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¿Cómo se estudian las proteínas?
 
Aislando fracciones subcelulares
 
 
 
Purificación de proteínas
Métodos de purificación <ul><li>Se basan en las propiedades fisicoquímicas de las proteínas: </li></ul><ul><li>Tamaño  </l...
Característica     Procedimientos Tamaño <ul><li>Diálisis – ultrafiltración </li></ul><ul><li>Electroforesis en gel </li><...
Centrifugación <ul><li>Utiliza la fuerza centrífuga (fuerza-g) para aislar partículas suspendidas. </li></ul><ul><li>Los c...
 
Centrifugación <ul><li>Centrifugación en gradientes de densidad </li></ul><ul><li>Gradientes continuos de sacarosa   tubo...
Aplicación de fuerza centrífuga
 
 
Fundamento de la cromatografía Muestra: tres componentes mezclados Fase   móvil Fase estacionaria Se hace fluir una fase m...
Cromatografía <ul><li>Exclusión molecular: </li></ul><ul><li>Separa según tamaño molecular </li></ul><ul><li>Fase estacion...
Exclusión molecular <ul><li>Separa mezclas de proteínas por tamaño </li></ul><ul><li>Las columnas rellenas de polímeros in...
Exclusión Molecular A:  Pasa s ólo por fuera de las perlas Menos recorrido, sale primero B:  Pasa por dentro y por fuera d...
Exclusión molecular
Volumen de exclusión Proteínas de gran tamaño no penetran los poros permaneciendo en el volumen de exclusión de la columna...
Exclusión Molecular 1 . La  column a   se equilibra con el buffer de corrida 2.   Aplicación de la muestra ( 0.5 - 5%  vol...
Cromatografía en columna  <ul><li>La salida de las proteínas se detecta normalmente por absorción de la luz, en una longit...
 
Cromatografía de intercambio iónico
<ul><li>Un intercambiador iónico consiste en una matriz porosa con grupos cargados unidos covalentemente. </li></ul><ul><l...
Intercambio Iónico <ul><li>Los grupos funcionales cargados son una propiedad fundamental del intercambiador. </li></ul><ul...
Intercambiadores aniónicos
Intercambiadores catiónicos
Intercambio iónico                                                                                                        ...
Cromatografía de intercambio iónico Retenidas por la resina Para separar A de la resina es necesario cambiar el pH por arr...
- Proteínas adsorbidas al intercambiador iónico A baja concentración de sal, se desprenden  las proteínas menos electroneg...
 
Electroforesis <ul><li>Método de separación de sustancias cargadas al aplicar un campo eléctrico, de modo que se diferenci...
1. Se realiza sobre un soporte sólido o semisólido, para minimizar efectos de difusión 2. Se somete el conjunto a un campo...
Electroforesis de zona <ul><li>Papel de filtro o acetato de celulosa </li></ul><ul><li>Revela la presencia de proteínas co...
 
 
Electroforesis en geles de poliacrilamida <ul><li>Separa por carga y tamaño </li></ul><ul><li>El material soporte interacc...
Electroforesis
SDS-Page  <ul><li>Las proteínas se separan  s ó lo  por su PM </li></ul><ul><li>El SDS interacciona con las proteínas por ...
 
 
 
