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 Curso de Genómica - UAT (VHIR) 2012 - Arrays de Proteínas Zeptosens
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Curso de Genómica - UAT (VHIR) 2012 - Arrays de Proteínas Zeptosens

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  • 1. Institut de RecercaHospital Universitari Vall d’HebronInstitut d’Investigació Sanitària de l’Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) Arrays de Proteínas ZEPTOSENS 5 de Diciembre del 2012
  • 2. Programa1 Arrays de Proteínas2 Servicio Arrays de Proteínas UAT: Tecnología Zeptosens3 Flujo de trabajo de un ensayo con Reverse Protein Arrays4 Optimización del Servicio en la UAT5 Resultados y Análisis de Datos77 6 7
  • 3. Arrays de Proteínas 1 Definición  Es una técnología de alto rendimiento que permite el estudio en forma simultánea y masiva de miles de protéinas.  Dispositivo que utiliza proteinas inmovilizadas de forma ordenada en soportes sólidos (vidrio, bolas, pocillos) para ser posteriormente interrogadas con otras moléculas con el fin de detectar interacciones específicas. Ventajas  Rápida, automatizada  Muy sensible  Económica, consume pequeñas cantidadades de muestra y reactivos  Muchos datos a partir de un experimentoÁreas de aplicación:1.- Diagnóstico: Descubrir nuevos biomarcadores; efecto de nuevos fármacos.2.- Proteómica: Estudio de perfiles diferencial de protéinas3.- Análisis funcional Proteico: Interacciónes proteina-proteina; propiedades de unión al ligando dereceptores; actividad enzimática.4.- Caracterización de Anticuerpos: reactividad cruzada y especificidad; epitope mapping.
  • 4. Arrays de Proteínas1 Tipos de Arrays de Proteínas
  • 5. Arrays de Proteínas 1 Necesidad de la técnica El elevado grado de redundancia de las vías de señalización celular pueden compensar vías de transducción anómalas. La cantidad de mRNA a menudo no es un reflejo de los niveles de expresión protéica. El análisis del mRNA no proporciona información acerca de las modificaciones post-transduccionales a las que están sometidas las proteinas. Los cambios genéticos pueden ser detectados en biopsias de tejido tumoral, pero la sangre y otros fluidos corporales contienen poca o ninguna cantidad de mRNA para propósitos diagnóstico.
  • 6. Programa1 Arrays de Proteínas2 Servicio Arrays de Proteínas UAT: Tecnología Zeptosens3 Flujo de trabajo de un ensayo con Reverse Protein Arrays4 Optimización del Servicio en la UAT5 Resultados y Análisis de Datos77 6 7
  • 7. Servicio Arrays de Proteínas UAT: Tecnología Zeptosens2
  • 8. Servicio Arrays de Proteínas UAT: Tecnología Zeptosens 2Esta tecnología se basa en el Principio de Arrays en fase ReversaConducción planar de ondas. Gracias aldiseño del vidrio donde se crean los arrays (RPA=Reverse Protein Array)podemos excitar solo la muestra y reducir elruido de fondo.
  • 9. 2 Servicio Arrays de Proteínas UAT: Tecnología ZeptosensZeptoMark RPA Distribución Muestras en el chip: Tipo de Muestras que admite el chip: • 1x32x4_3T_AAAAAA • Lisados proteicos de tejidos • Lisados proteicos de cultivos de células • 3x32x4_3T_ABCABC • Suero • Orina • 6x32x4_3T_ABCDEF
  • 10. 2 Servicio Arrays de Proteínas UAT: Tecnología ZeptosensEquipamiento ZeptoGOG Zeptocarrier Chip blocking Station Lysis buffer & Spotting Arrayer- Cell Lysate Spotter Buffer Nanoplotter 2.1 (80 chips/480 arrays) Zeptoreader Microarray Reader
  • 11. 1 Servicio Arrays de Proteínas UAT: Tecnología Zeptosens
  • 12. Programa1 Arrays de Proteínas2 Servicio Arrays de Proteínas UAT: Tecnología Zeptosens3 Flujo de trabajo de un ensayo con Reverse Protein Arrays4 Optimización del Servicio en la UAT5 Resultados y Análisis de Datos77 6 7
  • 13. Flujo de Trabajo 3 1 2 3 4 rd fo ad Br de st Te 8 7 6 5Test de Bradford para la Normalización del lisado protéico a 2 mg/ml. Los pasos 1-3 los realiza el usuario y el resto el personal técnico de la UAT.
