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The in vitro choice   d ramos-2013
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  • 1. in vitro] [TOX David Ramos Investigador CERETOX dramos@pcb.ub.cat Jornada: The in vitro choice 29 de Noviembre de 2013 Parc Científic de Barcelona
  • 2. ¿El modelo ideal? HUMANOS IN VIVO IN VITRO IN SILICO REALIDAD A C E R C A M I E N T O Perdida de información
  • 3. ¿Por qué In vitro? 1 Forma parte del avance tecnológico 2 Throughput (screening molecular) 3 Tiempo (días, semanas vs años) 4 Coste (- maquinaria + persona ) 5 Menor gasto de molécula (µg vs g) 6 Moral/Ética (Refinamiento, reemplazo, reducción) 7 Obligaciones legales (pharma vs cosmética)
  • 4. Técnicas validadas Toxicidad sistémica OECD ICCVAM ECVAM FDA VALIDAN TÉCNICAS IN VITRO Genotoxicidad Reprotoxicidad Carcinogénesis Tolerancia local
  • 5. Toxicidad sistémica 3 Rs Reducción, refinamiento Reducción, refinamiento Reducción, refinamiento Reducción, refinamiento MTT Assay - Acute oral Toxicity 3T3 NRU Phototoxicity Test Fototoxicidad Mecanismo Endpoint Neutral red uptake/IC50 Vibilidad celular Vibilidad celular ICCVAM Neutral Red Uptake Compound 4 001 001 OECD 432 IC50 100 090 080 070 060 050 040 030 020 010 000 000 ICCVAM MTT uptake/IC50 ECVAM 17 Exposicion UVA viabilidad Neutral red Normativa Neutral red uptake/IC50 Vibilidad celular Cell Number (% Viable) ACUTE SYSTEM TOXICITY Ensayo 3T3 NRU - Acute oral Toxicity - Fixed Dose Procedure Normal human epidermal keratinocyte NHK - Acute oral Toxicity - Fixed Dose Procedure 002 002 003 Log Concentration (µM) IC50 (µM) MTT Compound 4 [LB, UB] 88.79 [76.12, 102.26]
  • 6. Genotoxicidad Ensayo Ames Test - Bacterial Reverse Mutation Test 3 Rs Mecanismo Endpoint Mutagenicidad en Colonias revertintes Reducción S. typhymurium vs espontáneas. Translocaciones y In Vitro Mammalian Chromosome Alternaciones Reducción perdidas de Aberration Test cromosómicas cromosomas GENOTOXICITY Colonias mutantes Mutagenicidad en en medio selectivo In Vitro Mammalian Cell Gene Mutation Reducción vs colonias en medio TK cell Test no selectivo MNT in vitro - In vitro Mammalian Cell Alteración nuclear MN generados en Reducción Micronucleus Test post-mitosis celulas binculeadas DNA Single Strand Damage - Comet Daño en el DNA, Refinamiento Tamaño cola Comet Assay electroforesis Ensayo Normativa OECD 471 OECD 473 OECD 476 OECD 487 ASTM E2186 3 Rs Normativa In Vitro Sister Chromatid Exchange Assay in Mammalian Cells Reducción OECD 479 Saccharomyces cerevisiae, Gene Mutation Assay Reducción OECD 480 Reducción OECD 481 DNA Damage and Repair, Unscheduled DNA Synthesis in Mammalian Cells in vitro Reducción OECD 482 Escherichia coli, Reverse Assay Reducción OECD 472 OTRAS GENOTOXICITY Saccharomyces cerevisiae, Mitotic Recombination Assay
  • 7. Genotoxicidad MN In vitro Ames Test Comet Assay Aberraciones cromosómicas
  • 8. Toxicidad en la reproducción Ensayo REPROTOX EST MM Mecanismos Endpoint Directive Citotoxicidad IC50 3T3, IC50 D3, EST Embryonic Stem Cell Test Reemplazo parcial 3T3/D3 + Gota ECVAM 113 ID50 pendiente D3 Extremidades IC50 para la embriones + MM Micromass Embryotoxicity Assay Refinamiento ECVAM 114 inhibición y citotoxicidad 5 dias citotoxicidad + Alcian blue IC50 ICMAX for Cultivo de WEC Whole rat Embryo Embryotoxicity malformations; ECVAM 123 Refinamiento embriones Test ICNOEC for Total expuestos Morphlogical score Exposición embrión Alteraciones FET Refinamiento OECD 236 zebrafish morfologicas embrion Cultivo ES-D3 Extracción miembros 3 Rs Día 0 Día 3-5 Tinción NR Día 10 Tinción Alcian Blue
  • 9. Carcinogénesis Test Method CARCINOGÉNESIS 3 Rs CTA – Balb/c 3T3 Cell Transformation Assay Reemplazo CFE Citotoxicity Dia 46 estudio: contaje de focos Mecanismo CFE citotoxicity + ½ Fase testado como inductor o promotor Endpoint Focos Tipo III transformantes Focos tipo III Directive OECD Draft 31 ECVAM Recomendation
  • 10. Tolerancia local Ensayo In Vitro Skin Corrosion: Human Skin Model Test Episkin, Epiderm) SKIN CORROSION CORROSITEX - In Vitro Membrane Barrier Test Method for Skin Corrosion SKIN IRRITATION RHE Model Test (Episkin, Epiderm) DERMAL PENETRATION Skin absorption TESTING HEMOLISIS Red Blood cell test LLNA /BrdU 3 Rs Mecanismo Endpoint OECD Reemplazo Exposición producto sobre RHE Viabilidad por MTT OECD 431 Tiempo necesario para corroer membrana OECD 435 Viabilidad por MTT OECD 439 Reemplazo Reemplazo Refinamiento Reemplazo Refinamiento SENSIBILIZACIÓN hCLAT Reemplazo Membrana sintética Exposición producto sobre RHE Cámara Franz con % molécula recuperada fluido donador y OECD 428 receptor Exposición de la Hemolisis 50% sustancia en eritrocitos ECVAM 99 aislados Exposición en ratón, Cantidad de timidina tritiada OECD extracción nódulos recogida 429/442 linfáticos Exposición a células THP1 Detección de receptores CD86-54 Draft
  • 11. Tolerancia local Ensayo BCOP - Bovine Cornea Opacity Test EYE ICE - Isolated chicken eye test IRRITATION HET-CAM - Hen's egg test - chorioallantoic membrane 3 Rs Mecanismo Endpoint Exposición a Opacidad de la Reemplazo parcial corneas cornea bovinas Opacidad y Exposición a Reemplazo parcial fluorescencia e corneas hinchazón Huevos Hemorragia, lisis Reemplazo parcial fertilizados de los vasos, post-10d coagulación Directiva TG 437 TG 438 ECVAM 047
  • 12. Un futuro prometedor Tenemos un mayor conocimiento de los mecanismos moleculares Estamos más cerca de sustituir el uso de animales Debemos avanzar hacia modelos que nos acerquen a la realidad Los ensayos in vitro representarán en un futuro próximo una parte muy importante en el desarrollo de un nuevo producto y en la fase regulatoria.
  • 13. En CERETOX tenemos una amplia experiencia en hacer todas estas técnicas CERETOX Parc Científic de Barcelona - Edifici Cluster c/Baldiri Reixac, 10-12 08028 Barcelona T. 93 403 71 83 www.pcb.ub.cat/ceretox ceretox@pcb.ub.cat http://goo.gl/BGLwt http://goo.gl/VBsu7