Electroforesis
Electroforesis bidimensional
Electroforesis: Aplicaciones <ul><li>Separar proteínas de una mezcla </li></ul><ul><li>Determinación de PI y PM   </li></u...
Solubilidad <ul><li>Muy utilizados en los primeros pasos de la purificación </li></ul><ul><li>Mantiene nativa a la protein...
Solubilidad <ul><li>Depende de: </li></ul><ul><li>pH </li></ul><ul><li>Fuerza iónica </li></ul><ul><li>Disolvente </li></u...
Solubilidad-pH <ul><li>La carga neta de las proteína depende del contenido de aa ácidos y de aa básicos </li></ul><ul><li>...
Solubilidad: disolventes <ul><li>Adición de disolventes neutros miscibles en agua (ACETONA, ETANOL) </li></ul><ul><li>Se u...
Solubilidad-Fuerza iónica <ul><li>Salting in </li></ul><ul><li>Salting out </li></ul>
Salting in (salado) <ul><li>Solubilidad a baja fuerza ionica  (0.001 – 0.02 M) </li></ul><ul><li>aumenta con la [ sales]  ...
Salting out (precipitación por salado) <ul><li>La solubilidad a alta fuerza iónica ( mayor a 0,02M)  disminuye  con la [sa...
Solubilidad- Temperatura <ul><li>0-40  o C  >T > solubilidad. </li></ul><ul><li>40-50 o C  aumenta la inestabilidad y DESN...
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  1. 1. Tema 2: Estructura y Función de las Proteínas (5/5) Prof. Vanessa Miguel [email_address] @bioquitips Noviembre 2011 Universidad Central de Venezuela Facultad de Medicina Escuela de Medicina Luis Razetti Cátedra de Bioquímica
  2. 2. ¿Cómo se estudian las proteínas?
  3. 4. Aislando fracciones subcelulares
  4. 8. Purificación de proteínas
  5. 9. Métodos de purificación <ul><li>Se basan en las propiedades fisicoquímicas de las proteínas: </li></ul><ul><li>Tamaño </li></ul><ul><li>Solubilidad </li></ul><ul><li>Carga </li></ul><ul><li>Adsorción </li></ul><ul><li>Afinidad </li></ul>
  6. 10. Característica   Procedimientos Tamaño <ul><li>Diálisis – ultrafiltración </li></ul><ul><li>Electroforesis en gel </li></ul><ul><li>Cromatografía de exclusión molecular </li></ul><ul><li>Ultracentrifufación </li></ul><ul><li>  </li></ul>Solubidad <ul><li>Precipitación con Sales </li></ul><ul><li>“ Solventes orgánicos </li></ul><ul><li>‘’ por pH </li></ul>Polaridad <ul><li>Cromatografia de absorción </li></ul><ul><li>C. En papel </li></ul><ul><li>C. En fase reversa </li></ul><ul><li>C. De interaccion hidrofóbica </li></ul>Carga <ul><li>Cromatografia de intercambio iónico </li></ul><ul><li>Electroforesis </li></ul><ul><li>Isoelectroenfoque </li></ul>Selectivida d <ul><li>Cromatografia de afinidad </li></ul><ul><li>  </li></ul>
  7. 11. Centrifugación <ul><li>Utiliza la fuerza centrífuga (fuerza-g) para aislar partículas suspendidas. </li></ul><ul><li>Los componentes de la mezcla se separan por: peso , tamaño , densidad y forma. </li></ul><ul><li>Se utiliza para la separación de organelos subcelulares y para el aislamiento de macromoléculas, tales como ADN, ARN, proteínas o lípidos </li></ul><ul><li>Se separan es su  coeficiente de sedimentación ( s ); medido en Svedbergs  (1 S = 10 -13  segundos), depende de la forma y el tamaño de la molécula o partícula . </li></ul>
  8. 13. Centrifugación <ul><li>Centrifugación en gradientes de densidad </li></ul><ul><li>Gradientes continuos de sacarosa  tubo de centrífuga </li></ul>
  9. 14. Aplicación de fuerza centrífuga
  10. 17. Fundamento de la cromatografía Muestra: tres componentes mezclados Fase móvil Fase estacionaria Se hace fluir una fase móvil sobre la estacionaria Dependiendo de la afinidad relativa por ambas fases, los componentes de la mezcla se separan Se dispone una mezcla sobre una fase estacionaria
  11. 18. Cromatografía <ul><li>Exclusión molecular: </li></ul><ul><li>Separa según tamaño molecular </li></ul><ul><li>Fase estacionaria: dextrano o agarosa entrecruzados </li></ul><ul><li>Fase móvil: solución buffer </li></ul><ul><li>Intercambio iónico: </li></ul><ul><li>Separa según carga eléctrica </li></ul><ul><li>Fase estacionaria: grupos cargados unidos a un soporte insoluble </li></ul><ul><li>Fase móvil: gradiente de sal o de pH </li></ul>