  • 14. Flujo de Trabajo 3 Guía Experimental Arrays de Proteínas Elaboración del Diseño experimental entre las partes implicadas en la realización del experimento.Consideraciones: • Aplicación • Elección de Anticuerpos. Los anticuerpos los proveerá el usuario. Zeptosens dispone de una listavalidada de anticuerpos: Zeptosens dispone de: list of validated antibodies:http://www.zeptosens.com/en/pdf/ZeptoMARK_Reverse_Array_Validated_Antibodies_LR.pdf • En caso de necesitar un Anticuerpo que no figure en la lista, se requerirá una validación previa delmismo. La obtención del Lisado proteico la realiza el usuario. Consideraciones: • Diferentes protocolos con diferentes tampones de lisis en función fuente proteica • Si la fuente protéica es a partir de suero, se recomienda la realización del llamado proceso de depleción de plasma, con el que se eliminan las proteinas más abundantes así como tb las inmunoglobulinas, previa alespoteado de la muestra. (IgY/Supermix plasma depletion columns; Genway, from Sigma-Aldrich) La cuantificación proteica (así como el resto de la técnica) la realiza la parte técnica responsable de laplataforma en la UCTS mediante Test de Bradford. Consideraciones: • Se necesitan 2.5 µl de lisado proteico para la cuantificación. • Para proceder al espoteado se recomienda empezar con un mínimo de 2 mg/ml de lisado proteico en unvolumen mínimo de 10 µl. En caso de no conseguir la mínima concentración recomendada es decisión del usuario lacontinuación del procedimiento del experimento o la obtención de más lisado proteico con el fin de conseguir lascantidades recomendadas.
  • 15. Programa1 Arrays de Proteínas2 Servicio Arrays de Proteínas UAT: Tecnología Zeptosens3 Flujo de trabajo de un ensayo con Reverse Protein Arrays4 Optimización del Servicio en la UAT5 Resultados y Análisis de Datos77 6 7
  • 16. 4 Optimización del Servicio en la UAT Fuente protéica:  Lisados celulares de MCF7 obtenidos por el personal técnico de la UCTS.  Lisados celulares de JIMT1 y KPL4 obtenidos por personal grupo Violeta (Onco).  Muestras humanas de orina obtenidas por personal grupo Ana Meseguer (dpt Nefropatologia renal) Fuente de Anticuerpos Primarios (Validados previamente por western Blot)  Comprados por la UCTS (AKT, p-AKT, P53, p-P53)  Cedidos por los usuarios Fuente de Anticuerpos Secundarios  Comprados por la UCTS El resto de reactivos necesarios, incluidos los arrays, son los que se compraron por la UCT en el 2010.
  • 17. 4 Optimización del Servicio en la UAT Obtención Lisado Proteico de MCF7 Test de BradfordLisado 1 1.4 mg/ml + + = Lisado Proteico ~70% confluentes 450 µl Tampón Lisis zeptosensLisado 2 + 3 mg/ml + + = Lisado Proteico 75 µl/pocillo ~70% confluentes ~50% confluentes Tampón Lisis zeptosens MCF7 es una línia celular humana de cáncer de mama. Tampón de Lisis CLB1, Zeptosens#9000 (75 µl/10cm2 pocillo en placas de 6p y 450 µl en placa de 60cm2) Cuantificación proteica mediante Test de Bradford (recomendado por zeptosens) El lisado proteico tiene que estar normalizado a 2 mg/ml.
