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IMPLEMENTACIÓN DE DOS BIOMARCADORES PARA LA DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD APOPTÓTICA, EN EL CBCM
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IMPLEMENTACIÓN DE DOS BIOMARCADORES PARA LA DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD APOPTÓTICA, EN EL CBCM

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La apoptosis es una muerte genéticamente controlada, que se activa para eliminar células embrionarias y enfermas, permitiendo el desarrollo y el buen funcionamiento del organismo sin afectar a las …

La apoptosis es una muerte genéticamente controlada, que se activa para eliminar células embrionarias y enfermas, permitiendo el desarrollo y el buen funcionamiento del organismo sin afectar a las células normales. Debido a ello, este tipo de muerte se ha convertido en una de las mejores alternativas para el desarrollo de nuevos antineoplásicos capaces de activar esta vía de muerte, con el objetivo de evitar respuestas desfavorables en los pacientes que generalmente se desarrollan con la quimioterapia. Las técnicas que permiten determinar apoptosis han evolucionado a través de los años desde que Kerr, mediante el microscopio electrónico descubrió este modelo de muerte celular. En el CBCM de la UTPL, se han implementado dos de estas técnicas con la ayuda de los biomarcadores Caspasa 3 y Anexina V, permitiendo la determinación de la activación de caspasas y la externalización de la Fosfatidilserina respectivamente; eventos característicos que ocurre solo en condiciones apoptóticas. Para ello se empleó el modelo biológico RKO y el antineoplásico Doxorrubicina como agente inductor.

Palabras Clave: Apoptosis, Biomarcador, Anexina V, Caspasa 3.

