INSTITUTO TECNOLÓGICO DE SONORA      “EFECTOS DE LA LUZ EN EL HONGO             ENTOMOPATÓENO           Metarhizium anisop...
RESUMENEl hongo entomopatógeno Metarhizium anisopliae se ha destacado por suamplia utilización en el control de numerosos ...
INDICE GENERALRESUMEN                                                            IINDICE GENERAL                          ...
2.2. Producción de hongos entomopatógenos.       2.2.1. Medios de Cultivo.       2.2.2. Formulaciones de Hongos Entomopató...
IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN.4.1. Efecto de la luz en el desarrollo asexual de M. anisopliae.4.2. Efecto de los diferentes t...
INDICE DE TABLAS1.- Bioinsecticidas basados en el hongo entomopatógeno Metarhiziumanisopliae.2.- Resultados de conteo dire...
INDICE DE FIGURAS1.- Microcultivos de M. anisopliae2.- Cajas de cartón con diferentes filtros.3.- Cambios morfológicos dur...
I INTRODUCCIÓN1.1. AntecedentesEl creciente interés en agentes biológicos para el control de insectos plagaocurre en parte...
completamente por micelio, el cual inicialmente es de color blanco pero setorna verde cuando el hongo esporula (Castillo, ...
1.4. Objetivos.1.4.1. Objetivo general.Estudiar el efecto de la luz en la reproducción asexual de Metarhiziumanisopliae1.4...
II MARCO TEORICO2.1. HONGOS ENTOMOPATÓGENOS.2.1.1 GeneralidadesLos primeros microorganismos que se encontraron causando en...
Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae infectan cerca de 100 especiesdiferentes de insectos en varios órdenes, pero a...
2.1.3.1. Adhesión de la espora a la cutícula del hospederoEl primer contacto que hace la espora con la superficie del hosp...
esclerotización y la presencia de sustancias antifúngicas y nutricionales(Charnley 1984). La fuerza mecánica es notable en...
2.1.3.4. Penetración a través de cuerpos abiertos.Los hongos pueden infectar insectos a través de la cavidad bucal, espirá...
integridad estructural de las membranas seguido de la deshidratación de lascélulas por pérdida de fluido (Alean, 2003).Pos...
2.2.1. Medios de Cultivo.Todos los medios de cultivo utilizados en micología deben contener losnutrientes suficientes para...
buena homogeneidad y distribución de las partículas del hongo, para poder sermanipuladas y aplicadas adecuadamente (Monzón...
absorber la humedad de las conidias y mantiene la viabilidad por un tiempoconsiderable. 2). Líquida o emulsificable que ut...
las condiciones fisiológicas del hospedante, su densidad y distribución espacialy temporal. Forman un complejo de factores...
2.3.2. Temperatura (T).La temperatura puede afectar la estabilidad de los patógenos en elalmacenamiento, durante las aplic...
2.3.4 Suelo.El suelo puede abrigar tanto a los insectos como a los entomopatógenos y esun ambiente complejo donde los micr...
especies, M. anisopliae (Metschnikoff) Sorokin y M. flavoviride Gams &Rozsypal. (Sosa-Gómez y Aalves, 1983)Las característ...
2.5.1. Trichoderma viride.La luz influye en varios procesos del desarrollo de los hongos de diferentesmaneras, esto puede ...
2.5.1.2. Fotorreceptores.La luz produce cambios fotobiológicos o fotoquímicos al ser absorbida por unao varias moléculas. ...
Dos proteínas son requeridas para la percepción de la luz azul en Neurosporacrassa, White collar (WC)-1 y WC-2. WC-1 es el...
III MATERIALES Y METODOS3.1. Ubicación.El estudio se realizó en el Laboratorio de Investigación y Desarrollo de laempresa ...
Para los diferentes tratamientos se incubó el hongo en un cuarto de cultivo auna temperatura de 26±2 ºC y a 65 ± 10% de hu...
Figura 1. Microcultivos con M. anisopliae.3.8. Microscopía óptica.Se estudió la reproducción asexual de de Metarhizium ani...
Figura 2. Cajas de cartón con diferentes filtros.Para la luz azul se utilizó un filtro azul (LEE 183, transmisión máxima d...
Las cajas de Petri se cubrieron en paquetes de tres con hojas de papelaluminio para simular la obscuridad, como control po...
IV RESULTADOS Y DISCUSION4.1. Efecto de la luz en el desarrollo asexual de Metarhizium anisopliae.M. anisopliae es un hong...
Con este ensayo se demuestra que la luz tiene un efecto significativo en eldesarrollo asexual de M. anisopliae. Estos resu...
Se ha reportado que Paeclomyces fumosoroseus la luz es determinante para laconidiación de este hongo, un pulso de luz azul...
desvaneciendo a color blanco hasta el centro de la colonia con pequeñas gotasde color anaranjado esparcidas entre las estr...
Figura 4. Morfología colonial y producción de conidios en M. anisopliaecultivado en diferentes condiciones de luz. a) luz ...
conidios, así mismo el tratamiento con luz azul mostró un incremento del 50 %más que el cultivo en obscuridad. En otro est...
Tabla 2. Resultados de conteo directo y viabilidad de conidios.                                      No. conidios         ...
(Sánchez-Murillo y cols, 2004); Sin embargo, la aplicación de los pulsos de luzen este caso fue desde las 24 h el cual no ...
Tabla 3. Viabilidad para las cajas en completa obscuridad y luz constantemedida como conidios por caja.                Luz...
que la luz constante es la mas apropiada para el desarrollo de conidios acomparación de su incubación en obscuridad. En un...
CONCLUCIONES► La luz afecta el desarrollo asexual de Metarhizium anisopliae, al cultivar elhongo en presencia de luz se ob...
BIBLIOGRAFIAAinsworth, G. 1973. Introduction and keys to higer taxa. In: “The Fungi: AnAdvanced Treatise”. Ainsworth, G., ...
J.; Rayner, A. y Walton, D. Cambridge University Press. Cambridge. pp 229-270.Campuzano, V., Galland, P., Alvarez, M. L. y...
Gillespie, J. P., Kanost, M. R., Trenczek, T. 1997.     Biological mediators ofinsect. Annual Review of Entomology. 42, 61...
Idnurm A. y Heitman J. 2005. Light controls growth and development via aconserved pathway in the fungal kingdom. Plos Biol...
Cubano de Investigaciones Azucareras. La Habana Cuba. Certificado de Autorde Invención. < http://www.ocpi.cu/doc/1989/t111...
Takahama, V., Shimizu-Takahama, M. y Egashira, T. 1982. Reduction ofexogenous cytochrome C by Neurospora crassa conidia: E...
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  1. 1. INSTITUTO TECNOLÓGICO DE SONORA “EFECTOS DE LA LUZ EN EL HONGO ENTOMOPATÓENO Metarhizium anisopliae” TESIS QUE PARA OBTENER EL TITULO DE INGENIERO BIOTECNOLOGO PRESENTA PAÚL VALDEZ LEYVACD. OBREGÓN, SONORA FEBRERO 2009
  2. 2. RESUMENEl hongo entomopatógeno Metarhizium anisopliae se ha destacado por suamplia utilización en el control de numerosos insectos, sin embargo a nivelindustrial no existen evidencias de la de la aplicación de luz para maximizar laproducción de conidios. Se utilizan diferentes filtros de luz los cuales abarcanen amplio espectro de UV visible como lo son: luz azul filtro azul (LEE 183,transmisión máxima de 450 nm). Para la luz verde filtro verde (LEE 124,transmisión máxima de 500 nm). Para la luz roja filtro rojo (LEE 019,transmisión máxima de 680 nm) y luz blanca provenientes de focos de 16 W.A las 60 h de cultivo se observó una gran cantidad de conidióforos y conidios,Mientras que a las 60 h de cultivo en obscuridad se observó la producciónescasa de conidióforos y conidios. Con respecto a la aplicación de luzconstante a los 10 días de cultivo, hay una producción de un orden demagnitud mayor que la exposición del hongo a los filtros de luz.La aplicación de pulsos de luz a las 36 h es mayor que los demás tratamientosen el cual se obtiene un incremento de 2.70 x106 UFC/caja el cual no essignificativo, por lo que se concluye que la aplicación de luz constante durantela incubación de M. anisopliae es la mejor opción para obtener mayor cantidadde conidios.