  • 18. 4 Optimización del Servicio en la UAT EXPRESION PROTEICA DE PS6-240/244 EN MCF71A_Exp3Humidificat/estufa BSA-AlexaFluor647Lisado 1 Lisado 21.4 mg/ml 2 mg/ml L1 L2 L1 L2 Chip-1 1/500 L1 PS6-240/244 A L2 2 2 1 5 0.1 0.05 0. .15 0. 0.0 1/500 P53-p B 0. Mg/ml 0 1/500 P4EBP16S C L1 L2 1/250 PS6-240/244P D 1/250 AKT E 1/250 L1 L2 P4EBP16S F 2 0. .15 0.1 .05 0 0 Diluciones Lisado (Mg/ml)
  • 19. Programa1 Arrays de Proteínas2 Servicio Arrays de Proteínas UAT: Tecnología Zeptosens3 Flujo de trabajo de un ensayo con Reverse Protein Arrays4 Optimización del Servicio en la UAT5 Resultados y Análisis de Datos77 6 7
  • 20. Institut de Recerca Hospital Universitari Vall d’Hebron Institut d’Investigació Sanitària de l’Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) Resultados y Análisis de Datos de Zeptosens Arrays de Proteínas ZEPTOSENS 5 de Diciembre del 2012Ferran Briansó Castilla (UEB) ferran.brianso@vhir.org
  • 21. Programa 1 Arrays de Proteínas 2 Servicio Arrays de Proteínas UAT: Tecnología Zeptosens 3 Flujo de trabajo de un ensayo con Reverse Protein Arrays 4 Optimización del Servicio en la UAT 5 Resultados y Análisis de Datos 7 7 6 7Ferran Briansó Castilla (UEB) ferran.brianso@vhir.org
  • 22. Resultados y Análisis de Datos 55.1 - Visualizado y análisis básico de resultados (ZeptoView)5.2 - Exportar resultados5.3 - Análisis y representación de datos “a medida” en la UEB
  • 23. Visualización de resultados: Calcular datos a partir de las imágenes 5 Selector Panel de de visualización Árbol imágenes de resultados delexperimento (nodosexpandibles)
  • 24. Visualización de resultados: Calcular datos a partir de las imágenes5 Calcular resultados
  • 25. Visualización de resultados: Calcular datos a partir de las imágenes5 Configuración de parámetros
  • 26. Visualización de resultados: Árbol de selección de datos 5Selección del chip
  • 27. Visualización de resultados: de un array en un chip5 Selección del array
  • 28. Visualización de resultados: “Base Module” (RNFI values)5 Valores obtenidos por cada dilución
  • 29. Visualización de resultados: “Base Module” (RNFI values)5 Visualización del array completo
  • 30. Visualización de resultados: “Reverse Array Module” (RFI values)5 Valores calculados por cada posición
  • 31. Visualización de resultados: “Reverse Array Module” (RFI values)5 Gráfico de valores RFI calculados
  • 32. Visualización de resultados: “Concentration Series”5 Series de concentración (2 valores por cada dilución relativa)
  • 33. Resultados y Análisis de Datos 55.1 - Visualizado y análisis básico de resultados (ZeptoView)5.2 - Exportar resultados5.3 - Análisis y representación de datos “a medida” en la UEB
  • 34. Exportar resultados: tablas de RNFI5 Desde el nodo de imágenes exportar tablas RNFI
  • 35. Exportar resultados: tablas de RNFI5
  • 36. Exportar resultados: tablas de RFI5 Desde el nodo de imágenes exportar tablas RFI
  • 37. Exportar resultados: tablas de RFI5
  • 38. Exportar resultados: gráficos (?!?)5 Parámetros gráficos configurables caso a caso (no en global?!?!)
  • 39. Resultados y Análisis de Datos 55.1 - Visualizado y análisis básico de resultados (ZeptoView)5.2 - Exportar resultados5.3 - Análisis y representación de datos “a medida” en la UEB
  • 40. Análisis avanzado y representación de datos “a medida”5
  • 41. Análisis avanzado y representación de datos “a medida”5 Estudio de los valores obtenidos en cada serie de 8 lecturas de cada posición del array L1 L2 L1 L2 L1 L2 1 0.2 0.1 0.05 0.2 .15 0. 0.05 0 L1 L2 L1 L2 0.2 0.15 0.1 .05 0 Diluciones Lisado (Mg/ml)
  • 42. Análisis avanzado y representación de datos “a medida”5 Construcción de la regresión lineal y detección de valores extraños
  • 43. Análisis avanzado y representación de datos “a medida”5 según el nivel de confianza (usualmente a 95%) RFI = Valor predicho para una RelDilution de 0.625 límite superior de la predicción puntual límite superior de la predicción conjunta recta de regresión a partir de los 8 valores límite inferior de la predicción conjunta límite inferior de la predicción puntual lecturas reales a cada dilución relativa
  • 44. Análisis avanzado y representación de datos “a medida”5 Representación gráfica agrupando por experimentos, chips, arrays, anticuerpo factores secundarios ... Que nos permitan comparar muestras entre ellas, según condiciones expe- rimentales...
  • 45. Análisis avanzado y representación de datos “a medida”5
  • 46. Análisis avanzado y representación de datos “a medida”5 Otras formas de representación gráfica
  • 47. Análisis avanzado y representación de datos “a medida”5 Outputs (pdf, jpg...) hechos a medida (y con calidad para ser publicados!)
  • 48. Materiales disponibles en:http://ueb.vhir.org/NGS2012