Informe cromatografia de intercambio ionico

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  • 1. 1 UNIVERSIDAD CATÓLICA DE LA SANTÍSIMA CONCEPCIÓN FACULTAD DE MEDICINA ESCUELA DE MEDICINA DEPTO. DE BIOQUÍMICA INTEGRANTES:  FERNANDA FUENTEALBA ULLOA  VALENTINA FUENTES CONAPIADO  MACARENA LOBO BLANC  CARLA MORA VOGT  ROMINA PULVERMÜLLER SALVATIERRA  JONATHAN RIQUELME TAPIA DOCENTES:  Dr. REGINALD DEL POZO, Ph.D.  BQ. MIRNA MUÑOZ, M.Sc. FECHA: MIÉRCOLES 30 DE JUNIO DE 2010
  • 2. 2 INDICE  OBJETIVOS 02  INTRODUCCIÓN 03  CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO 04  PROPIEDADES DE LOS INTERCAMBIADORES IÓNICOS 04  PROCEDIMIENTO 05  FACTORES QUE AFECTAN LA RETENCIÓN 06  RESULTADOS 08  APLICACIONES 09  MEDICIÓN DE LA HEMOGLOBINA GLICOSILADA 09  DETERMINACIÓN DE PBG Y ALA EN ORINA 11  EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS 12  OTRAS APLICACIONES 12  CONCLUSIÓN 13  BIBLIOGRAFÍA 13 OBJETIVOS  Desarrollar el concepto de las técnicas  Determinar los factores que afectan, interfieren o cromatográficas a nivel general. alteran el procedimiento y su correcta ejecución  Comprender los principios de la cromatografía de para lograr el objetivo deseado. intercambio iónico.  Reconocer las distintas aplicaciones  Analizar paso a paso el método de la técnica y preferentemente en el ámbito médico y la los distintos tipos de intercambiadores iónicos importancia de esta técnica cromatográfica. que permiten su función.
  • 3. 3 INTRODUCCIÓN el fenómeno a la superficie que separa las fases o superficie interfacial. Para el estudio de las sustancias se deben ocupar diversas técnicas, que han ido evolucionando con el 2. La absorción, que es la retención de una paso de los años. Una de las técnicas más básicas es especie química por parte de una masa, y debido la cromatografía, en sus múltiples variantes. Esta a la tendencia que esta tiene a formar mezcla técnica se da desde siempre en la naturaleza, como con la primera, absorción pura, o a reaccionar en lo que efectúan las piedras, que permiten purificar químicamente con la misma, absorción con el agua. reacción química, considerando ambas como un fenómeno másico y no superficial. La cromatografía como tal adquiere importancia cuando en 1850 el químico F.F.Runge, que trabajaba A comienzos del año 1903, Mijail Tsvet usó columnas con tintas, descubrió que los cationes orgánicos se de adsorción de líquidos para separar pigmentos separaban por migración cuando se depositaba una vegetales (por ejemplo, clorofilas). Las disoluciones disolución que los contenía sobre un material poroso, se hacían pasar a través de una columna de vidrio como papel. El botánico ruso Mijaíl Tswett empleó por rellena de carbonato de calcio, que finamente dividido primera vez en 1906 el término "cromatografía" (que de un material poroso que interacciona de forma proviene del griego χρομα y γραφω que significan diferente con los componentes de la mezcla, de forma respectivamente chroma "color" y graphos "escribir"). que éstos se separaban en distintas bandas coloreadas a lo largo de la columna. Según la definición dada por Keulemans la cromatografía es un método de separación en el que los componentes a desglosar se distribuyen entre dos fases, una de las cuales constituye un lecho estacionario de amplio desarrollo superficial y la otra es un fluido que pasa a través o a lo largo del lecho estacionario. Recientemente la I.U.P.A.C define la cromatografía de forma más amplia como (1): Método usado principalmente para la separación de los componentes de una muestra, en el cual los componentes son distribuidos entre dos fases, una de las cuales es estacionaria, mientras que la otra es Imagen 1. Separación de móvil. La fase estacionaria puede ser un sólido o un clorofilas mediante cromatografía líquido soportado en un sólido o en un gel (matriz). La en papel. fase estacionaria puede ser empaquetada en una columna, extendida en una capa, distribuida como La cromatografía puede cumplir dos funciones una película, etc. básicas, como son el de separar los componentes de la mezcla, para así purificarlos, o para medir las Se basa en el principio de retención selectiva, cuyo proporciones de los componentes. objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla, permitiendo identificar y determinar las Existen múltiples tipos de cromatografía, que se cantidades de dichos componentes. Las retenciones pueden separar en dos grandes grupos: mencionadas pueden tener su origen en dos fenómenos de interacción que se dan entre las dos a) Cromatografía plana. La fase estacionaria se fases y que pueden ser: sitúa sobre una placa plana o sobre un papel. Las principales técnicas son: Cromatografía en 1. La adsorción, que es la retención de una papel, Cromatografía en capa fina. especie química por parte de los puntos activos de la superficie de un sólido quedando delimitado b) Cromatografía en columna. La fase estacionaria se sitúa dentro de una columna.
