39. 39. • D e t e c t o r e s electroquímicos Los fabricantes de instrumentos proporcionan en la actualidad varios tipos de detectores electroquímicos. Estos dispositivos se basan en cuatro métodos electroanalíticos q u e i n c l u y e n l a amperometría, l a voltamperometría, l a coulombimetría y l a conductimetría.
  40. 40. PARÁMETROS CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN
  41. 41.  Diámetro interno El diámetro interno de una columna de HPLC es un aspecto crítico que influye en la sensibilidad de la detección y la selectividad de separación en gradiente de elución. También determina la cantidad de analito que puede ser cargada en la columna. Las columnas de diámetro interno más grande (>10 mm) se utilizan normalmente en aplicaciones industriales tales como la purificación de un producto farmacéutico para su uso posterior. En cambio, las columnas de diámetro interno menor (4-5 mm) se utilizan en el análisis cuantitativo de las muestras, y se caracterizan por el aumento la sensibilidad y la minimización del consumo de disolventes que conllevan. Estas columnas se suelen denominar columnas de rango analítico y normalmente están asociadas a un detector UV-VIS. Aparte, existen otros tipos de columnas, como las de tipo capilar, con un diámetro inferior a 0.3 mm, utilizadas principalmente en espectrometría de masas.
  42. 42.  Medida de las partículas La mayoría de HPLC tradicionales se realizan con una fase estacionaria unida al exterior de partículas esféricas de silica. Estas partículas pueden tener diferentes medidas, siendo las de 5um de diámetro las más utilizadas. Partículas más pequeñas ofrecen una mayor superficie y una mejor separación, pero la presión que se requiere por obtener una velocidad lineal óptima aumenta de forma inversamente proporcional al cubo del diámetro de la partícula. Esto significa que disminuir la medida de las partículas a la mitad, manteniendo el tamaño de la columna de la misma, habrá el doble de rendimiento, pero aumentaría la presión requerida por un factor de cuatro. Las partículas más grandes se utilizan en HPLC preparativa y para aplicaciones no-HPLC tales como la extracción en fase sólida.
  43. 43.  Tamaño de poro Muchas fases estacionarias son porosas para proporcionar una mayor superficie. Los poros pequeños proporcionan una mayor superficie mientras que los poros de mayor medida proporcionan una cinética mejor, especialmente para los compuestos de tamaño más grande; por ejemplo, una proteína que sea ligeramente más pequeña que el tamaño de los poros puede entrar, pero difícilmente saldrá con facilidad.
  44. 44.  Presión del sistema La presión de las bombas es variable según el modelo y fabricante, pero su rendimiento se mide en su capacidad para producir una velocidad de flujo constante y reproducible. La presión puede lograr valores de hasta 40 MPa (o unas 400 atmósferas). Los aparatos más modernos de HPLC incorporan mejoras para poder trabajar a presiones más altas y, por lo tanto, poder utilizar partículas de tamaño más pequeño en las columnas (< 2 micrometros). Estos nuevos aparatos, denominados Ultra Performance Liquid Chromatograp orma general para designar este tipo de aparatos). Estos sistemas "Ultra High Performance Liquid Chromatography" o RSLC/UHPLCs pueden trabajar a velocidades de hasta 100 MPa, o alrededor de 1.000 atmósferas. El término "UPLC" es una marca comercial de Waters Corporation, pero a veces se utiliza para referirse a la técnica más general.
  45. 45. Cromatografía de fase normal Fue el primer tipo de HPLC, separaba analito basándose en la polaridad. Este método usa una fase estacionaria polar(Agua, Soluciones "Amortiguadoras de pH", Acetonitrilo, Metanol) y una fase móvil no polar (hexano ,Tetracloruro de Carbono, Benceno) que se usa cuando el analito es polar. El analito polar es retenido por la fase estacionaria polar. La adsorción aumenta con la polaridad del analito y la interacción entre analito y fase estacionaria.