  3. 3. INDICE GENERALRESUMEN IINDICE GENERAL IIINDICE DE TABLAS IIIINDICE DE FIGURAS IVI. INTRODUCCIÓN.1.1.- Antecedentes.1.2.- Planteamiento del problema.1.3.- Justificación.1.4.- Objetivos. 1.4.1.- Objetivo general. 1.4.2- Objetivos Específicos.1.5.- Hipótesis.II. MARCO TEÓRICO.2.1. Hongos entomopatógenos. 2.1.1 Generalidades. 2.1.2. Clasificación taxonómica. 2.1.2.1 Subdivisión Deuteromycotina. 2.1.2.2. Clase Hyphomycetes. 2.1.3. Mecanismo de acción. 2.1.3.1. Adhesión de la espora a la cutícula del hospedero. 2.1.3.2. Germinación de la espora. 2.1.3.3. Penetración del integumento. 2.1.3.4. Penetración a través de cuerpos abiertos. 2.1.3.5. Reproducción en el hemocele. 2.1.3.6. Dispersión de las esporas.
  4. 4. 2.2. Producción de hongos entomopatógenos. 2.2.1. Medios de Cultivo. 2.2.2. Formulaciones de Hongos Entomopatógenos. 2.2.3. Reactivación de los Hongos Entomopatógenos.2.3. Factores que influyen en el establecimiento y acción de hongos entomopatógenos. 2.3.1. Humedad Relativa (HR). 2.3.2. Temperatura (T). 2.3.3. Radiación solar (RS). 2.3.4. Suelo. 2.3.5. Los agroquímicos y su efecto sobre los entomopatógenos.2.4. Metarhizium anisopliae.2.5. Estudios de luz en hongos. 2.5.1. Trichoderma viride. 2.5.1.1 Aspectos fisiológicos de fotoconidiación. 2.5.1.2 Fotorreceptores. 2.5.2. Neurospora crassa. 2.5.3. Phycomyces.III. MATERIALES Y METODOS3.1. Ubicación.3.2. Microorganismo.3.3. Conservación de la cepa.3.4. Medio de Cultivo.3.5. Condiciones de cultivo.3.6. Determinación de crecimiento.3.7. Microcultivos.3.8. Microscopía óptica.3.9. Fotoinducción de la conidiación.3.10. Determinación del periodo de competencia.3.11. Conteo directo de conidias.3.12. Determinación de la viabilidad.
  5. 5. IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN.4.1. Efecto de la luz en el desarrollo asexual de M. anisopliae.4.2. Efecto de los diferentes tipos de luz en la conidiación de M. anisopliae.4.3. Periodo de competencia de respuesta a la luz del hongo entomopatógeno Metarhizium anisopliae.CONCLUCIONES.RECOMENDACIONES.BIBLIOGRAFIA.
  6. 6. INDICE DE TABLAS1.- Bioinsecticidas basados en el hongo entomopatógeno Metarhiziumanisopliae.2.- Resultados de conteo directo y viabilidad de conidios.3.- Viabilidad para las cajas en completa obscuridad y luz constante medidacomo conidios por caja.
  7. 7. INDICE DE FIGURAS1.- Microcultivos de M. anisopliae2.- Cajas de cartón con diferentes filtros.3.- Cambios morfológicos durante la conidiacion de M. anisopliae.4.- Morfología colonial y producción de conidios en Metarhizium anisopliaecultivado en diferentes condiciones de luz.5.- Tubos de ensaye conteniendo esporas de M. anisopliae.6.- Viabilidad para los tratamientos con luz color blanca, obscuridad, luz verde,luz roja y luz azul.7.- Viabilidad para esporas de M. anisopliae.8.- Viabilidad para esporas expuestas a luz y a obscuridad.
  8. 8. I INTRODUCCIÓN1.1. AntecedentesEl creciente interés en agentes biológicos para el control de insectos plagaocurre en parte por la conciencia del peligro del uso indiscriminado deinsecticidas químicos. Además, las investigaciones publicadas en las últimasdécadas donde relacionan a los insecticidas químicos con mutaciones, cáncer,daños a la fauna y toxicidad a las plantas.Una posible alternativa es el control biológico de plagas. Este se realiza usandoagentes macroscópicos, depredadores y parásitos o agentes microscópicospatógenos, a este último se le conoce como control microbiano de plagas.Dentro de los agentes entomopatógenos se incluyen bacterias, hongos, virus,nemátodos y protozoos. Se caracterizan por su baja toxicidad sobre otrosorganismos del ambiente, por su facilidad para producirlo a escala industrial; secultivan, formulan, empacan, almacenan y se comercializan como uninsecticida convencional.Los hongos entomopatógenos son considerados como los patógenos máspromisorios contra insectos chupadores como el caso de los áfidos, escamas ymoscas blancas, ya que pueden infectar a los insectos directamente a travésde la penetración de la cutícula (Hajek y Leger 1994). Así como sus múltiplesmecanismos de acción que les confiere una alta capacidad para evitar que elhospedero desarrolle resistencia.Metarhizium anisopliae ataca naturalmente más de 300 especies de insectosde diversos órdenes. Entre las plagas afectadas por este hongo se encuentra elsalivazo de la caña de azúcar (Aeneolamia varia) y chinches plagas dediversos cultivos. Los insectos muertos por este hongo son cubiertos
  9. 9. completamente por micelio, el cual inicialmente es de color blanco pero setorna verde cuando el hongo esporula (Castillo, 2006).M. anisopliae, se ha utilizado exitosamente como agente de biocontrol. Se hadesarrollado la tecnología de producción masiva de M. anisopliae y existen enel mercado productos formulados con conidios de este hongo. Sin embargo, sedesconoce el efecto de la luz en el desarrollo de M. anisopliae. El objetivo deeste trabajo es estudiar el efecto de la luz durante el desarrollo y lareproducción asexual de M. anisopliae.1.2. Planteamiento del problemaEn la actualidad existen estudios del efecto de diferentes factores ocondiciones de incubación para el hongo entomopatógeno M. anisopliae, tanto:pH, temperatura, humedad relativa tipos de medio etc. pero no hay registros dela aplicación de diferentes fuentes de luz, con esto se busca la manera deaumentar la producción de conidios, mediante la estimulación del periodo decompetencia del hongo.1.3. JustificaciónLos conidios de Metarhizium anisopliae se utilizan en la formulación debioinsecticidas comerciales que se han aplicado exitosamente tanto eninvernadero como en campo, para combatir una gran variedad de plagasagrícolas. Sin embargo, no existen reportes sobre el efecto de la luz en lareproducción asexual de Metarhizium anisopliae, por lo que es necesariorealizar un esfuerzo de investigación básica para entender los mecanismosfisiológicos que rigen este el proceso de reproducción asexual para mejorar laproducción de conidios en los sistemas de producción masiva. Este trabajoforma parte de un proyecto de ingeniería y diseño para la construcción de unbioreactor industrial de fermentación sólida.
  10. 10. 1.4. Objetivos.1.4.1. Objetivo general.Estudiar el efecto de la luz en la reproducción asexual de Metarhiziumanisopliae1.4.2. Objetivos Específicos.1. Determinar el efecto de la luz en el crecimiento de Metarhizium anisopliae.2. Caracterizar el efecto de la luz en la reproducción asexual de Metarhiziumanisopliae.3. Observar la respuesta a los diferentes tipos de luz durante la reproducciónasexual de Metarhizium anisopliae.4. Identificar el periodo de fotocompetencia de Metarhizium anisopliae.1.5. HipótesisLa luz afecta la conidiación del hongo entomopatógeno Metarhizium anisopliae.
  11. 11. II MARCO TEORICO2.1. HONGOS ENTOMOPATÓGENOS.2.1.1 GeneralidadesLos primeros microorganismos que se encontraron causando enfermedad eninsectos, fueron los hongos por su crecimiento macroscópico sobre lasuperficie de sus hospederos. Algunos hongos entomopatógenos, sin embargo,no producen crecimiento superficial o producen muy poco. La mayoría sonpatógenos obligados o facultativos y algunos son simbióticos. Su crecimiento ydesarrollo están limitados principalmente por las condiciones ambientalesexternas en particular, alta humedad y temperatura adecuada para laesporulación y germinación de esporas. Las enfermedades causadas por estoshongos son denominadas “micosis” (Tanada y Kaya 1993).2.1.2. Clasificación taxonómica.Según la clasificación taxonómica hecha por Ainsworth (1973), la cual separalos hongos en dos divisiones: Myxomycota por formar plasmodios y Eumycotapor no formarlos y ser frecuentemente miceliales. Los hongosentomopatógenos se encuentran en la división Eumycota y en lassubdivisiones: Mastigomycotina, Zygomycotina, Ascomycotina,Basidiomycotina y Deuteromycotina (Tanada y Kaya 1993).Los hongos entomopatógenos infectan individuos en todos los órdenes deinsectos; la mayoría comúnmente son Hemíptera, Díptera, Coleóptera,Lepidóptera, Hymenóptera y Ortóptera. (Tanada y Kaya 1993; Ferron et al.1975). La especificidad del hospedero varía considerablemente, algunoshongos infectan un amplio rango de hospederos y otros están restringidos aunos pocos o a una sola especie de insectos.
  12. 12. Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae infectan cerca de 100 especiesdiferentes de insectos en varios órdenes, pero aislamientos de estos doshongos tienen un alto grado de especificidad (Guerrero, 1999)2.1.2.1. Subdivisión Deuteromycotina.Los Deuteromycotina u hongos imperfectos se llaman así porque la mayoría delos hongos carecen de fase sexual, o bien ésta no se conoce. Al tenerreproducción asexual, son formadores de conidias (Tanada y Kaya 1993).En una clasificación jerárquica, estos hongos no son iguales a losAscomycotina y Basidiomycotina pero ambos son complementariostaxonómicamente (Ainsworth 1973). Los Deuteromycotina entomopatógenosson encontrados en dos clases, Hyphomycetes y Coleomycetes. Muchos sonpatógenos altamente virulentos y han sido aplicados en el control de insectosplaga (Samson et al. 1988).La descripción hecha por Valiela (1979) sugiere que en esta clase las conidiasno se forman ni en acérvulos ni en picnidios, sino que se originan enconidióforos libres o directamente en las hifas somáticas.2.1.3. Mecanismo de acción.El desarrollo de micosis puede estar dividido en tres fases: (1) adhesión ygerminación de la espora en la cutícula del insecto, (2) penetración en elhemocele y (3) desarrollo del hongo. Lo cual generalmente resulta en la muertedel insecto (Alean, 2003).
  13. 13. 2.1.3.1. Adhesión de la espora a la cutícula del hospederoEl primer contacto que hace la espora con la superficie del hospedero es por lacutícula. Las características físicas y químicas de las superficies de la cutículadel insecto y la espora son las responsables de esta unión. En algunos hongosla adhesión es un fenómeno no específico. Algunas glicoproteínas puedenservir como un receptor específico para las esporas (Tanada y Kaya 1993).2.1.3.2. Germinación de la esporaSe entiende por germinación al proceso mediante el cual una espora emite unoo varios pequeños tubos germinales, los cuales por crecimiento y alargamientodan origen a las hifas (Volcy y Pardo 1994). La germinación de las esporas engran parte depende de la humedad ambiental y temperatura, y en menor gradode las condiciones nutricionales y de luz (Tanada y Kaya 1993).El nivel de humedad es determinante en el crecimiento de los hongos ypequeñas diferencias en los niveles de humedad relativa después de laaplicación de conidias, pueden determinar de un modo u otro el éxito del hongoen el control de insectos plaga (Guillespie, 1988).El resultado de la germinación y la penetración no depende necesariamente delporcentaje total de germinación sino del tiempo de duración de la germinación,modo de germinación, agresividad del hongo, el tipo de espora y lasusceptibilidad del hospedero (Samson et al. 1988).2.1.3.3. Penetración del integumentoLa penetración de la cutícula del insecto por conidias germinadas, ocurre comoresultado de una combinación entre la degradación enzimática de la cutícula yla presión mecánica por el tubo germinal (Gillespie 1988). El modo depenetración principalmente depende de las propiedades de la cutícula, grosor,
  14. 14. esclerotización y la presencia de sustancias antifúngicas y nutricionales(Charnley 1984). La fuerza mecánica es notable en el extremo de una hifainvasiva donde la capa cuticular es deformada por presión (Tanada y Kaya1993). Se produce un tubo germinativo y un apresorio, con éste se fija en lacutícula y con el tubo germinativo o haustorio (hifa de penetración) se da lapenetración al interior del cuerpo del insecto. En la penetración participa unmecanismo físico y uno químico, el primero consiste en la presión ejercida porla estructura de penetración, la cual rompe las áreas esclerosadas ymembranosas de la cutícula. El mecanismo químico consiste en la acciónenzimática, principalmente proteasas, lipasas y quitinasas, las cuáles causandegradación del tejido en la zona de penetración, lo que facilita la penetraciónfísica (Monzón 2001).Las enzimas identificadas en el tubo germinativo son proteasas,aminopeptidasas, lipasas, esterasas, y N-acetil-glucosamidasa (quitinasas).Estudios in vitro indican que en la digestión del integumento sigue unasecuencia de lipasa-proteasa-quitinasa (Tanada y Kaya 1993).Gillespie, (1988) reportó que los hongos B. bassiana, M. anisopliae,Paecilomyces spp. y V. lecanii, producen grandes cantidades de proteasas yquitinasas en medios de cultivo líquido. La producción de proteasa, lipasa yquitinasa sobre la cutícula del insecto, se ha demostrado con M. anisopliaemediante coloración de enzimas específicas, recuperadas de moscaspreviamente inoculadas con conidias del hongo. En varios aislamientos deB. bassiana y M. anisopliae la enzima principal es una endoproteasa quedisuelve la proteína matriz que cubre la quitina cuticular. Por lo tanto, laproducción de quitinasa ocurre después del proceso de infección y una vez queel hongo atraviesa la cutícula debe vencer el sistema inmunológico delhospedero antes de entrar a la hemolinfa y desarrollarse dentro del insecto.
  15. 15. 2.1.3.4. Penetración a través de cuerpos abiertos.Los hongos pueden infectar insectos a través de la cavidad bucal, espiráculos yotras aberturas externas de un insecto. Puesto que la humedad no es unproblema en el tracto alimenticio, la espora puede germinar rápido en esteambiente; por otra parte, los fluidos digestivos pueden destruir la espora o lahifa germinativa. En algunos casos, la digestión de estructuras fúngicas puedecausar la muerte por toxicidad más que por micosis (Charnley, 1984).Los hongos pueden infectar insectos a través de los espiráculos y otroscuerpos abiertos, Metarhizium anisopliae ocasionalmente infecta larvas através de los espiráculos y poros de órganos de los sentidos.Beauveria bassiana infecta varias especies de mosquitos a través del sifónposterior; en Heliothis zea a través del espiráculo y en el gorgojo de la alfalfaHypera postica a través de la tráquea y no por la delgada cutícula delintegumento. La región anal de las larvas del gusano de seda es másfrecuentemente infectada por el hongo Aspergillus flavus oryzae (Tanada yKaya 1993).2.1.3.5. Reproducción en el hemocele.Después de llegar al hemocele, la mayoría de los hongos convierten elcrecimiento micelial en una fase de levadura o sea crecimiento por gemación.Se producen toxinas y enzimas, aunque algunos hongos aparentemente noposeen toxinas, matan el insecto al consumir todos los nutrientes o por físicadestrucción (Bustillo, 2001).Los hongos pueden evitar la defensa inmune de un insecto por (1) desarrollode protoplastos que no son reconocidos por la población de hemocitos delinsecto, (2) formando cuerpos hifales multiplicándose y dispersándoserápidamente y (3) produciendo micotoxinas, producto de la pérdida de la
  16. 16. integridad estructural de las membranas seguido de la deshidratación de lascélulas por pérdida de fluido (Alean, 2003).Posterior al crecimiento del hongo en el hemocele, la micosis induce asíntomas fisiológicos anormales en el insecto tales como convulsiones,carencia de coordinación y comportamientos alterados. Ocurre unacompetencia entre el hongo y la flora intestinal. En la mayoría de los casos loshongos producen sustancias antibacteriales y cambio de color del cadáver.Después de muerto el insecto, si la disponibilidad de agua es alta los hongosemergen al exterior a través de la cutícula y esporulan sobre el cadáverproduciendo inóculo para infectar a otros insectos. Si las condiciones no sonfavorables, queda dentro del cadáver del insecto, donde puede sobrevivir poralgunos meses y eventualmente producirá esporas cuando lleguen lascondiciones favorables. La esporulación ocurre generalmente en cadáverespero puede también ocurrir en insectos vivos (Alean, 2003).2.1.3.6. Dispersión de las esporasLa dispersión de la espora puede ser un proceso activo o pasivo y depende delas características de la espora y el esporangio. Cada conidia puede adherirseo pasar de un invertebrado a otro por dispersión (Alean, 2003).2.2. Producción de hongos entomopatógenos.La producción de hongos entomopatógenos se basa en la multiplicaciónmasiva del hongo y sus estructuras reproductivas en un sustrato (Monzón2001).
  17. 17. 2.2.1. Medios de Cultivo.Todos los medios de cultivo utilizados en micología deben contener losnutrientes suficientes para asegurar el desarrollo de los hongos (carbono,nitrógeno, vitaminas, oligoelementos, etc.). El pH ha de ser ligeramente ácidopara facilitar el crecimiento de los hongos e inhibir al mismo tiempo eldesarrollo de otros microorganismos. Además se deben añadir antibióticosantibacterianos para inhibir el crecimiento de las bacterias saprófitas quesuelen contaminar las muestras. Los más usados son el Cloranfenicol y laGentamicina.Existen tres tipos de medios de cultivo para los hongos de acuerdo a suprocedencia y origen de sus componentes: 1). Medios naturales, secaracterizan por estar preparados por compuestos de origen natural y sucomposición no es exacta, como pedazos o infusiones de frutas, vegetales,granos de cereales o tejidos animales. Estos medios varían mucho en sucomposición, no son fácilmente reproducibles, ni de amplio uso. 2). Mediossemisintéticos, están conformados por compuestos de origen natural y químico,estos medios de cultivo están preparados con peptonas, extractos de plantas,agar y otros compuestos de procedencia desconocida o variable. 3). Mediossintéticos, presentan composición química definida cuantitativa y conocida. Lamayoría de las fórmulas de los medios de cultivo utilizados para hongoscontienen peptona, algún carbohidrato y agar (Pelczar y cols. 1997)2.2.2. Formulaciones de Hongos Entomopatógenos.La formulación del hongo (ver tabla 1) es el proceso mediante el cual elingrediente activo, es decir las conidias del hongo, se mezclan con materialesinertes, tales como vehículos, solventes, emulsificantes y otros aditivos. Estosmateriales inertes ayudan a que el hongo este más protegido al momento de laaplicación, así mismo, la facilita evitando que se sedimente fácilmente y/o queforme grumos que tapen la boquillas. Todo esto se hace con el fin de lograr una
  18. 18. buena homogeneidad y distribución de las partículas del hongo, para poder sermanipuladas y aplicadas adecuadamente (Monzón 2001).Tabla 1. Bioinsecticidas basados en el hongo entomopatógeno Metarhiziumanisopliae. PRODUCTO EMPRESA PAIS PLAGABio-Blast Ecoscience USA TermitesBiologicalTermiticideBio-Path Ecoscience USA CucarachasCockroachControlBioCane Bio-Care Australia Dermolepida albohirtumGranules Technology PtyBioGreen Bio-Care Australia Aphodius tasmaniaeGranules Technology PtyBiotrol FMA Nutrilite Products USA Mahanarva posticataBio 1020 Bayer Alemania Otiorhynchus sulcatusMetarhizium Eric Schweizer Suiza Gusanos blancosSchweizer SeedMetasav-11 Biasav CubaMetasav-11 Biasav Cuba Lissorhoptrus brevirostris /picudo acuático en arroz Cosmopolites sordidus /picudo negro en plátanos Mocis spp. /falso medidor en pastos Monecphora bicincta fraterna /salivita en pastosMeta-sin Agrobionsa México Diatraea saccharalis, Antonomus grandis Mosca pinta, picudo del chileMetarril M – 102 Italforte Brasil Mahanarva fimbriolata, Deois, Zulia /pasturas. BioProductos M. fimbriolata y posticata /caña de azúcarMetaquino Codecap, IAA Brasil Mahanarva posticata /caña de azúcarCombio Equi.Con.Biol. Brasil Mahanarva posticata /caña de azúcarBioCerto BioCerto Ind. e Brasil Mahanarva fimbriolata, Deois, Zulia /pasturas. Com. de Prod. M. fimbriolata y posticata /caña de azúcar Agrop.Metabio Plan Terra Brasil Mahanarva fimbriolata, Deois, Zulia /pasturasMET-92 (varias Agrícola El Sol Guatemala Pulgones, moscas blancas, cucarachas, Anthonomuscepas) spp., H. hampei, L. decemlineta,, Diabrotica, Phyllophaga, Anomala, Agriotes, Conedorus, Schistocerca, Cosmopolites sordidus...Zero QK Agrícola El Sol Guatemala CucarachasAgo Biocontrol Ago Biocontrol Colombia Coleópteros, lepidópteros /invernáculo, ornamentalesMetarhizium 50Destruxin WP Laverlam S.A. Colombia Hypothenemus hampei /café, Phyllophaga sp. y Ancognatha sp./papa y flores, Spodoptera frugiperda y Tagosodes aryzicola /arroz, Aeneolamia sp. y Perkinsiella saccharicida /caña de azúcar, Collaria columbiensis /pastosCobijan Probioagro Venezuela M. fimbriolata y posticata /caña de azúcarHay dos tipos de formulaciones: 1). Seca o polvo humectable en la cual seutiliza un vehículo, el cual puede ser de origen mineral o vegetal, que ayuda a
  19. 19. absorber la humedad de las conidias y mantiene la viabilidad por un tiempoconsiderable. 2). Líquida o emulsificable que utiliza un líquido solvente y unemulsificante. El líquido utilizado tiene la función de mantener suspendidas lasconidias en el medio para lograr una mezcla homogénea que garantice unabuena aplicación. Además, este líquido debe evitar la absorción de agua porlas conidias y mantener su viabilidad (Monzón 2001).La comercialización de insecticidas basados en hongos entomopatógenosrequiere un control de las propiedades biológicas, físicas y químicas. Para estose realizan pruebas microbiológicas como concentración de esporas,germinación de esporas y prueba de pureza. Además de las pruebasfísico-químicas de determinación de pH, porcentaje de humedad,humectabilidad, suspensibilidad y taponamiento de boquillas, que aseguren alusuario un producto con la máxima eficacia de control en el campo (Vélez ycols. 1997).2.2.3. Reactivación de los Hongos Entomopatógenos.Procedimiento para mantener la virulencia constante, mediante inoculación delhongo a un insecto hospedero vivo y su posterior reaislamiento una vez muertoel mismo. La frecuencia de estos pases por insectos está dada por las vecesque la cepa puede ser multiplicada sin perder su virulencia recomendándosegeneralmente hacerla cada 3 ó 4 pases por medio nutriente natural o sintético(Ocpi, 1986).2.3. Factores que influyen en el establecimiento y acción de hongosEntomopatógenos.Los factores ambientales cumplen una función esencial en la iniciación ydesarrollo o en la prevención y supresión de las epizootias naturales afectando
  20. 20. las condiciones fisiológicas del hospedante, su densidad y distribución espacialy temporal. Forman un complejo de factores que interactúan entre sí y entreotros componentes del ambiente, siendo los más estudiados la temperatura yhumedad relativa. El mayor problema es que pocos estudios se refieren almicroclima del cultivo que es el que directamente influye sobre los patógenos.A diferencia de las condiciones constantes en el laboratorio, en elagroecosistema se presentan situaciones normalmente fluctuantes delconjunto de factores climáticos. Esto explica la complejidad del tema y lasmúltiples interacciones posibles como para poder cuantificar, con másprecisión, el efecto del microclima natural sobre los entomopatógenos.Los principales factores ambientales que afectan la eficiencia de los hongosentomopatógenos como agentes de control biológico son: humedad relativa,temperatura y brillo solar (Aelean, 2003).2.3.1.- Humedad Relativa (HR).La humedad relativa es un factor de gran importancia, tanto para el hospedantecomo para el patógeno. Es indispensable en las diferentes fases del ciclo delas relaciones entre ambos organismos. Tiene efecto sobre la germinación,penetración y para la reproducción de los hongos entomopatógenos. La faltade humedad relativa adecuada puede perjudicar una epizootia (Lecuona,1996). Se requiere de humedad relativa alta para la germinación del hongoentomopatógeno Metarhizium anisopliae. El estudio de Walstad y Cols.. 1970,indica que la mayor germinación ocurre al 100% de humedad relativa ydisminuye a 0 al 85% de HR. Niveles altos de HR son necesarios para laesporulación. A un nivel de HR del 100% la esporulación ocurre en cuatro días,pero a una HR de 92.5% son necesarios cinco o más días, mientras que laesporulación es inhibida con humedad relativa menor del 90% (Sosa-Gómez yAlves 1983).
  21. 21. 2.3.2. Temperatura (T).La temperatura puede afectar la estabilidad de los patógenos en elalmacenamiento, durante las aplicaciones en el campo y en su ocurrencianatural en el agroecosistema. Los entomopatógenos no poseen condicionesbiológicas para defenderse de las grandes variaciones de temperatura y puedeser limitante para varios microorganismos. El rango favorable de temperaturapara los diferentes grupos de entomopatógenos varía entre 20 y 30 °C, sinembargo, existe una temperatura ideal para cada patógeno y para cada fasedel ciclo de la relación con su hospedante. La temperatura es uno de losfactores abióticos más importantes para los hongos entomopatógenos, debidoa que puede afectar la germinación de las esporas, el desarrollo y penetracióndel tubo germinativo y la colonización y reproducción. Los requerimientostérmicos de los hongos entomopatógenos son variables en función de laespecie, cepa y fase de desarrollo. El desarrollo de las enfermedades fúngicasen los insectos puede ser perjudicado por temperaturas superiores a 30 °C.Las esporas de hongos entomopatógenos germinan a temperaturas entre 15 y35 °C, siendo el rango óptimo entre 25 y 30°C, y se requieren cuatro días parala esporulación de Metarhizium anisopliae. La esporulación es inhibida atemperaturas inferiores de 10 °C y superiores a 35 °C (Castillo, 2006).2.3.3. Radiación solar (RS).Para evaluar el efecto de la radiación solar sobre los patógenos y sobre laocurrencia de las enfermedades es necesario considerar los siguientesaspectos: espectro de luz visible con sus diferentes longitudes de onda (luzverde, amarilla, azul, etc.), fotoperiodo y faja de luz ultravioleta germicida. Laexposición a la luz ultravioleta puede ser letal para los conidios de lospatógenos se observó que el crecimiento y esporulación de los hongos esretrasado por la radiación solar y que la nubosidad tiene un papel importante enel desarrollo de las epizootias causadas por hongos entomopatógenos(Castillo, 2006).
  22. 22. 2.3.4 Suelo.El suelo puede abrigar tanto a los insectos como a los entomopatógenos y esun ambiente complejo donde los microorganismos sufren la acción de losfactores bióticos y abióticos, que dan como resultado una mayor o menorpermanencia de acuerdo a las condiciones de campo. Los hongosentomopatógenos pueden vivir en el suelo por periodos variables. M. anisopliaedespués de parasitar insectos puede permanecer colonizando el cadáver porun periodo relativamente largo a la espera de un nuevo hospedante. La mayorparte de sus conidios difícilmente conseguirán sobrevivir por más de tresmeses en los diferentes tipos de suelo (Castillo, 2006).2.3.5. Los agroquímicos y su efecto sobre los entomopatógenos.La susceptibilidad de los entomopatógenos a los agroquímicos puede variar deacuerdo con el grupo y cepa del patógeno, con la naturaleza química delproducto y con la dosis empleada. Existen sustancias que son letales para losmicroorganismos, otras poseen efecto fungistático o bacteriostático yfinalmente, productos que en dosis normales y/o subletales pueden favorecersu crecimiento, reproducción y virulencia. Esto demuestra la importancia deconocer la acción de los agroquímicos sobre las diferentes fases del desarrollode los entomopatógenos (Castillo, 2006).2.4. Metarhizium anisopliae.El conidióforo es ramificado, el conidio inicial es producido por el conidióforo enuna abstricción simple en la parte distal. En cada conidióforo se forma unacadena de conidios basipetal, las cuales crecen densas y adheridas unas conotras formando masas prismáticas en columnas (Tanada y Kaya, 1993). Losconidios de este género son blancos cuando son jóvenes, pero conformemaduran el color se torna verde oscuro. Se mencionan solamente a dos
  23. 23. especies, M. anisopliae (Metschnikoff) Sorokin y M. flavoviride Gams &Rozsypal. (Sosa-Gómez y Aalves, 1983)Las características de M. flavoviride son que sus conidios son ovoides con lasterminaciones redondeadas o una de ellas ligeramente truncada, colonias decolor gris, amarillo verde de 7-11μm de longitud; Para el caso de M. anisopliaesus conidios son de forma cilíndrica u ovales frecuentemente angosto en laparte media, usualmente truncado en ambos lados, colonias verdes,M. anisopliae tiene dos variedades: M. anisopliae var. anisopliae con conidiosde 3.5 - 9.0 mm de largo usualmente 5.0 -8.0 mm y M. anisopliae var. mayorcuyos conidios miden de 9.0 - 18.0 mm de largo usualmente entre 10 - 14 mm(Humber 1997).2.5. ESTUDIOS DE LUZ EN HONGOS.La luz es la fuente de energía fundamental para la vida en la tierra, es unaseñal ambiental importante para los organismos de todos los reinos de la vida.En el reino fungi, la luz puede regular el crecimiento, la dirección delcrecimiento, la reproducción sexual y asexual y la formación de pigmentos, queson aspectos importantes para la supervivencia y la distribución de la especie.Estos procesos tienen implicaciones negativas a muchos aspectos de la vidahumana, pues la proliferación incontrolada de hongos puede conducir aenfermedades devastadora en plantas, a la tierra y a los humanos.Por otra parte, los hongos son esenciales para la degradación de la materiaorgánica, en interacciones micorrizicas con las plantas y como fuente desustrato para los metabolitos farmacéuticos de los seres humanos. Entender elpapel de señales ambientales en el desarrollo de los hongos es vital paraaumentar las ventajas y disminuir los costos. A pesar de la importancia de laluz en el desarrollo de los hongos, todavía hay mucho que estudiar sobre elefecto, el mecanismo de percepción y respuesta a la misma (Idnurm, 2005).
  24. 24. 2.5.1. Trichoderma viride.La luz influye en varios procesos del desarrollo de los hongos de diferentesmaneras, esto puede afectar el metabolismo de crecimiento, conidiacionformación de pigmentos, tropismo etc. (Betina, 1995)2.5.1.1 Aspectos fisiológicos de fotoconidiación.Se han estudiado tres factores en la fotoconidiación en hongos: 1) Laslongitudes de honda en donde no todos los hongos responden a los mismosrangos de espectro de luz; T. viride responde a la luz UV y a la azul, mientrasque la conidiación de Paecilomyces fumosoroseus responde únicamente alespectro de luz azul (Sánchez Murillo y Cols. 2004). Se a reportado que la luzazul induce la conidiación de Ascochya pisi (Leach y Trione 1965) mientras queen A. nidulans la conidiación es inducida por luz roja (Mooney y Yager 1990);2). La intensidad de la luz por ejemplo estudios en P. fumosoroseus muestranuna fluencia de 540 µmoles m-2 en la cual se observo un incremento en laconidiación produciéndose 2x108 conidios por colonia(Sanchez Murillo y Cols, 2004); y 3). Pulsos de luz, en donde se le aplicanpulsos de luz por determinados periodos de tiempo para la determinar en queetapa del desarrollo del hongo y la dosis de luz que requiere para su desarrolloóptimo.En Trichoderma, los primeros cambios morfológicos del crecimiento deconidióforos pueden ser observados microscópicamente 4 h después de lafotoinducción. La espora gradualmente cambia su color de blanco a amarillo ycafé, después de 24 h se pone verde oscuro.
  25. 25. 2.5.1.2. Fotorreceptores.La luz produce cambios fotobiológicos o fotoquímicos al ser absorbida por unao varias moléculas. T. viride responde a la luz UV y a la azul por lo que sesugiere que deben existir receptores que absorben luz de estas longitudes deonda.La identidad química de los fotorreceptores citocromos involucrados enfotorespuestas en hongos es deducida por acción de respuesta a espectros.Los receptores podrían ser pigmentos amarillos, carotenoides y flavinas oprobablemente la unión de varias proteínas. Sin embargo, en estudios enNeurospora crassa con resultados concluyentes el fotorreceptor sugerido es elfotorreceptor de luz azul WC-1 para el ciclo circadiano y otras respuestas a luz.(Qiyang y Cols. 2002)2.5.2. Neurospora crassa.Neurospora crassa, es un hongo pleomórfico que produce tres tipos de esporasvegetativas: blastoconidios multinucleasa, artroconidia (usualmente llamadamacroconidios) y microconidios uninucledos.N. crassa se ha utilizado como organismo modelo por que es fácil de cultivar ytiene un ciclo vital haploide que hace el análisis genético simple puesto que losrasgos recesivos se manifiestan en el descendiente.Este hongo eucariótico responde a la luz azul, estudios bioquímicos yfotobiológicos lo afirman. Sin embargo, los genes fotorreceptores que codificanla luz roja han sido descubiertos recientemente en su genoma (Kritsky, 2005).pero la detección de estos genes no afecta la respuesta de cualquierfotoreacción conocida, dejando su función incierta. (HeQ, y cols 2002).
  26. 26. Dos proteínas son requeridas para la percepción de la luz azul en Neurosporacrassa, White collar (WC)-1 y WC-2. WC-1 es el fotorreceptor (He y Cols.2002), con un sensor dominante llamado LOV (Luz, Oxigeno, y Voltaje),homólogos a eso las plantas fototrópicas. WC-1 es asociado con WC-2 en vivo,formando un heterodiometro nuclear, el complejo White Collar (WCC);(Schwerdtfger y Linden 2000). El complejo WCC está asociado con variospuntos del ciclo circadiano, como la frecuencia de oscilación (FRQ) (Froehlich,2002) y la proteína quinasa C. En la irradiación de luz azul, la conformaciónWCC pasa a través de cambios para activar los genes dependientes de luz.Inicialmente WC-1 incrementa su fosforilación y después de 1 h la proteínahiperfosforilizada comienza apagarse. Como parte del feedback loop, el genwc-1 solo es sujeto a trascripción por el WCC (Froehlich, 2002)2.5.3. Phycomyces.Phycomyces blankesleeanus es un hongo zigomiceto filamentoso que producecélulas individuales alargadas de hasta 10 cm de altura las cuales cadaextremidad tiene una esfera que contiene las esporas de dispersión. Esteorganismo se ha usado como modelo para detectar señales ambientales como:la diversidad de la luz, químicos, tacto, viento, gravedad y objetos cercanos. Enparticular, el crecimiento de esporangios es regulado por la luz y esto muestrafototropismo por inclinación hacia la fuente luminosa (las longitudes de onda dela luz UV y azul) (Idnurm y cols, 2006).Los mutantes madA de phycomyces exhiben sensibilidad reducida a la luz, yase identificaron dos homólogos (duplicados) en la familia White collar 1 defotorreceptores azul en Phycomyces. Las mutantes madA contienen puntos demutación en uno de estos genes entonces estas mutaciones se relacionan conel fototropismo defectuoso antes de las cruzas genéticas. Las respuestasfototrópicas en hongos son a través de madA y en las plantas a través dediferentes proteínas fototrópicas las cuales comparten enlaces entre flavinaspara la detección de fotones de luz (Idnurm y cols, 2006).
  27. 27. III MATERIALES Y METODOS3.1. Ubicación.El estudio se realizó en el Laboratorio de Investigación y Desarrollo de laempresa SinQuímica, S.A. de C.V., ubicada en los Mochis Sinaloa.3.2. Microorganismo.Se utilizó la cepa QM01 de Metarhizium anisopliae, aislada en el Laboratorio deInvestigación y Desarrollo de SinQuímica, S.A. de C.V.3.3. Conservación de la sepa.La cepa se conservó en refrigeración como una suspensión a unaconcentración de 5 x106 conidios / mL, en Tween al 0.05%.3.4. Medio de Cultivo.Se utilizó el medio SDYA (65 g/L de agar dextrosa sabouraud suplementadocon 10 g/L de extracto de levadura), de Bioxon.3.5. Condiciones de cultivo.En cada experimento, con el fin de obtener colonias aisladas, se sembró porextensión a M. anisopliae en cajas de Petri de 95 mm de diámetro conteniendode 15 a 20 mL de medio SDYA, se incubaron en una incubadora Binder a26±1 ºC por 48 h en completa obscuridad.
  28. 28. Para los diferentes tratamientos se incubó el hongo en un cuarto de cultivo auna temperatura de 26±2 ºC y a 65 ± 10% de humedad relativa, provisto conlámparas de luz blanca marca Philips de 40 W.Para la aplicación de pulsos de luz se diseñó una caja de madera provista con2 lámparas luz blanca marca Gs de 16 W.3.6. Determinación de crecimiento radial.El crecimiento de Metarhizium anisopliae se midió como velocidad decrecimiento radial, se inoculó una colonia aislada incubada previamente en elcentro de las cajas de Petri conteniendo de 15 a 20 mL de medio fresco SDYA.Se realizaron mediciones ortogonales del diámetro de la colonia a los 7 días decultivo. Con las medias de estas distancias se determinó la velocidad decrecimiento radial en mmh-1. Este experimento se hizo en 4 repeticiones.3.7. Microcultivos.Para determinar el efecto de la luz en el desarrollo morfogenético deMetarhizium anisopliae se utilizó la técnica de microcultivos. Se colocó un papelfiltro impregnado con 10 mL de glicerol al 10% en la superficie para mantener lahumedad relativa seguidos de dos porta objetos en cada caja de Petri de cristal(ver figura 1). Se colocó una película de 1 cm2 de medio SDYA y en cada ladose inoculó 10 µL de una suspensión de 1 x 106 de esporas por mL, las cajas secultivaron en un cuarto de cultivo a 26±2°C, algunas cajas fueron cubiertas conpapel aluminio para cultivar en completa oscuridad. El experimento se realizópor duplicado.
  29. 29. Figura 1. Microcultivos con M. anisopliae.3.8. Microscopía óptica.Se estudió la reproducción asexual de de Metarhizium anisopliae mediante laobservación de los microcultivos en las diferentes etapas de desarrollo, usandouna tinción azul algodón de lactófenol y un microscopio óptico de contraste defases (Nikon, modelo e400) a 40 x.3.9. Fotoinducción de la conidiación.Se diseñaron cajas de cartón de 30 cm de largo x 10 cm de ancho x 7 cm deprofundidad (Ver Figgura 2). En la parte superior se cortó una sección decartón de 7 cm de ancho x 27 cm de largo para colocar diferentes filtros:transparente, azul, verde o rojo. Para simular completa obscuridad, una caja seenvolvió completamente con papel aluminio. En el interior se colocaron lascajas de Petri conteniendo de 15 a 20 mL de SDYA fresco e inoculadas en elcentro con una colonia aislada previamente 48 h cultivadas en completaobscuridad. La transferencia de las colonias se realizó en un gabinete debioseguridad provisto de un filtro rojo de seguridad.
  30. 30. Figura 2. Cajas de cartón con diferentes filtros.Para la luz azul se utilizó un filtro azul (LEE 183, transmisión máxima de 450nm). Para obtener la luz verde se utilizó el filtro verde (LEE 124, transmisiónmáxima de 500 nm). Para la luz roja se obtuvo utilizando un filtro rojo (LEE 019,transmisión máxima de 680 nm). Se incubó en el cuarto de cultivo con luzconstante a una temperatura de 26±2 °C y todos los tratamientos se hicieronpor triplicado.3.10. Determinación del periodo de competencia.Colonias aisladas de M. anisopliae cultivadas durante 48 h a 26±1 °C encompleta obscuridad, se transfirieron a cajas de Petri conteniendo de 15 a 20mL de SDYA fresc. La transferencia de colonias se realizó en un gabinete debioseguridad provisto de un filtro rojo de seguridad.