  • 4. 4 Según el fluido empleado como fase móvil se El principio básico de la cromatografía de intercambio distinguen: Cromatografía de líquidos, iónico(3) es que las moléculas cargadas se adhieren a Cromatografía de gases, Cromatografía de los intercambiadores de forma reversible de modo fluidos supercríticos. que dichas moléculas pueden ser unidas o desunidas cambiando el ambiente iónico. La separación mediante intercambiadores iónicos se realiza por lo Dentro de la cromatografía en columna de líquidos, general, en dos fases: en la primera las sustancias a están un grupo de técnicas, dentro de las que separar se unen al intercambiador utilizando queremos destacar la cromatografía de intercambio condiciones que originan una unión fuerte y estable; a iónico, que ocupa en su fase móvil un liquido polar, y continuación, se eluye de la columna con tampones estacionaria un sólido. Esta cromatografía es un de diferentes pH o diferente fuerza iónica, proceso que permite la separación de iones y compitiendo los componentes del tampón con el moléculas polares basadas en las propiedades de material, por los sitios de unión. carga de moléculas. Esta técnica apareció durante la II Guerra Mundial y en principio tenía la finalidad de separar las tierras raras y los elementos de transición. En 1938 Taylor y A Urey utilizan este método para separar isótopos de Litio y Potasio utilizando resinas de zeolita. En 1939 Samuel logra sintetizar resinas de intercambio iónico. B Puede ser usada en casi cualquier tipo de molécula Imagen 2. (A) Con una fase cargada incluyendo grandes proteínas, pequeños estacionaria cargada nucleótidos y aminoácidos. La solución que debe negativamente son retenidas las inyectarse es usualmente llamada “muestra” y los sustancias cargadas C componentes separados individualmente son positivamente. (B) Deben competir llamados “analitos”. Es usada a menudo en con los contraiones (del purificación de proteínas, análisis de agua o control amortiguador). (C) Las sustancias de calidad(2). cargadas negativamente pasan a través de la face estacionaria sin enlazarse. CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO La cromatografía de intercambio iónico es un método  PROPIEDADES DE LOS de separación que permite la separación de INTERCAMBIADORES IÓNICOS moléculas basada en sus propiedades de carga eléctrica. Se compone de dos fases, la fase Un intercambiador iónico es, por lo general, un estacionaria o intercambiador iónico y la fase móvil. polímero que tiene grupos cargados unidos. Si un La fase estacionaria insoluble lleva en la superficie grupo está cargado negativamente, podrá cargas electrostáticas fijas, que retienen contraiones intercambiar iones positivos y será un intercambiador móviles que pueden intercambiarse por iones de la de cationes o catiónico. Un grupo típico que se utiliza fase móvil La fase móvil en cromatografía de en los intercambiadores de cationes es el grupo intercambio iónico suele ser una disolución acuosa sulfónico, SO3-. Si se une un H+ al grupo, se dice que con cantidades moderadas de metanol u otro el intercambiador se encuentra en forma ácida, y disolvente orgánico miscible con agua que contiene puede por ejemplo intercambiar un H+ por un Na+ o especies iónicas en forma, generalmente de buffer. dos H+ por un Ca2+. El grupo ácido sulfónico es un Los iones de la fase móvil compiten con los analitos intercambiador de cationes fuertemente acido. Otros por los sitios activos de la fase estacionaria. grupos de utilización corriente son el carbonilo e hidroxilo fenólico, dos intercambiadores catiónicos
  • 5. 5 débilmente ácidos. Si el grupo cargado es positivo Para una correcta elección de la porosidad y del (por ejemplo un grupo amino cuaternario), es un tamaño de la malla es necesario tener en cuenta que intercambiador de aniones o aniónico fuertemente las moléculas pequeñas se separan mejor sobre básico. Los intercambiadores aniónicos débilmente matrices con tamaño de poro pequeño (o sea, un básicos más corrientes son grupos aminos alifáticos o elevado grado de entrecruzamientos) debido a que la aromáticos. capacidad disponible es grande, mientras que las macromoléculas necesitan un tamaño de poro mayor. A Los intercambiadores de celulosa han probado ser los mejores para la purificación de moléculas grandes Imagen 3. Estructuras de como proteínas y polinucleótidos. Ello es debido a B Resinas Intercambiadoras de que la matriz es fibrosa, por lo que todos los grupos Cationes. (A) Resina de funcionales se encuentran en la superficie y poliestireno, ácido fuerte C disponibles, incluso, para las moléculas mayores. (Dowex-50). (B) Resina de carboximetil celulosa, ácido  