Your SlideShare is downloading. ×
1
Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký
Chương 1: CƠ SỞ LÍ THUYẾT CHUNG VỀ TÁCH SẮC KÝ
1.1. Giới thiệu phương pháp
1.1.1 Đị...
2
Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký
Sắc kí khí (GC)
(pha động: Khí)
- Khí-lỏng
- Khí - pha liên kết
- Khí - rắn
- Lỏng ...
3
Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký
Sự ái lực khác nhau của các chất tan trên pha tĩnh làm chúng di chuyển với những vậ...
4
Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký
Hình 1.2: Quá trình tách sắc kí trên cột của hai chất A và B
1.2.2. Các phương pháp...
5
Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký
với tốc độ chậm hơn so với chất rửa giải. Tốc độ này được xác định bởi ái lực tương...
6
Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký
Hình 1.3: Các phương pháp rửa giải, tiền lưu, thế đẩy
1.2.3. Đặc tính sắc kí của ch...
7
Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký
Thể tích lưu có thể nhận được trực tiếp từ thời gian lưu tR trên sắc kí đồ bằng các...
8
Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký
Hình 1.4: Sắc kí đồ minh họa các thời gian lưu t (hoặc thể tích lưu) và độ rộng của...
9
Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký
Phương trình này đúng với cột phân bố lỏng, còn đối với cột hấp phụ, Vs phải thay b...
10
Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký
Hệ số chọn lọc của một cặp dải (pic) gần nhau là một hàm phụ thuộc vào loại pha tĩ...
11
Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký
Hình 1.5: Sơ đồ của một dải chất tan và sự đánh giá của dải sắc kí đồ cho hiệu lực...
12
Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký
 c là nồng độ (mol/cm3
),
 t là thời gian,
 x là khoảng cách di chuyển được dọc...
13
Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký
N = 2
2
16
W
tR
Hay N = 2
2/1
2
54.5
W
tR
Với:
 tR là thời gian lưu của pic,
 W ...
14
Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký
 A là hệ số mô tả ảnh hưởng đến H của sự khuếch tán xoáy;
 B là hệ số khuếch tán...
15
Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký
khoảng 0.15 µm. Trong sắc kí khí – lỏng khi sử dụng màng mỏng trên thành cột mao
q...
16
Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký
trong phương trình Van Deemter được xác định phần lớn bởi hệ số khuếch tán DM của
...
17
Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký
Sự doãng rộng của dải trong pha động là do một phần vào số đông các đường đi nhờ đ...
18
Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký
Hình 1.8: Sự phân giải pic.
Tiêm mẫu Thời gian
Độ phân giải
kém, độ chọn
lọc tồi
Đ...
19
Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký
Độ phân giải của một cột tách cho biết khả năng tách hai chất phân tích bởi cột. N...
20
Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký
Một chi tiết quan trọng trong phương trình trên là độ phân giải tỉ lệ thuận với N ...
21
Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký
Bài tập
Câu 1.1: Trình bày định nghĩa của các khái niệm sau: (2 điểm)
a) Sự rửa gi...
22
Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký
Câu 1.10: Các số liệu sau đây thu được từ phép tách 4 cấu tử trong cột mao quản dà...
23
Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký
Chương 2: SẮC KÍ KHÍ
2.1. Mở đầu
2.1.1 Khái niệm
Cơ sở để tách bằng sắc kí khí là ...
24
Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký
Hình 2.1: Sơ đồ khối của một máy sắc kí khí
Hình 2.2: Một sắc kí đồ tiêu biểu tách...
25
Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký
Áp suất của khí vào thiết bị nằm trong khoảng từ 10 đến 50 psi để có tốc độ dòng t...
26
Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký
Cách thông dụng nhất để đưa mẫu vào cột là sử dụng một bơm tiêm mẫu vi lượng
(micr...
27
Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký
Tiêm mẫu không chia dòng (splitless injection)
Thích hợp cho phân tích lượng vết n...
28
Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký
Cột thường được làm bằng thép không rỉ, nicken, thủy tinh với đường kính khoảng từ...
29
Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký
Chromosorb P được chế tạo từ gạch chịu lửa C-22 có màu hồng (nên có kí hiệu P-pink...
30
Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký
Tẩm pha tĩnh lên chất mang có nhiều cách, một trong số đó là dùng máy cất quay châ...
31
Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký
Hình 2.4: Cột mao quản được làm bằng polyamide và fused silica
Hình 2.5: Minh họa ...
32
Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký
Nhiệt độ làm việc nhỏ nhất nên gần nhiệt độ phòng, ở đây chất lỏng pha tĩnh phải t...
33
Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký
Nhóm rất phân cực: H2O, glycol, glyxerin, poliphenol, axit dicacboxylic.
Nhóm phân...
34
Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký
Polyethylene glycol
Các pha tĩnh không chứa silicon được sử dụng rộng rải nhất là ...
35
Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký
2.3.5. Chỉ số lưu Kovats
Việc báo cáo các số liệu như thời gian lưu tuyệt đối tR l...
36
Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký
t’R,x là thời gian lưu được hiệu chỉnh của cấu tử đang xét.
t’R,Z là thời gian lưu...
37
Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký
Lực Van Der Waals
Thông thường các loại lực tương tác trên đều xuất hiện đồng thời...
38
Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký
IDC200
= chỉ số lưu cột DC 200 (100m x 0.25 mm) , T = 100o
C
IPPG
= chỉ số lưu với...
39
Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký
Trong bảng này, 5 hằng số đầu tiên của McRenolds thường được xuất hiện và được biể...
40
Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký
Bảng các hằng số McRenolds và các pha tĩnh được sử dụng thông thường
Pha T(oC)
min...
41
Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký
2.4.1. Detector đo độ dẫn nhiệt (Thermal conductivity detector)
2.4.1.1. Giới thiệ...
42
Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký
Hình 2.6: Detector đo độ dẫn nhiệt - Cầu nối Wheatstone
Một dòng nhỏ khí mang để l...
43
Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký
2.4.2.2. Úng dụng:
Độ nhạy của detector FID cao hơn rất nhiều so với độ nhạy của d...
44
Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký
Máy khối phổ là một detector vạn năng cho phân tích định tính và định lượng các ch...
45
Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký
Các phân tử khí đi vào nguồn ion hóa bằng va chạm electron và bị bắn phá bởi các
e...
46
Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký
CH5
+
+ M → CH4 + MH+
2.4.4.3.Máy khối phổ tứ cực
Máy khối phổ nam châm hình quạt ...
In phan tich sac_ki_khi
In phan tich sac_ki_khi
In phan tich sac_ki_khi
In phan tich sac_ki_khi
In phan tich sac_ki_khi
In phan tich sac_ki_khi
In phan tich sac_ki_khi
In phan tich sac_ki_khi
In phan tich sac_ki_khi
In phan tich sac_ki_khi
In phan tich sac_ki_khi
In phan tich sac_ki_khi
In phan tich sac_ki_khi
In phan tich sac_ki_khi
In phan tich sac_ki_khi
In phan tich sac_ki_khi
In phan tich sac_ki_khi
In phan tich sac_ki_khi
In phan tich sac_ki_khi
In phan tich sac_ki_khi
In phan tich sac_ki_khi
In phan tich sac_ki_khi
In phan tich sac_ki_khi
In phan tich sac_ki_khi
In phan tich sac_ki_khi
In phan tich sac_ki_khi
In phan tich sac_ki_khi
In phan tich sac_ki_khi
In phan tich sac_ki_khi
In phan tich sac_ki_khi
In phan tich sac_ki_khi
In phan tich sac_ki_khi
In phan tich sac_ki_khi
In phan tich sac_ki_khi
In phan tich sac_ki_khi
In phan tich sac_ki_khi
In phan tich sac_ki_khi
In phan tich sac_ki_khi
In phan tich sac_ki_khi
In phan tich sac_ki_khi
In phan tich sac_ki_khi
In phan tich sac_ki_khi
In phan tich sac_ki_khi
In phan tich sac_ki_khi
In phan tich sac_ki_khi
In phan tich sac_ki_khi
In phan tich sac_ki_khi
In phan tich sac_ki_khi
In phan tich sac_ki_khi
In phan tich sac_ki_khi
In phan tich sac_ki_khi
Upcoming SlideShare
Loading in...5
×