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  • 1. UNIVERSIDAD TÉCNICA PARTICULAR DE LOJA La Universidad Católica de Loja
  • 2.  
  • 3. <ul><li>Muerte Celular Programada. </li></ul><ul><li>“ Suicidio” para beneficio del organismo. </li></ul><ul><li>No afecta a células vecinas, no produce inflamación. </li></ul><ul><li>Etapas </li></ul><ul><ul><li>Inicio </li></ul></ul><ul><ul><li>Decisión </li></ul></ul><ul><ul><li>Ejecución </li></ul></ul><ul><ul><li>Ablución </li></ul></ul>Proliferación Muerte E
  • 4. <ul><li>Fisiológicamente </li></ul><ul><ul><li>Remodelamiento </li></ul></ul><ul><ul><li>Liberar espacio </li></ul></ul><ul><ul><li>Formar un nuevo tejido </li></ul></ul><ul><ul><li>Eliminar células sobrantes </li></ul></ul><ul><li>Patológicamente </li></ul><ul><ul><li>Agentes Externos: bacterias, </li></ul></ul><ul><ul><li>virus, radiación, etc. </li></ul></ul><ul><ul><li>Agentes Internos: mutaciones </li></ul></ul>
  • 5. <ul><li>Activación de la maquinaria de reparación. </li></ul><ul><li>Activación de las vías de la Apoptosis </li></ul>Vía Extrínseca Vía Intrínseca Caspasa 3 APOPTOSIS Caspasa 8 p53 Citocromo c Bcl-2 Bax Apoptosoma TNF, etc. Radiación Quimioterapia, etc.
  • 6. <ul><li>Debilitamiento del citoesqueleto y membrana citoplasmática </li></ul><ul><li>Degradación del núcleo y condensación del material genético. </li></ul><ul><li>Degradación de Organelas. </li></ul><ul><li>Formación de Cuerpos Apoptóticos. </li></ul>Célula Normal Proceso Apoptótico Cuerpos Apoptóticos
  • 7. <ul><li>Receptores de reconocimiento: </li></ul><ul><ul><li>Fosfatidil Serina (FS) </li></ul></ul><ul><li>Membrana citoplasmática es dependiente de ATP. </li></ul><ul><li>Liberación de citocromo c implica una disminución de la reserva energética y perdida de la estabilidad de la membrana citoplasmática. </li></ul>= FS Célula Normal Matriz Extracelular Citoplasma Macrófagos Cuerpos Apoptóticos Macrófago Receptor de FS ATP Célula Apoptótica ATP
  • 8. <ul><li>Principal causa de mortalidad a nivel mundial. </li></ul><ul><li>Proliferación incontrolada de células anormales. </li></ul><ul><li>Las células evaden la Apoptosis y adoptan un nivel de proliferación ilimitado originando una carcinogénesis. </li></ul>Proliferación Muerte CARCINOGÉNESIS Célula Afectada Célula Normal
  • 9. <ul><li>Activación de Apoptosis sobre células tumorales resulta ser una de las mejores estrategias para el tratamiento del cáncer. </li></ul><ul><li>Quimioterapia: </li></ul><ul><ul><li>No es específica </li></ul></ul><ul><ul><li>Afecta a las células normales </li></ul></ul><ul><ul><li>Efectos adversos </li></ul></ul><ul><li>Compuestos capaces de Inducir apoptosis e inhibir la proliferación celular descontrolada. </li></ul>
  • 10. <ul><li>Necrosis: </li></ul><ul><li>Senescencia: Perdida de la capacidad de replicación. </li></ul><ul><li>Autofagia: Autofagocitosis. </li></ul><ul><li>Oncosis: Perdida de Reserva Energética. </li></ul><ul><li>Piroptosis: Caspasa 1. </li></ul>Célula Normal Proceso Necrótico Respuesta Autoinmune linfocitos
  • 11. <ul><li>Los eventos bioquímicos durante la apoptosis pueden ser detectados a través biomarcadores . </li></ul><ul><li>Indicadores de uno o varios procesos, pueden ser medidos y analizados. </li></ul>
  • 12. + Ac-DEVD pNA Caspasa 3 Ac-DEVD pNA
  • 13. Célula Apoptótica Anexina V FLUOS Ca 2+ = FS Radiación Fluorescencia en campo oscuro Célula Apoptótica Célula Necrótica
  • 14.  
  • 15. <ul><li>General: </li></ul><ul><ul><li>Implementar dos diferentes ensayos que permitan la determinación de muerte celular por apoptosis en la línea celular RKO, expuestas durante 24 h a diferentes dosis de Doxorrubicina. </li></ul></ul><ul><li>Específicos: </li></ul><ul><ul><li>Desarrollar curvas Dosis/Respuesta para establecer las dosis a probar de Doxorrubicina mediante el ensayo de viabilidad por captación de: FDA-BrEt. </li></ul></ul><ul><ul><li>Determinar la actividad de caspasa 3 mediante el ensayo “CaspACE™ Assay System, Colorimetric” en respuesta a las dosis de Doxorrubicina establecidas. </li></ul></ul><ul><ul><li>Mediante el ensayo de Anexina V, determinar el índice de células en apoptosis en respuesta a las dosis de Doxorrubicina establecidas. </li></ul></ul>
  • 16.  
  • 17. RKO (Carcinoma de Colon) Tratamiento 24 h Incubación Cosecha EXTRACTO CELULAR 0,5 µM 1 µM 2,5 µM 5 µM 37ºC 5% CO 2 24 h Incubación 37 ºC, 5% CO 2
  • 18. EXTRACTO CELULAR Conteo Microscopio de Fluorescencia Vivas Muertas Agonizantes FDA BrEt Tinción con Solución de Trabajo Lavados
  • 19. 405 nm BRADFORD µg/mL Proteína Curva Estándar: ASB Incubación a Temperatura Ambiente: 30min Incubación a 37 ºC, 4 h Lisis Celular Extracto Proteico Ac-DEVD p-NA Espectrofotómetro 620 nm
  • 20. EXTRACTO CELULAR Microscopio de Fluorescencia Lavados BrEt Tinción con Solución de Trabajo Anexina V FLUOS Ca 2+ Conteo Vivas Muertas APOPTÓTICAS
  • 21. <ul><li>Cada ensayo fue realizado por duplicado en tres experimentos independientes </li></ul><ul><li>Analizados mediante es Software estadístico “GraphPad”, a través del test de Dunnet y Tukey </li></ul>
  • 22.  
  • 23. <ul><li>La activación de apoptosis en células tumorales resulta ser una de las mejores estrategias para el tratamiento del cáncer. </li></ul><ul><li>La Dxo permitió implementar dos biomarcadores para la detección de apoptosis. </li></ul>Control 0,5 μ M Dxo 1 μ M Dxo 2,5 μ M Dxo 5 μ M Dxo
  • 24. Smukste, et al. 2006 MTT: C-26 (Cáncer de Colon) 1 µM Dxo – 24 h 40 % Viabilidad Han, et al . 1997 Eficiencia en Placa: Rat-1 (Fibroblastos de Rata) 0,1 µM Dxo – 24 h - 90 % Viabilidad
  • 25. El sustrato Ac-DEVD-pNA tambien puede ser clivado por las caspasas: 7, 1, 4 y 6. Tong, et al . 2000 U-937 (Cáncer leucémico) 20 Gy/min de radiación 0,250 nm aproximadamente La línea celular MCF-7 no expresa caspasa 3.
  • 26. Thompson, et al . 2004 RKO, 0,5 µM Dxo – 48 h 90 % de células apoptóticas
  • 27. La vía de muerte apoptótica no es estática. Ambos biomarcadores se activan en tiempos diferentes. A pesar de que las células entren en apoptosis tardía, la actividad de la caspasa 3 todavía no decrece y dependiendo de las condiciones, puede seguir clivando a sus sustratos.
  • 28.  
  • 29. <ul><li>1 µM de Dxo, es una adecuada concentración para ser aplicada en ensayos de viabilidad y de inducción de apoptosis. </li></ul><ul><li>Para determinar el tipo de muerte que induce un compuesto citotóxico es importante escoger adecuadamente el modelo biológico, el biomarcador y el tiempo en cual se hace la cuantificación. </li></ul><ul><li>La Caspasa 3 y Anexina-V, son biomarcadores para la determinación de apoptosis. </li></ul><ul><li>Ambos miden distintos proceso, y son igual de útiles y complementarios entre sí. </li></ul>
  • 30.  

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