  12. 19. Exclusión molecular <ul><li>Separa mezclas de proteínas por tamaño </li></ul><ul><li>Las columnas rellenas de polímeros inertes insolubles pero muy hidratados: </li></ul><ul><ul><ul><li>Sephadex: polimeros de dextrano </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>Sepharose: agarosa </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>Superose: agarosa entrecruzada </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>Sephacryl: dextrano-bisacrilamida </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>Superdex: agarosa y dextrano </li></ul></ul></ul>
  13. 20. Exclusión Molecular A: Pasa s ólo por fuera de las perlas Menos recorrido, sale primero B: Pasa por dentro y por fuera de las perlas Mayor recorrido, Sale después Resina porosa Fase estacionaria Amortiguador Fase m óvil Resina B A
  14. 21. Exclusión molecular
  15. 22. Volumen de exclusión Proteínas de gran tamaño no penetran los poros permaneciendo en el volumen de exclusión de la columna Vo
  16. 23. Exclusión Molecular 1 . La column a se equilibra con el buffer de corrida 2. Aplicación de la muestra ( 0.5 - 5% volumen de columna) 3. Elu c i ó n. .                                                                                                                                                                                                                                                                             
  17. 24. Cromatografía en columna <ul><li>La salida de las proteínas se detecta normalmente por absorción de la luz, en una longitud de onda de 280nm. </li></ul><ul><li>Los aminoácidos de las proteínas absorben tal luz y se cuantifica utilizando un  espectrofotómetro, </li></ul><ul><li>Los datos se registran en un diagrama de elución  que indica la posición de las proteínas que se han separado. </li></ul><ul><li>Después pueden realizarse estudios de actividad biológica, enzimática, etc. de las proteínas fraccionadas </li></ul>
  18. 26. Cromatografía de intercambio iónico
  19. 27. <ul><li>Un intercambiador iónico consiste en una matriz porosa con grupos cargados unidos covalentemente. </li></ul><ul><li>Estos grupos se asocian con iones de la fase móvil ( contraiónes ) , estos pueden intercambiarse por otros iones de las misma carga sin alterar la matriz. </li></ul><ul><li>La matriz generalmente es un compuesto inorgánico, resinas sintéticas o polisacáridos. </li></ul>Matriz Nombre Dextrano Sephadex Agarosa Sep h arose CL-6B Celulosa Sephacel
  20. 28. Intercambio Iónico <ul><li>Los grupos funcionales cargados son una propiedad fundamental del intercambiador. </li></ul><ul><li>Determinan el tipo y la fuerza del intercambiador </li></ul><ul><li>El número total y su disponibilidad, determinan la capacidad del intercambiador </li></ul><ul><li>Los de carga negativa adsorben cationes (intercambiadores catiónicos) mientras que los de carga positiva adsorben aniones (intercambiadores aniónicos) </li></ul>
  21. 29. Intercambiadores aniónicos
  22. 30. Intercambiadores catiónicos
  23. 31. Intercambio iónico                                                                                                           <ul><li>Mecanismo de separación </li></ul><ul><ul><li>Separa a moléculas por carga neta. </li></ul></ul><ul><ul><li>Grupos cargados unidos a la matriz unen las muestras de carga opuesta(reversible) </li></ul></ul><ul><ul><li>La elución se logra a través el camb i o del pH o aumentando la concentración de sal del eluyente. </li></ul></ul><ul><ul><li>                                                                 </li></ul></ul><ul><ul><li>Fig 1.1. Charged sample molecules adsorb to ion exchangers of the opposite sign. The interaction is a dynamic equilibrium that can be influenced by pH or salt concentration. </li></ul></ul>
  24. 32. Cromatografía de intercambio iónico Retenidas por la resina Para separar A de la resina es necesario cambiar el pH por arriba del pI Resina carga (-) Atrae cationes A: (+) B: (-)
  25. 33. - Proteínas adsorbidas al intercambiador iónico A baja concentración de sal, se desprenden las proteínas menos electronegativas A mayor concentración de sal se desprenden las proteínas más electronegativas + + + + + + + + + - - - - - - - - - - + + + + + + + + + - - - - - - - - - - - - - - - - - - - + + + + + + + + + - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
  26. 35. Electroforesis <ul><li>Método de separación de sustancias cargadas al aplicar un campo eléctrico, de modo que se diferencian en el diferente comportamiento en un campo eléctrico. </li></ul><ul><li>Aquellas partículas cargadas positivamente (cationes) migrarán hacia el cátodo  y las cargadas negativamente (aniones) hacia el ánodo . </li></ul>
  27. 36. 1. Se realiza sobre un soporte sólido o semisólido, para minimizar efectos de difusión 2. Se somete el conjunto a un campo eléctrico constante, a un pH fijo; las proteínas migran conforme a su carga eléctrica 3. Terminada la electroforesis, las proteínas se tiñen con un colorante adecuado (ej., Azul de Coomassie) Muestra + - Ánodo Cátodo
  28. 37. Electroforesis de zona <ul><li>Papel de filtro o acetato de celulosa </li></ul><ul><li>Revela la presencia de proteínas con colorantes específicos </li></ul><ul><li>No existe interacción con el soporte </li></ul><ul><li>Resolución muy baja </li></ul><ul><li>Rápido </li></ul>
  29. 40. Electroforesis en geles de poliacrilamida <ul><li>Separa por carga y tamaño </li></ul><ul><li>El material soporte interacciona con las proteínas actuando como matriz retardando a las proteínas más grandes </li></ul><ul><li>Utiliza geles de poliacrilamidas. </li></ul><ul><li>Condicion nativa (PAGE) o desnaturalizante(SDS-PAGE) </li></ul>
  30. 41. Electroforesis
  31. 42. SDS-Page <ul><li>Las proteínas se separan s ó lo por su PM </li></ul><ul><li>El SDS interacciona con las proteínas por interacciones hidrofóbicas </li></ul><ul><li>Recubre las proteínas con carga negativa proporcional a su PM </li></ul><ul><li>  Desnaturaliza la estructura nativa de la proteína </li></ul><ul><li> -mercaptoetanol rompe los pu e ntes disulfuros </li></ul>
  32. 46. Electroforesis
  33. 47. Electroforesis bidimensional
  34. 48. Electroforesis: Aplicaciones <ul><li>Separar proteínas de una mezcla </li></ul><ul><li>Determinación de PI y PM </li></ul><ul><li>Fraccionamiento de las hemoglobinas </li></ul><ul><li>Diferenciación de la hemoglobina fetal </li></ul><ul><li>Diagnóstico de talasemias, anemias falciformes, etc </li></ul><ul><li>Proteínas séricas </li></ul><ul><li>Proteínas urinarias </li></ul><ul><li>Lipoproteínas </li></ul><ul><li>Ácidos nucleicos </li></ul><ul><li>Enzimas </li></ul><ul><li>Inmunoelectroforesis </li></ul><ul><li>Etc . </li></ul>
  35. 49. Solubilidad <ul><li>Muy utilizados en los primeros pasos de la purificación </li></ul><ul><li>Mantiene nativa a la proteina </li></ul><ul><li>Redisolución sin pérdida de actividad </li></ul><ul><li>Cada proteína tiene una composición de aa diferente y diferente solubilidad </li></ul>
  36. 50. Solubilidad <ul><li>Depende de: </li></ul><ul><li>pH </li></ul><ul><li>Fuerza iónica </li></ul><ul><li>Disolvente </li></ul><ul><li>Temperatura </li></ul>
  37. 51. Solubilidad-pH <ul><li>La carga neta de las proteína depende del contenido de aa ácidos y de aa básicos </li></ul><ul><li>Cuando el valor del pH donde la carga neta de la proteína es cero  pI </li></ul><ul><li>Solubilidad es mínina </li></ul><ul><li>Ej:  contenido de aa ácidos  pI bajo (4-5) </li></ul>
  38. 52. Solubilidad: disolventes <ul><li>Adición de disolventes neutros miscibles en agua (ACETONA, ETANOL) </li></ul><ul><li>Se usan en distintas proporciones </li></ul><ul><li>Disminuyen la solvatación de las proteínas en soluciones acuosas </li></ul>
  39. 53. Solubilidad-Fuerza iónica <ul><li>Salting in </li></ul><ul><li>Salting out </li></ul>
  40. 54. Salting in (salado) <ul><li>Solubilidad a baja fuerza ionica (0.001 – 0.02 M) </li></ul><ul><li>aumenta con la [ sales]  Salting in </li></ul>Al aumentar la [sales]  proteína se rodea de contraiones  más soluble por > interacción proteína-solvente
  41. 55. Salting out (precipitación por salado) <ul><li>La solubilidad a alta fuerza iónica ( mayor a 0,02M) disminuye con la [sales]  Salting out </li></ul><ul><li>La alta [sal] remueve la esfera de solvatación de la proteína y éstas precipitan </li></ul>
  42. 56. Solubilidad- Temperatura <ul><li>0-40 o C >T > solubilidad. </li></ul><ul><li>40-50 o C aumenta la inestabilidad y DESNATURALIZAN (  solubilidad) </li></ul>
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