PROCEDIMIENTO débil (CM Cellulose). (C) Resina de poliestireno, ácido Para realizar una cromatografía de intercambio iónico débil y quelante (Chelex-100). son necesarios los siguientes materiales: (1) Columna de vidrio, (2) Matriz de intercambio iónico (Resina), La matriz puede estar hecha de diferentes materiales. (3) Eluyente, (4) Muestra a fraccionar y (5) Los de uso más corriente son el dextrano, la celulosa Colectores(4). y copolímeros del estireno y divinilbenceno, en los que el divinilbenceno contie los grupos cargados y se La mayoría de los experimentos basados en esta entrecruza con las cadenas de poliestireno. técnica están basados en 4 etapas(5). La elección entre intercambiadores fuertes o débiles 1. Equilibrio: El primer paso es el equilibrio de la está basada en el efecto del pH sobre la carga y la fase estacionaria con las condiciones iniciales estabilidad. Por ejemplo, si se va a cromatografiar deseadas. Cuando el equilibrio se ha logrado, toda una sustancia débilmente ácida que necesita pH muy la fase estacionaria se encuentra asociada a iones altos o muy bajos para su ionizacion, se requiere un complementarios (que pueden ser cloro o sodio). intercambiador fuerte debido que este funciona a pH Por ejemplo, un intercambiador catiónico extremos. No obstante, si la sustancia es lábil, es sulfonado asociado a Na+ producto de la preferible la utilizacion de intercambiadores débiles. disociación de NaOH. Los intercambiadores débiles son tambien excelentes para la separacion de moléculas con una carga 2. Aplicación y Lavado: El paso siguiente es aplicar elevada de aquellas con poca carga, debido a que los la muestra la cual queremos filtrar a través de la iones debilmente cargados no se unen, por lo columna mediante un lavado específico. Para ello general, al intercambiador. Los intercambiadores es necesario aplicar un buffer con el mismo pH y débiles permiten, asimismo, una mayor resolucion de fuerza iónica que el buffer inicial para que todas las sustancias si las diferencias de carga son muy las proteínas cargadas se unan al intercambiador. pequeñas. Por ejemplo: A la forma sódica de la resina lavada A se le añade una solución ácida (pH=3) de la mezcla de aminoácidos; a dicho pH los aminoácidos se encuentran en forma de cationes Imagen 4. Estructuras de con carga neta positiva. Los aminoácidos B Resinas Intercambiadoras de catiónicos tienden a desplazar algunos de los Aniones. (A) Resina de poliestireno, base fuerte (Dowex- iones ligados a las partículas de resina. A pH 3 los 1). (B) Resina de dietilaminoetil aminoácidos más básicos se unirán a la resina de celulosa, ácido débil (DEAE). forma más estrecha y los más ácidos o menos básicos, se unirán menos.
  • 6. 6 A B C D C D E Imagen 6. (A) Resina de intercambio catiónico antes de añadir la muestra. (B) Se añade la muestra, una mezcla de Asp, Ser y Lys. (C) Se añade Na+ (NaCl), el Asp, el aminoácido con menos carga positiva eluye el primero. (D) Se aumenta el Na+, a continuación eluye la Ser. (E) Imagen 5. Fases del procedimiento de cromatografía de Se aumenta el Na+, la Lys, el que posee más carga intercambio iónico. (A) Fase de Equilibrio en la parte positiva eluye el último. inferior. (A) y (B) Aplicación. (C) Elusión. (D) Regeneración.  FACTORES QUE AFECTAN LA RETENCIÓN 3. Elusión: Las moléculas captadas por el  Tiempo de retención (Tr): se describe como el intercambiador son eluídas debido a cambios en la tiempo que transcurre después de la inyección de composición del buffer. Una manera común es la muestra hasta que la mayor concentración del incrementando la fuerza iónica con cloruro de analito alcanza el detector (cuando se ha sodio u otra sal común. Los aminoácidos serán separado todo el analito), es decir, el tiempo que eluídos dependiendo de la carga neta que estos un compuesto tarda en salir de la columna. En la posean. A medida que se aumenta gradualmente cromatografía de intercambio iónico la retención el pH y la concentración de NaCl del medio está basada en la atracción entre iones del soluto eluyente acuoso, los aminoácidos descienden en y la carga complementaria de la fase estacionaria. la columna a velocidades diferentes y pueden Los intercambiadores iónicos favorecen la unión recogerse en muchas pequeñas fracciones. La de iones de mayor carga y radio inferior. Cuando disminución del pH protonará a los grupos de los la retención de los compuestos se ve afectada, se aminoácidos por lo que su carga neta tenderá a favorece la elusión de ellos para ser recolectados ser positiva, al revés si se aumenta el pH. Si se en una serie de fracciones. aumenta la concentración de sal, sus iones competirán mucho más por la resina y se intercambiarán por los grupos de aminoácidos.  pH: Los intercambiadores iónicos se clasifican en ácidos o básicos, fuertes o débiles. Las resinas Las diversas fracciones pueden analizarse ácidas fuertes siguen ionizadas incluso en cuantitativamente mediante la reacción con disoluciones muy ácidas, en cambio las resinas ninhidrina. Los aminoácidos aniónicos aparecen ácidas débiles se protonan a un pH próximo a 4 y primero y los más catiónicos aparecen pierden su capacidad de intercambio catiónico, posteriormente (con un intercambiador catiónico). reduciéndose así, el tiempo de retención. Los grupos muy básicos de amonio cuaternario siguen 4. Regeneración: Por último, remover las partículas siendo catiónicos a cualquier valor de pH. Los que aún están asociadas al intercambiador. Para básicos débiles de amonio terciario se ello se debe generar un cambio más drástico en el desprotonan en disoluciones moderadamente pH y la concentración salina. Ahora la fase básicas y pierden entonces su capacidad, estacionaria puede volver a ser utilizada. reduciéndose también el tiempo de retención. A B  Cargas: La fuerza de enlace de la muestra depende de la magnitud de la carga. La fuerza de retención es mayor y, por consiguiente la de elusión es menor, mientras más cargado se encuentre el compuesto, ya sea negativa (aniones) o positivamente (cationes). Los iones
  • 7. 7 polivalentes se unen con mayor fuerza a la fase  Porosidad: El tamaño del poro de la resina al que estacionaria que los monovalentes. se une el compuesto móvil por intercambio iónico influye directamente en la capacidad de unión. En membranas cuyo tamaño de poro es pequeño (menor de 600Å) no hay espacio suficiente para unir el ión dentro de dichos poros por lo que la cantidad de intercambiador por unidad de superficie es menor. Sin embargo, en membranas con tamaño de poro mayor (mayor de 600Å) se puede unir el compuesto móvil dentro de dichos poros, con lo que se incrementa la cantidad de intercambiador por unidad de superficie. La porosidad busca una mayor superficie de intercambio. Imagen 7. Muestra el intercambio catiónico a la izquierda desde los menos absorbidos a los más absorbidos. A la derecha se muestra la fuerza eluyente en el intercambio aniónico.  Gradiente: Aumentando la concentración de la fase móvil, los iones compiten cada vez más favorablemente con la muestra por los sitios Imagen 9. Donde existe mayor porosidad (derecha), se activos cargados de la fase estacionaria. puede unir el compuesto móvil dentro de estos poros incrementando la cantidad de intercambiador de superficie.  Supresor es de iones: La cromatografía iónica tardó en desarrollarse debido a la falta de un buen sistema de detección. La elección evidente es un detector conductimétrico. El problema es debido a la elevada concentración iónica necesaria para eluir a la mayoría de los iones en un tiempo razonable. Ello hace que la conductibilidad de la propia fase móvil sea muy elevada haciendo muy difícil la detección de pequeñas concentraciones de analito. Este problema se resolvió mediante un sistema supresor de conductibilidad colocado a la salida de la columna cromatográfica. Los primeros Imagen 8. Esquema del gradiente del Buffer con supresores fueron columna de intercambio iónico contraiones cargados negativamente. Se presenta un que convierten los iones del disolvente en gráfico con el poder de elusión (fuerza iónica) y el especies moleculares poco ionizadas y por lo tanto porcentaje de proteína eluída, que muestra una gradiente poco conductoras. Así, por ejemplo, cuando se directamente proporcional. separan cationes es frecuente emplear una
  • 8. 8 disolución de HCl como eluyente. La columna diferentes picos o manchas del cromatograma se supresora es anionica y contiene iones OH-. Al corresponden a los componentes de la mezcla paso de la fase móvil por la columna supresora separada. los Cl- son intercambiados por iones OH-. De este modo se ha sustituido el HCl muy conductor por A B H2O poco conductora. En la separación de iones es frecuente usar HCO3Na y CO3Na2 en la fase móvil. La columna supresora es en este caso catiónica. De este modo el Na+ es sustituido por H+ formándose un electrolito débil como H2CO3. A Imagen 11. Cromatograma. (A) Aniones. (B) Cationes. La cromatografía iónica es una variante de la cromatografía líquida de alta presión (HPLC). Es un método eficaz para la separación y determinación de iones, basado en el uso de resinas de intercambio iónico. Cuando una muestra iónica atraviesa estas columnas, los iones presentes sufren una separación debido a las diferentes retenciones que sufren al interactuar con la fase fija de las columnas analíticas. Una vez separada, la muestra pasa a través de un detector (conductimétrico, amperométrico, UV, etc.) donde se registra la señal obtenida respecto al tiempo de retención. El resultado son los cromatogramas donde la posición de los máximos nos indica el ión B presente (carácter Cualitativo) y su área nos indica la cantidad existente de dicho ión (carácter Cuantitativo)(6). Imagen 12. El Servicio de Análisis del ICB dispone de un cromatógrafo iónico Metrohm con columna Metrosep A Supp 5 y detector conductimétrico, que se emplea en la Imagen 10. (A) Esquema del mecanismo de supresión determinación de de iones. (B) Reacciones de supresión de iones. fluoruros, cloruros, nitritos, nitratos, bromuros fosfatos RESULTADOS y sulfatos. El cromatograma es el resultado gráfico de la cromatografía. En el caso de separación óptima, los
  • 9. 9 APLICACIONES tiempo de exposición celular a la misma. Como los eritrocitos son fácilmente permeables a la glucosa, el  MEDICIÓN DE LA HEMOGLOBINA GLICOSILADA nivel de la HbA1 en una muestra de sangre facilita la historia glicémica de los 120 días anteriores, que La diabetes mellitus(7) es una condición metabólica de corresponde a la vida media de estas células. En la incidencia creciente, caracterizada por disfunción en mujer en gestación, el estado de la glicemia se la homeostasis de la glucosa, con hiperglicemia relaciona con las últimas 4 semanas precedentes crónica por inmunodeficiencia absoluta o relativa. La debido al acelerado recambio de los eritrocitos. enfermedad es progresiva y asociada con alto riesgo de desarrollar compromiso vascular. La American Diabetes Association recomienda que el objetivo de todo tratamiento debe ser un valor de la La determinación de los niveles de glucosa en sangre HbA1 menor a 7% y que los médicos deben de y orina y de los cuerpos cetónicos en la orina reevaluar cualquier régimen de tratamiento en el que suministran una información muy útil para el los valores sean consistentemente mayores de 8%. tratamiento diario de la diabetes. Sin embargo, Estos valores específicos de la HbA1 se refieren sólo ninguno de estos tests facilita al paciente y al equipo a los que han sido obtenidos por medios validados de cuidados médicos un valor representativo y frente al método de referencia(9). cuantitativo de la glicemia a lo largo del tiempo. HbA1c (%) Promedio de Calificación La determinación de las proteínas glicosiladas, sobre Glicemias (mg/dl) todo de la hemoglobina y de las proteínas séricas, ha 5-6 80-120 Excelente añadido una nueva dimensión a la evaluación de la 6-7 120-150 Muy Bueno glicemia. Mediante una simple medida, estos tests 7-8 150-180 Bueno permiten cuantificar los valores de la glicemia media 8-9 180-210 Regular durante semanas e incluso meses, complementando 9-10 210-240 Problemático 10-11 240-270 Malo los análisis que el paciente lleva a cabo día a día. 11-12 270-300 Muy Malo La hemoglobina(8) es una proteína que se encuentra Tabla 1. La hemoglobina glicosilada (HbA1c) refleja la en los glóbulos rojos de la sangre (hematíes) y sirve concentración de la glucosa en los últimos 120 días. El para aprovisionar de oxígeno al resto de nuestras porcentaje de HbA1c se aumenta en proporción a las células y tejidos. Esta proteína se une a la glucosa cifras de glicemia que han precedido en las últimas 6-8 circulante por el torrente sanguíneo. El porcentaje de semanas. En general por cada 1% de aumento en la proteína unida a la glucosa es lo que se denomina HbA1c, evidencia un incremento en los promedios de hemoglobina glicosilada (HbA1). Esto sucede también glicemia de aproximadamente 30mg/dl. Una HbA1c de en las personas sin diabetes. Cuanto mayor es la 6% refleja un promedio de glicemia de 120mg/dl. Es deseable que las personas con diabetes mantengan un cantidad de glucosa en la sangre, más se une a las promedio de HbA1c inferior a 7%. proteínas y su porcentaje de unión indica cual ha sido la cantidad media de glucosa circulante durante el Existen varios métodos para la determinación de la tiempo de vida de la hemoglobina. hemoglobina glicosilada, a manera informativa se La HbA1 describe una serie de componentes estables encuentran las pruebas inmunoquímicas, la minoritarios de la hemoglobina que se forman electroforesis, la cromatografía de afinidad al borato, lentamente y sin intervención enzimática, a partir de la cromatografía líquida de alta presión y la la hemoglobina y la glucosa. La velocidad de cromatografía de intercambio iónico. formación de HbA1 es directamente proporcional al El método de cromatografía de intercambio iónico(10) nivel de glucosa en la sangre y al ciclo de vida de las se basa en la elusión diferencial de la hemoglobina proteínas glicosiladas. glicosilada por el cambio de carga que se produce en La hemoglobina es una de las proteínas de la sangre la molécula debido a la glicación del grupo amino que pueden glicosilarse en proporción a la terminal de la cadena. Para realizar el procedimiento concentración de glucosa en plasma, dependiendo se utiliza carboximetil celulosa cargada (-). solamente de la concentración de glucosa y del