  31. 31. Las cajas de Petri se cubrieron en paquetes de tres con hojas de papelaluminio para simular la obscuridad, como control positivo se cultivaron algunascajas con luz constante. Todas se incubaron en el cuarto de cultivo a 26±2 °Cdurante siete días. Se aplicaron pulsos cada 12 h para identificar el periodo decompetencia de M. anisopliae.Para este experimento se utilizó una lámpara con dimensiones de 60 cm delargo x 40 cm de altura y 40 cm de profundidad especialmente diseñada paralos pulsos de luz provista de 2 tubos de luz blanca marca Gs de 16 W a unadistancia de 35 cm de los cultivos a irradiar.3.11. Conteo directo de conidios.Al tiempo indicado, los conidios fueron cosechadas con 10 mL de una soluciónde tween al 0.05%, se hicieron diluciones decimales de acuerdo a la Normaoficial mexicana NOM-110-SSA1-1994, bienes y servicios. Preparación ydilución de muestras de alimentos para su análisis microbiológico. De cadacondición de cultivo se contaron los conidios en una cámara de Neubauer conun microscopio óptico de contraste de fases (Nikon, modelo e400) a 40 x.3.12. Determinación de la viabilidad.Para la determinación de la viabilidad se realizó de acuerdo a lo establecido enla NOM-111-SSA1-1994, bienes y servicios. Método para la cuenta de mohos ylevaduras en alimentos.
  32. 32. IV RESULTADOS Y DISCUSION4.1. Efecto de la luz en el desarrollo asexual de Metarhizium anisopliae.M. anisopliae es un hongo entomopatógeno de interés para el control dediversas plagas, se requiere conocer las condiciones de reproducción masiva,un punto de interés es el efecto de la luz en la producción de conidios. Se havisto que en otros hongos la esporulación puede ser promovida por laaplicación de luz, se diseñaron experimentos para comprobar si la luz afecta elcrecimiento y conidiación de Metarhizium anisopliae.El hongo se incubó bajo condiciones de luz continua en un cuarto de cultivo26±2 °C con dos tubos de luz blanca de 25 W a una distancia de 40 cm sobrela superficie del agar. Los testigos se mantuvieron en completa obscuridad. Seobservó las etapas de desarrollo asexual en microcultivo a las 24, 48 y 60h decultivo.Los microcultivos expuestos a la luz continua, mostraron una coloraciónamarillenta, mientras los mantenidos en completa obscuridad el micelio seobservó de color blanco (sin pigmentación).Se observó en el microscopio las etapas de desarrollo del conidióforo enM. anisopliae (ver figura 3). En presencia de luz se observó la formación de lafiálide (célula fértil) alas 24 h de cultivo (Fig. 3a); a las 48 h de cultivo (Fig. 3b),se observó la formación del conidióforo maduro y a las 60 h de cultivo seobservó una gran cantidad de conidióforos y conidios (Fig. 3c). Mientras que alas 60 h de cultivo en obscuridad se observó la producción escasa deconidióforos y conidios (Fig. 3f).
  33. 33. Con este ensayo se demuestra que la luz tiene un efecto significativo en eldesarrollo asexual de M. anisopliae. Estos resultados motivaron a continuar lainvestigación.Figura 3. Cambios morfológicos durante la conidiacion de M. anisopliae.a, b y c corresponden a 24, 48 y 60 h respectivamente, con luz constante,mientras que d, e y f, corresponden a 24, 48 y 60 h respectivamente encompleta obscuridad.Se ha estudiado ampliamente los factores que afectan la fotoconidiación deTrichoderma viride, siendo éste, usado como modelo fotomorfogénico por suhabilidad de producir conidios mediante la exposición a la luz. En condicionesde completa obscuridad y sin limitaciones de nutrientes crece indefinidamentecomo micelio. Si la limitación de nutrientes se hace presente junto con laaplicación de luz, se provoca el desarrollo asexual de estructurasespecializadas (conidios). La aplicación de un pulso breve de luz azul(400-480nm) a una colonia radial induce una esporulación sincronizada la cualproduce un anillo de conidioforos de color verde en el momento el cual lacolonia fue expuesta al pulso de luz (Casas Flores y cols, 2004).
  34. 34. Se ha reportado que Paeclomyces fumosoroseus la luz es determinante para laconidiación de este hongo, un pulso de luz azul fue suficiente para inducir larespuesta fotomorfogénica, medida como producción de conidios(Sánchez-Murillo y cols, 2004).En Phycomyces blakesleeanus el desarrollo de esporangiosporas escontrolado por la luz azul. La producción de microsporangiosporas es reprimidapor la luz e incrementa el desarrollo de macrosporas, para Metarhizium sureproducción no presento la formación de estas estructuras especializadas.(Maier, 2001).4.2. Efecto de los diferentes tipos de luz en la conidiación de Metarhiziumanisopliae.Para saber que tipo de luz tiene mayor efecto, se cultivó el hongo bajocondiciones de luz blanca, azul, verde y roja, con un testigo en completaobscuridad. El efecto de los diferentes tipos de luz sobre los cultivos se realizópor el fenotipo visible de las colonias y la producción de conidios a los 14 díasposteriores a la incubación.Los hongos pluricelulares o mohos forman una serie de filamentos o tubosrígidos denominados hifas, estas dan al moho un aspecto algodonoso y puedenser septados, es decir, presentar tabiques transversales que separan lascélulas. El conjunto de hifas forman un micelio. Existen dos tipos de micelio:vegetativo que crece en toda la superficie del sustrato al penetrar en el y fijar elhongo al sustrato y micelio aéreo o reproductor que produce esporas asexualesy asexuales (Piña, 2000). En el caso de las colonias obtenidas de M. anisopliaelas colonias fueron planas las cuales crecieron por la superficie del medio.Para el cultivo en obscuridad (ver figura 4) se obtuvieron colonias planas conuna coloración ligeramente verde del extremo de la colonia y se va
  35. 35. desvaneciendo a color blanco hasta el centro de la colonia con pequeñas gotasde color anaranjado esparcidas entre las estrías de la misma, bajo estascondiciones se obtuvieron 1.09 x107 UFC/caja. El crecimiento radial de lascolonias cultivadas en obscuridad fue de 0.025 mm h-1, que fue 9.6% mayor alde las colonias cultivadas en completa obscuridad (σ ≤ 0.03).Con luz blanca las colonias se caracterizaron por tener una coloración verdeintenso y uniforme con una producción 1x108 UFC/caja. Con luz azul lacoloración verde es de menor intensidad que el tratamiento con luz blanca, seobservó la formación de pequeñas gotas anaranjadas distribuidas entre lacolonia, con este tratamiento se obtuvo una producción de 1.47x107 UFC/caja.Para el tratamiento con luz verde se obtuvieron colonias planas, con unacoloración verde y morfología colonial similar al cultivo en obscuridad, conpequeñas gotas en la superficie y una producción de 1.15x107 UFC/caja.Finalmente, cuando se utilizó la luz roja, se observó una coloración verdosa enel extremo de la colonia, similar al tratamiento con el filtro azul y unaproducción de 2.23 x107 UFC/caja. En Aspergillus oryzae la luz roja causareducción en la conidiacion de este hongo (Hatakeyama y Cols. 2007).Al cosechar los conidios en tubos de ensaye (Figura 5) se observa una grandiferencia en la coloración de la suspensión para cada tratamiento siendo elmas destacado el tratamiento con luz blanca teniendo una intensa coloraciónverde obscuro. OBSCURIDAD LUZ BLANCA LUZ AZUL LUZ VERDE LUZ ROJA 7 8 7 7 7 1.09 X10 1 X10 1.47 X10 1.15 X10 2.23 X10
  36. 36. Figura 4. Morfología colonial y producción de conidios en M. anisopliaecultivado en diferentes condiciones de luz. a) luz azul. b) luz blanca. c) luz azul.d) luz verde. e) luz roja.Figura 5. Tubos de ensaye conteniendo esporas de M. anisopliae,a) completa obscuridad, b) luz blanca, c) luz azul, d) luz verde y e) luz roja.Figura 6. Viabilidad para los tratamientos con luz color blanca, obscuridad, luzverde, luz roja y luz azul.De acuerdo a los resultados obtenidos, la luz tiene un efecto significativo en lareproducción asexual de Metarhizium anisopliae, con luz blanca se produce unorden de magnitud mayor de conidios respecto al cultivo en obscuridad. En eltratamiento con luz verde se obtuvo una producción de conidios similar al deobscuridad. Mientras que el tratamiento con luz roja muestra 2 veces más
  37. 37. conidios, así mismo el tratamiento con luz azul mostró un incremento del 50 %más que el cultivo en obscuridad. En otro estudio realizado con Paecilomycesfumosoroseus la producción máxima de conidios se obtuvo con la luz blancaseguida por la luz azul, y la producción de conidios con luz verde y roja se daen varios ordenes de magnitud menores (Sánchez-Murillo y cols, 2004).En Trichoderma viride cuando es cultivado en completa obscuridad se obtienemicelio plano y alino (sin color), en agar dextrosa de papa, pero crececontinuamente con esporulación bajo luz blanca (kumagai y Oda, 1969).Phycomyces al estimulo externo responde de diferentes maneras, la mayorparte de los hongos responde a la luz de una u otra manera, la luz azulestimula el desarrollo de macrosporas en el micelio y la acumulación deB-caroteno inhibe el desarrollo de microsporas la respuesta mas visible se dacon la luz azul (Cerda-Olmedo, 2001).4.3. Periodo de competencia de respuesta a la luz del hongoentomopatógeno Metarhizium anisopliae.Para la determinación del periodo de competencia se realizaron ensayos parasaber el periodo en el cual Metarhizium anisopliae es competente para formarconidioforos y conidios. En el experimento los pulsos de luz se aplicaron dentrode una caja para pulsos antes descrita. Los testigos permanecieron enoscuridad absoluta.Después de 24 h de cultivo del hongo, las cajas de Petri fueron irradiadas cada12 h con un pulso de luz de 1 h, después del tratamiento las cajas se cubrieronnuevamente con papel aluminio. Después de la aplicación de los pulsos seincubaron hasta completar 10 días de cultivo, luego se cosecharon las esporasy se realizó la viabilidad de las mismas (ver tabla 2).