In phan tich sac_ki_khi

1,009

Published on

0 Comments
1 Like
Statistics
Notes
  • Be the first to comment

No Downloads
Views
Total Views
1,009
On Slideshare
0
From Embeds
0
Number of Embeds
0
Actions
Shares
0
Downloads
51
Comments
0
Likes
1
Embeds 0
No embeds

No notes for slide

Transcript of "In phan tich sac_ki_khi"

  1. 1. 1 Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký Chương 1: CƠ SỞ LÍ THUYẾT CHUNG VỀ TÁCH SẮC KÝ 1.1. Giới thiệu phương pháp 1.1.1 Định nghĩa sắc kí (Chromatography) Định nghĩa của Mikhail S. Tsvett (1906): Sắc kí là một phương pháp tách trong đó các cấu tử của một hỗn hợp được tách trên một cột hấp thụ đặt trong một hệ thống đang chảy. Định nghĩa của IUPAC (1993): Sắc kí là một phương pháp tách trong đó các cấu tử được tách được phân bố giữa hai pha, một trong hai pha là pha tĩnh đứng yên còn pha kia chuyển động theo một hướng xác định. 1.1.2. Phân loại Người ta phân loại các phương pháp sắc kí dựa vào cơ chế hoạt động sắc kí: hấp phụ, phân bố, trao đổi ion… và vào tính chất của pha tĩnh cũng như phương pháp thể hiện sắc kí. Ví dụ: - Phương pháp sắc kí lỏng rắn trên cột, phương pháp sắc kí phân bố khí lỏng trên cột. - Phương pháp sắc kí phân bố lỏng lỏng trên bản phẳng hai chiều. - Phương pháp sắc kí phân bố lỏng lỏng pha ngược áp suất cao trên cột… Cơ chế sắc kí có nhiều nhưng để thực hiện quá trình sắc kí thì chỉ có hai dạng: dạng cột và dạng bản phẳng (bản kính, polime, kim loại, giấy). Trong sắc kí cột, pha tĩnh được giữ trong một cột ngắn và pha động được cho chuyển động qua cột bởi áp suất hoặc do trọng lực. Trong sắc kí bản mỏng, pha tĩnh được phủ trên một mặt phẳng thủy tinh hoặc kim loại. Thường để đơn giản hóa, tuy không chính xác người ta gọi tắt các phương pháp sắc kí: sắc kí khí, sắc kí lỏng, sắc kí lỏng cao áp, sắc kí lớp mỏng, sắc kí gel… Trong số các phương pháp sắc kí được biết, quan trọng nhất là sắc kí hấp phụ, sắc kí phân bố và sắc kí trao đổi ion. Dưới đây sẽ giới thiệu ba phương pháp sắc kí này nhằm vào hai mục đích: chuẩn bị mẫu cho chất phân tích và phân tích một hỗn hợp chất. Bảng 1: Phân loại các phương pháp sắc kí cột Phân loại chung Phương pháp cụ thể Pha tĩnh Kiểu cân bằng Sắc kí lỏng (LC) (Pha động : lỏng) - Lỏng- lỏng hoặc phân bố - Pha lỏng liên kết - Lỏng-rắn hoặc hấp phụ trao đổi ion - Lỏng được phủ trên một chất rắn - Chất hữu cơ được gắn trên một bề mặt rắn - Rắn Nhựa trao đổi ion - Phân bố - Phân bố giữa chất lỏng và bề mặt liên kết - Hấp phụ Trao đổi ion
  2. 2. 2 Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký Sắc kí khí (GC) (pha động: Khí) - Khí-lỏng - Khí - pha liên kết - Khí - rắn - Lỏng được phủ trên một chất rắn - Chất hữu cơ được liên kết trên một bề mặt rắn - Rắn - Phân bố giữa khí và lỏng - Phân bố giữa lỏng và bề mặt liên kết - Hấp phụ Sắc kí lỏng siêu tới hạn Pha lỏng: chất lỏng siêu tới hạn (supercritical fluid) Chất hữu cơ được liên kết trên một bề mặt rắn Phân bố giữa chất lỏng siêu tới hạn và bề mặt liên kết Hình 1.1: Sơ đồ nguyên tắc a) sắc kí cột b) sắc kí bản mỏng 1.2. Cơ sở lí thuyết chung của phương pháp sắc kí 1.2.1 Quá trình sắc kí Sắc kí là một kỹ thuật tách trong đó các cấu tử cần tách trong một hỗn hợp mẫu được vận chuyển bởi pha động đi qua pha tĩnh. Mẫu đi vào tướng động được mang theo dọc hệ thống sắc kí (cột, bản phẳng) có chứa pha tĩnh phân bố đều khắp. Pha động có thể là pha lỏng hoặc khí, pha tĩnh có thể là một lớp phim được phủ trên bề mặt của chất mang trơ hoặc một bề mặt rắn. Sự tương tác xảy ra giữa các cấu tử với pha tĩnh nhờ đó các cấu tử sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh. Pha động Mẫu Pha tĩnh Hướng chảy pha động Sắc kí đồ Detector Các cấu tử giải tách ra Pha động Lớp mỏng pha tĩnh Bản mỏng trơ Các cấu tử tách ra Hướng chảy pha động Mẫu (A+B+C) Xuất phát Điểm đến dung môi Nồng độ của B
  3. 3. 3 Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký Sự ái lực khác nhau của các chất tan trên pha tĩnh làm chúng di chuyển với những vận tốc khác nhau trong pha động của hệ thống sắc kí. Kết quả là chúng được tách thành những dải trong pha động và vào lúc cuối của quá trình các cấu tử lần lượt hiện ra theo trật tự tương tác với pha tĩnh. Cấu tử di chuyển chậm (tương tác yếu) ra trước, cấu tử bị lưu giữ mạnh hơn ra sau dưới dạng các đỉnh (pic) tách riêng rẻ (hoặc bậc thang) tùy thuộc vào cách tiến hành sắc kí và được hiển thị dưới dạng sắc kí đồ. Hình 1.1 minh họa một quá trình tách một hỗn hợp đơn giản gồm hai chất A và B (lực tương tác với pha tĩnh của A < B) theo thời gian. Mẫu chứa A và B được tiêm vào cột. Khi cho một chất rửa giải bắt đầu chảy qua cột, phần của mẫu được hòa tan trong pha động được di chuyển tại phần đầu của cột (tại thời điểm to). Ở đây các cấu tử A và B tự phân bố giữa hai pha. Tiếp tục cho pha động đi qua cột thì nó sẽ đẩy phần hòa tan này chạy xuống dưới và một sự phân bố mới giữa pha động và pha tĩnh sