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Medios de cultivo

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  • 1. Medios de Cultivo Técnicas de Cultivo Celular
  • 2. Medio definidoDesarrollo de medios Medios naturales extractos de tejidos, fluidos corporales suero, linfa Líneas celulares-medios químicamente definidos Eagles Basal Medium 1955 Eagles minimal Essential Medium MEM 1959 Medios suplementados suero, proteínas, extracto de embrión
  • 3. Medios definidos Medios especializados–tipos de células RPMI1640 limfoblastoides Leibovitz L15 elimina añadir CO2 y NaHCO3
  • 4. Tipos de medio de cultivo Definidos (sin suero): compuesto por elementos cuya composición química y concentración están perfectamente determinados. Medio solo o con agregados de formulaciones especiales. MEM: medio esencial mínimo, 27 factores esenciales para el crecimiento celular. DMEM: medio esencial mínimo modificado. HamF12: MEM + albúmina, transferrina, insulina y piruvato de sodio
  • 5. Tipos de medio de Cultivo No definidos (con suero o hidrolizados proteicos): tienen componentes cuya composición química y concentración no están determinados. Medios de mantenimiento: células con metabolismo basal (MEM + 2% de suero) Medios de crecimiento: activación del ciclo celular (MEM + 10% de suero)
  • 6. Medio definido y suplementado El medio de cultivo estará formado por cuatro elementos : La naturaleza del sustrato o fase en que crecen las células. Las condiciones físico-químicas y fisiológicas del medio. La naturaleza y composición de la fase gaseosa. Las condiciones de incubación, especialmente la humedad y la temperatura
  • 7. Propiedades Fisicoquímicas pH CO2 y Bicarbonato Amortiguadores Oxigeno Osmolaridad Temperatura Viscosidad Tensión superficial
  • 8. Propiedades FisicoquímicaspH Líneas celulares pH 7.4 Líneas fibroblasto pH 7.4 - 7.7 Líneas células transformadas pH 7.0-7.4 Células epidermales pH 5.5
  • 9. Propiedades FisicoquimicaspH Indicador de pH Rojo fenol Color apreciación subjetiva Sistema de estándares Concentración, botella, espacio de aire
  • 10. CO2 y Bicarbonato El bióxido de carbono juega un papel en el medio, debido a que influye en la cantidad de CO2 disuelto, el pH y la cantidad de iones HCO3-
  • 11. CO2 y Bicarbonato CO2 en fase gas se disuelve en el medio establece equilibrio con HCO3- La tensión superficial del CO2 regula la concentración del CO2 disuelta y produce H2CO3 H2O + CO2 <=> H2CO3 <=> H+ + HCO3-
  • 12. CO2 y Bicarbonato Ión bicarbonato HCO3- Aumento en CO2 atmosférico, baja el pH y es neutralizado por aumento en bicarbonato. NaHCO3 Na+ + HCO3-
  • 13. CO2 y Bicarbonato Para establecer un pH determinado se debe tener en cuenta especialmente los niveles de bicarbonato sódico y la tensión de CO2. Cada medio tiene una concentración recomendada de bicarbonato y tensión de CO2 para alcanzar el pH correcto
  • 14. CO2 y Bicarbonato Se emplean amortiguadores en la formulación de muchos medios en la actualidad, lo que permite una estabilidad superior del pH en el medio, así como una mayor capacidad amortiguadora Goods buffers : HEPES, Tricina,.. (Good et al., 1966)).
  • 15. Fase gaseosa Fase líquida Dióxido de ión bicarbonato HEPES carbono atmosférico 4 mM 10 mM 2% 8 mM 20 mM 5% 24 mM 50 mM
  • 16. Amortiguadores Se requieren en: platos abiertos, sobrepoblación de células transformadas Más utilizado ión bicarbonato baja toxicidad bajo costo beneficios nutricionales HEPES amortiguador fuerte a pH 7.2-7.4
  • 17. Oxígeno Células en cultivo principalmente glucólisis Tensión de O2 evita toxicidad Cultivos de órgano, embriones y células adultas requieren 95% en fase gaseosa Cultivos de células dispersas requieren concentraciones más bajas
  • 18. Osmolaridad Cultivos toleran un gran alcance de presión osmótica Osmolaridad 260-320mosmol/Kg. mayoría de las células Adición de HEPES y drogas pueden afectar osmolaridad
  • 19. Temperatura Depende del cuerpo de origen 37oC homeotérmicos, 38.5 pájaros Poiquilotérmicos 15-26 oC Líneas mutantes sensitivas a temperatura Afecta crecimiento, pH y solubilidad de CO2
  • 20. Viscosidad Influenciada por el suero Importante en disociación celular
  • 21. Tensión de superficie Denaturación de proteínas puede aumentar la tensión y ocasionar riesgos de contaminación
  • 22. Composición del medio Todo medio de cultivo está formado por los siguientes elementos : Soluciones salinas equilibradas (BSS) Aminoácidos Vitaminas Otros suplementos orgánicos de bajo peso molecular Hormonas y factores de crecimiento (suero). Inhibidores del crecimiento de los contaminantes (antibióticos y antifúngisidas)
  • 23. Soluciones salinas equilibradas (BSS) Es una mezcla de sales inorgánicas, incluyendo usualmente bicarbonato sódico, y suplementada con glucosa. Se usan para diluir medios más completos, o para incubaciones cortas que requieren un medio isotónico no completo nutricionalmente.
  • 24. Medio Completo Medio definido y suplementos como suero, factores de crecimiento y hormonas Medio definido amino ácido, vitaminas, sales, glucosa, suplementos orgánicos
  • 25. Medio Completo Suero factores de crecimiento proliferación factores de adhesión adhesión celular minerales lípidos hormonas
  • 26. Medios Completo Antibióticos Reducen la contaminación No incluido en la mayoría de los medios Desventajas: resistencias, micoplasma efectos anti-metabólicos