  • 10. 10 El valor de la HbA1c ha mostrado su utilidad para predecir el riesgo del desarrollo de muchas de las complicaciones crónicas de la diabetes. La determinación de la HbA1c debe ser realizada rutinariamente en todos los pacientes con diabetes, en primer lugar para documentar el grado de control glicémico al inicio del tratamiento, y luego como parte del mismo. Para cada paciente individual, la frecuencia de la determinación de HbA1c dependerá del régimen de tratamiento utilizado y del criterio del médico. En ausencia Imagen 13. Esquema de las variantes de hemoglobina de estudios bien controlados que sugieran un encontradas en el torrente sanguíneo; incluye el protocolo definido, la opinión de los expertos es que porcentaje de HbA1 en estados “normales” en la sangre se deben practicar al menos dos determinaciones de para el control de la glicemia. la hemoglobina glicosilada en los pacientes bien controlados que se mantienen estables y al menos La hemoglobina adulta humana usualmente consiste cada tres meses en sujetos que no han alcanzado un de HbA (97% del total), HbA2 (2,5%) y HbF (0,5%). El nivel de glicemia óptimo o en los que se ha análisis cromatográfico de la HbA identifica distintas modificado el tratamiento. hemoglobinas menores llamadas HbA1a, HbA1b, HbA1c, que colectivamente se denominan HbA1, Como cualquier otro parámetro, la hemoglobina glicohemoglobinas o hemoglobinas glicadas. glicosilada puede resultar modificada por alteraciones que varíen el natural recambio de los glóbulos rojos, La hemoglobina glicosilada A1c es el componente tales como por hemorragias, anemia hemolítica, mayoritario (80%) de la hemoglobina A1. La HbA1c transfusiones, embarazos, etc., situaciones que es el resultado de la condensación de la glucosa con producirían falsos descensos. También se puede ver la valina N-terminal de la cadena β de la alterada por la ingestión de dosis elevadas de ácido hemoglobina. La incorporación de glucosa es un acetil salicílico, vitamina C, alcohol, altas cifras de proceso no enzimático e irreversible. lípidos en sangre, etc., que conducirían a falsos aumentos. La HbA1c puede valorar además el éxito del tratamiento antidiabético; permite comparar y comprobar la eficacia de nuevos tratamientos; nos posibilita determinar la duración de la hiperglicemia y a su vez individualizar los regímenes del control antidiabético. La hemoglobina glicosilada es muy importante, sin Imagen 14. La glucosa se una de las cadenas β de la embargo no puede sustituir al monitoreo de glicemias, hemoglobina en el extremo Val terminal, transformando ya que ésta no puede medir su control diario y por lo la HbAo en HbA1c. tanto no le permite ajustar sus dosis de
  • 11. 11 medicamentos orales, de insulina, de actividad física La Porfiria Intermitente Aguda (PAI) es una de las o de ingesta de alimentos en el día a día. más comunes y severas de las porfirias heredadas. Es un desorden autosómico dominante, que causa  DETERMINACIÓN DE PBG Y ALA EN ORINA deficiencia parcial de la actividad de la porfobilinógeno desaminasa (PBGD), tercera enzima Las porfirias son un grupo de enfermedades de origen de la ruta de síntesis del grupo HEM. genético o adquirido que tienen como característica común una alteración en la actividad de una o varias enzimas de la vía metabólica del grupo HEM, lo que ocasiona niveles anormalmente elevados de porfirinas o sus precursores (p. ej., ácido delta- aminolevulínico [ALA] y porfobilinógeno [PBG]). Estos se acumulan en los tejidos y se excretan en la orina y las heces. Las manifestaciones patológicas son producidas casi en su totalidad por los efectos sobre el sistema nervioso y la piel (11). Imagen 15. Estructuras químicas del Aminolevulinato y del porfobilinógeno. Imagen 16. Signos de una crisis aguda de porfiria. Cambio de Porfobilinógeno de coloración normal a Las variedades de porfiria que presentan Uroporfiria I en la orina reposa. sobreproducción de los precursores de las porfirinas - ácido delta aminolevulínico (ALA) y porfobilinógeno Cuando los pacientes con PAI presentan una crisis (PBG)- suelen presentar crisis agudas, las que aguda, disminuye la actividad de la PBGD y, como pueden ser muy graves y causa