  46. 46. Cromatografía de fase inversa La cromatografía de fase reversa se basa en el principio de las interacciones hidrofóbicas que resultan de las fuerzas de repulsión entre un disolvente relativamente polar (Agua, Soluciones "Amortiguadoras de pH", Acetonitrilo, Metanol) , y una fase estacionaria apolar (Generalmente Sílica injertada con cadenas de grupos orgánicos de 8 y 18 átomos de Carbón (C8 y C18). El efecto hidrofóbico disminuye con la adición de disolvente apolar a la fase móvil. Esto modifica el coeficiente de partición de forma que el compuesto se mueve por la columna y eluye.
  47. 47. También conocida como cromatografía de gel permeante o cromatografía de gel filtrante. Separa las partículas en función del tamaño. Es una cromatografía de baja resolución y sirve para determinar estructuras terciarias y cuaternarias de proteínas y es la técnica común para averiguar el peso molecular de polímeros sintéticos y naturales. Cromatografía de exclusión por tamaño
  48. 48. La retención está basada en la atracción entre iones del soluto y la carga complementaria de la fase estacionaria. Si los iones del soluto y la fase estacionaria tienen la misma carga, son excluidos. Algunos intercambiadores de iones son: Resinas de Poli estireno: permite entrecruzamientos que dan estabilidad a la cadena .Celulosa: Tiene tamaño de poros más grandes y bajas densidades de carga que los hacen ideales para la separación de proteínas .Poro controlado de vidrio o silicona porosa. Los intercambiadores de iones favorecen la unión de iones de mayor carga y radio inferior. Un incremento en el contra-ión (con respecto a los grupos funcionales de resinas) reduce el tiempo de retención. Un incremento del pH reduce el tiempo de retención en el intercambio catiónico, pero bajar el pH reduce la retención en intercambio aniónico. Se usa en la purificación de agua, pre concentración de componentes traza, cromatografía de intercambio de ligandos, cromatografía de intercambio de iones de proteínas, intercambio de aniones a alto pH de carbohidratos y polisacáridos. Cromatografía de intercambio iónico
  49. 49. Se basa en las propiedades de sustancias bio-activas para formar complejos estables, específicos y reversibles. La formación de los complejos implica fuerzas moleculares como Van der Waals, electrostática, dipolo-dipolo, hidrofóbicas y puentes de hidrogeno. Una unión bioespecífica se forma por acción simultánea de estas fuerzas en los sitios de unión. Cromatografía de bioafinidad
  50. 50. Conservantes antioxidantes:  Se usa el gradiente de HPLC con un detector colorimétrico para medir simultáneamente los nueve antioxidantes más comunes Hipoclorito , iodo ..etc Carbohidratos simples:  Usar HPLC con ELSD elimina la necesidad de usar bases fuertes o alto pH, convirtiéndose en un método no destructivo. . Aplicación al análisis de alimentos
  51. 51. La adición de mono y disacáridos a bebidas y zumos sirve como propósito de enriquecer el sabor. Para determinar si la cantidad añadida es correcta se miden los azucares usando HPLC de intercambio iónico con detección de pulso amperométrico con detectores de refracción o ultravioletas. Análisis de carbohidratos en las bebidas
  52. 52. Flavonoides y fenoles  En el vino la medición de estas sustancias permite la determinación del color, la edad y las variedades de uva usadas. El HPLC en combinación con colorímetros, permiten la determinación de hasta 22 compuestos diferentes simultáneamente. Lípidos  La determinación de lípidos animales y vegetales como: colesterol, triglicéridos, glicéridos y esteroles, se basa en el uso del HPLC
  53. 53. Catequinas del té  Las catequinas son flavonoles del té, posiblemente anticancerígenos. Se usa HPLC con hidrólisis enzimática para detectar estas sustancias tan beneficiosas. Triglicéridos:  HPLC con ELSD permite la separación y caracterización de todos los tipos detriglicéridos

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