  38. 38. Tabla 2. Resultados de conteo directo y viabilidad de conidios. No. conidios Tratamientos Promedio UFC/caja (Neubauder) 7 7 Luz constante 9,66 x 10 4,31 x10 6 6 Pulso a las 24 h 4,75 x10 2,44 x10 6 6 Pulso a las 36 h 4,99 x10 2,70 x10 6 6 Pulso a las 48 h 4,38 x10 2,26 x10 6 6 Pulso a las 60 h 2,39 x10 1,04 x10 6 6 Pulso a las 72 h 4,60 x10 2,41 x10 6 6 Obscuridad 3,63 x10 2,90 x10Para el testigo expuesto a completa obscuridad presentó un color amarillo claroy plano con la formación de micelio blanco con producción de 2.90 x106UFC/caja mientras que para las colonias con luz constante presento un fenotipoaplanado con una coloración verde alcanzando una producción de 4.31x107UFC/caja, la cual fue un orden de magnitud mayor comparado con los otrostratamientos.Se observa que M. anisopliae (ver figura 7) tiene muy poca respuesta conrespecto a los pulsos de luz a las de 36 h de cultivo alcanzando un incrementocon 2.70 x106 UFC/caja aun así, es mayor que los tratados a las 24, 48, 60, 72 h;Sin embargo, el testigo en obscuridad muestra una mayor formación deconidios con 6.8 % mas conidios con respecto al tratamiento a las 36 h.Para Trichoderma viride cuando una colonia crece en obscuridad y esiluminada brevemente con luz azul solo la región cercana al micelio produceesporas apareciendo la formación de un anillo (Kumagai y Oda, 1969). En elcaso Metarhizium anisopliae no hay formación de anillos cuando se expone a laluz. Cuando el micelio termina de desarrollarse va produciendo esporas, lospulsos de luz al parecer tienen muy poco efecto en la reproducción del hongo.En otro caso en Trichoderma se reportó que hay un periodo de competencia yque es necesario que el hongo crezca por lo menos 36 h para ser fotosensible
  39. 39. (Sánchez-Murillo y cols, 2004); Sin embargo, la aplicación de los pulsos de luzen este caso fue desde las 24 h el cual no se ve un efecto notorio paraconidiacion, talvez no es necesario la aplicación de pulsos de luz, simplementela iluminación continua es suficiente para su optima conidiacion. En caso delhongo filamentoso Aspergillus oryzae se encontró que el efecto de luz en laconidiacion es reprimida por la luz blanca. También la luz roja causa reducciónen la conidiacion (Hatakeyama y cols, 2007).Figura 7. Viabilidad para esporas de M. anisopliae.En otro ensayo se observa la diferencia que hay entre la luz constante ycompleta obscuridad haciendo viabilidad cada 24 h durante cinco días
  40. 40. Tabla 3. Viabilidad para las cajas en completa obscuridad y luz constantemedida como conidios por caja. Luz constante Obscuridad Tiempo No. conidios No. conidios UFC/caja UFC/caja (h) (Neubauder) (Neubauder) 72 2,23 x106 2,64 x106 3,10 x105 3,69 x105 96 5,65 x106 3,60 x106 6,13 x105 5,91 x105 120 9,33 x106 8,08 x106 5,30 x105 3,35 x105 144 1,52 x107 1,30 x107 5,75 x105 7,30 x105 168 3,70 x107 3,52 x107 2,31 x106 2,74 x106Figura 8. Viabilidad para esporas expuestas a luz y a obscuridadEn la gráfica 8. Se muestra como desde las 72 horas hay un incremento en laproducción de conidios lo cual indica que Metarhizium anisopliae escompetente a la producción de conidios desde antes de las 72 h y se muestra
  41. 41. que la luz constante es la mas apropiada para el desarrollo de conidios acomparación de su incubación en obscuridad. En un caso contrario el hongopatógeno humano Crytococcus neoformans la luz inhibe su reproducción(Idnurm y Heitman, 2005)En Paecilomyces fumosoroseus los conidios requieren un periodo decrecimiento para adquirir la fotocompetencia. La inducción de la conidiacionsolo se observa cuando el hongo es cultivado en la obscuridad durante elperiodo especifico de 72 a 108 h antes de ser expuestas a estimulo luminoso(Sánchez-Murillo y cols, 2004).
  42. 42. CONCLUCIONES► La luz afecta el desarrollo asexual de Metarhizium anisopliae, al cultivar elhongo en presencia de luz se obtuvo una gran cantidad de conidioforos yconidios, mientras que en completa obscuridad la producción de conidioforos yconidios fue escasa.► El mayor efecto de la luz se observo con la luz blanca.► Metarhizium anisopliae no presenta un periodo de competencia derespuesta a la luz, la mayor producción de conidios se obtuvo con luzconstante.
  43. 43. BIBLIOGRAFIAAinsworth, G. 1973. Introduction and keys to higer taxa. In: “The Fungi: AnAdvanced Treatise”. Ainsworth, G., Sparrow, F. y Sussman, A. AcademicPress, New York. (IVA): 1-7Alean, L. 2003. Evaluación de la patogenicidad de diferentes Hongosentomopatógenos para el control de la mosca blanca de la yuca Aeurotrachelussociales Bonder (Homoptera:Aleyrodidae) bajo condiciones de invernadero.Titulo de microbiólogo agrícola y veterinaria. Pontificia universidad javerianafacultad de ciencias básicas microbiología agrícola y veterinaria. Bogota,Colombia. P. 107.Betina, V. 1984. Photoinduced conidiation in Trichoderma viride. Int. J.Microbiol. 2(1): 55-68.Betina, V. 1995. Photoinduced conidiation in Trichoderma viride. FoliaMicrobiol. 40 (3), 219-224.Bergman K. 1972. Sensory responces of Phycomyces: Blue-light control ofsporangiophore initiation. Grado en doctor de Fisiologia. Instituto Tecnologicode California. Pasadena, California. 5-17Bustillo, A. 2001. Hongos en insectos y posibilidades de uso en el controlbiológico de plagas en Colombia. En: seminario Uso de entomopatógenos enColombia. Sociedad Colombiana de entomología. Bogotá. pg. 30-53.Charlotte, C. E. y Browman, B.J. 1990. Mutation that affect circadian rhythms inNeurospora crassa can alter the reduction of cytochromes by blue light. Journalof Biological Rhythms. 5(4): 291-301.Charnley, A. 1984. Physiological aspects of destructive pathogenesis in insectsby fungi: A speculative review. In: Invertebrate-microbial Interactions. Anderson,
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