de muerte. Estas consecuencia los niveles de Porfobilinógeno (BPG) crisis se caracterizan por síntomas digestivos (dolor y/o Ácido 5- Aminolevulónico (ALA) en la orina se cólico, vómitos, estreñimiento), neuropsíquicos incrementan significativamente. Por lo cual es (paresias, parestesias, parálisis, confusión, depresión, necesario contar con un método que cuantifique estos alucinaciones y psicosis), cardiovasculares precursores metabólicos para una pronta (taquicardia e hipertensión) y otros (secreción confirmación del diagnóstico e inicio del tratamiento. inadecuada de la hormona antidiurética, intolerancia a Durante la crisis aguda, el PBG urinario aumenta de la glucosa, alteración de los niveles de la hormona del 20 a 200 mg/día, cuyos valores de referencia son de crecimiento e hipercolesterolemia). Su patogenia ha 0-4 mg/día, y la excreción de ALA se eleva sido explicada en parte por un efecto neurotóxico del aproximadamente a la mitad, 10-100 mg/día, cuando ALA y PBG, y por un déficit del grupo HEM(12). sus valores de referencia son 0-7mg/día. El método Los pacientes con variedades de porfirias que de Mauzerall-Granick y otros parecidos son los más presentan producción aumentada de porfirinas usados para la cuantificación de estos dos manifiestan fotosensibilidad debido a la activación de precursores(13). Este método se basa en la técnica de estos compuestos por acción de la luz UV. Las cromatografía de intercambio iónico, en la cual se alteraciones cutáneas se caracterizan por eritema y utilizan columnas con resinas aniónicas y catiónicas. ampollas, que al mejorar dejan cicatrices hiper o El PBG se queda retenido en la aniónica y el ALA en hipopigmentadas. la catiónica. En la columna con PBG, se utiliza ácido
  • 12. 12 acético 1M para que éste eluya y pueda ser intercambiadora de aniones empaquetada en cuantificado. En la columna con ALA, se le agrega columnas de polipropileno. La unión se produce bajo acetato de sodio 1M para que éste eluya y sea condiciones de baja salinidad y durante los pasos de cuantificado. Luego, el eluido de cada columna lavado y elusión se va incrementando la reacciona con Reactivo de Ehrlich, formando un concentración de sales en los tampones producto rojo intenso. Este reactivo está conformado correspondientes. Las impurezas se eliminan debido por 4-dimetilbenceno diluido en ácido acético y ácido a su diferente capacidad de unión y se obtiene una perclórico. El producto es medido rápida y eficiente purificación de los ácidos nucleicos espectrofotométricamente a 553 nm, y a partir de esta (ADN y/o ARN). Al final los ácidos nucleicos se eluyen medición se puede calcular la concentración de estos con un tampón de máxima salinidad. Por último, se intermediarios. precipita con isopropanol para lavar y eliminar todos los restos de impurezas, finalmente, se reconstituye el En casos de intoxicación por plomo pueden ADN de elevada pureza en un tampón de baja detectarse concentraciones de ALA elevadas en orina salinidad para su posterior utilización o también, ya que el plomo puede bloquear la vía almacenamiento. metabólica en la que interviene el ALA. Por lo tanto, la determinación conjunta de ALA y PBG permite Debido a la elevada pureza del ADN obtenido con diferenciar las porfirias de la intoxicación por esta tecnología, la principal aplicación de esta plomo(14). cromatografía es la purificación de ADN plasmídico para transfección (introducción de material genético  EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ÁCIDOS externo en células eucariotas mediante plásmidos). NUCLEICOS Esta técnica incluye un pretratamiento de la muestra que consiste en una lisis bacteriana en condiciones La cromatografía de intercambio iónico es el método alcalinas que ocasiona una desnaturalización del más utilizado para la separación de ácidos nucleicos. ADN cromosómico y plasmídico. Antes de la Un ácido nucleico con carga negativa a pH 7,0 se introducción de la muestra en la columna se trata con unirá a un intercambiador iónico con grupos cargados acetato potásico, lo que ocasiona que el ADN positivamente, pero eluirá de la columna al cambiar el cromosómico precipite junto con el resto de pH del tampón (tampón de elusión) ya que los iones componentes de la muestra, mientras que el ADN del tampón de elusión interaccionan con los grupos plasmídico se renaturaliza y permanece en disolución. cargados del ácido nucleico o del intercambiador iónico. Primero fluirán de la columna las moléculas  OTRAS APLICACIONES cargadas positivamente que no se unen a la fase estacionaria y posteriormente, al añadir el tampón de  Purificación de agua elusión, eluiran las moléculas con poca carga  Purificación del fibrinógeno de la leche negativa neta y luego las de mayor carga negativa  Determinación de anticonvulsantes en el suero neta(15). después de la extracción de la fase sólida.  Análisis de antibióticos de poliéter Actualmente se utilizan dos tipos de intercambiadores  Determinación de pesticidas. aniónicos(16): el metilaminoetanol (MAE) o el  Identificación de ácidos orgánicos en la fruta y en dietilaminoetil (DEAE). La unión del ADN (cargado el jugo. negativamente) depende principalmente del  Detección de derivación-fluorescencia post- componente estérico de los grupos funcionales y de columna para análisis para varios tipos de la afinidad del intercambiador aniónico por el pesticidas agrícolas . respectivo ácido nucleico; puesto que el grupo MAE  Determinación de metabolitos de Triptofan en el suero umbilical. es menos voluminoso y más hidrofílico que el DEAE, la unión de los ácidos nucleicos a los primeros es más efectiva que a los segundos. Una modificación de este método es la extracción en fase sólida, en la que se utiliza una matriz
  • 13. 13 CONCLUSIÓN BIBLIOGRAFÍA La cromatografía de intercambio iónico, también (1) http://www.textoscientificos.com/quimica/cromato llamada cromatografía iónica o cromatografía del ión, grafia es una técnica que permite la separación de iones y (2) Harris, Daniel C. “Análisis Químico Cuantitativo”, moléculas polares basada en las propiedades de 3ª Edición, Editorial Reverté. (Página 641). carga de las moléculas. Puede ser usada en casi (3) Freifelder, D. “Técnicas de Bioquímica y Biología cualquier tipo de molécula con carga. La solución que Molecular”, Editorial Reverté. (Página 217). debe inyectarse es llamada "muestra" y los (4) http://www.mnstate.edu/provost/IonExchangeProt componentes separados individualmente; “analitos”. ocol.pdf (5) http://www4.ujaen.es/~mjayora/docencia_archivo El intercambio iónico es el intercambio reversible y s/Quimica%20analitica%20ambiental/Tema6.pdf estequiométrico de iones entre una fase sólida y una (6) http://www.tulane.edu/~wiser/methods/handouts/ fase líquida. Si nos interesa separar analitos class/08_chrom.pdf catiónicos se utiliza una fase estacionaria que (7) Costanzo, Linda S. “Fisiología”, 2000, McGraw- contenga sitios activos negativos, los cuales deberán Hill, México. (Página 416). encontrarse unidos a algún catión que mantenga la (8) http://www.diabetesalinstante.com/index.php?id= electroneutralidad. Este catión deberá ser desplazado 7 por el analito para establecer el equilibrio y unirse al (9) Hernández Ventura, Jaime Roberto. “Importancia sitio aniónico de la fase estacionaria. De manera de la Hemoglobina Glicosilada”, SlideShare.net análoga, para separar aniones se utilizan fases (Documento Power Point). estacionarias con cargas fijas positivas que se (10) “Hemoglobina Glicosilada, el marcador de la encontrarán unidas a algún anión encargado de diabetes”. Diagnostics Roche. (Folleto mantener la electroneutralidad, y que será informativo) desplazado por el analito para el establecimiento del (11) http://manualmerck.tripod.com/MMCap14.htm (12) http://scielo.isciii.es/scielo.php?pid=S0212- equilibrio. 71992003000600012&script=sci_arttext Diversos factores como el pH, cargas, gradiente y (13) http://www.aebm.org/formacion%20distancia/dist porosidad afectan el tiempo que un compuesto ancia%202007-2008/taller/monografias/3.- %20PORFIRIAS.pdf demora en eluir de la columna (tiempo de retención). (14) http://www.biosimex.com.mx/pdf/insertos/CROM Los resultados se muestran en un cromatograma, que ATOGRAFIA/11017c.pdf es una representación gráfica de los resultados (15) http://interware.org/labeutm2006/wp- obtenidos; en el caso de separación óptima, los content/uploads/2007/09/practico-eutm.doc diferentes picos o manchas del cromatograma se (16) http://www.cultek.com/inf/otros/soluciones/Soluci corresponden a los componentes de la mezcla separada. ones-QPCR-protocolos.pdf **** Voet, Donald; Voet, Judith. “Bioquímica” 3a Este tipo de cromatografía presenta diversas Edición 2006 aplicaciones, en este informe se mecionaron la determinación de la hemoglobina glicosilada, **** Texto base guía para todo el desarrollo y determinación de PBG y ALA en orina y separación entendimiento de la investigación sobre cromatografía de ácidos nucleicos, pero su uso no termina allí, ya de intercambio iónico. que hay numerosos usos más, como por ejemplo, análisis de proteínas en la industria alimenticia con valor nutricional, y en la purificación del agua; así como también a lo largo de la historia cobró relevancia en el Proyecto Manhattan durante la segunda guerra mundial para la fabricación de la bomba atómica.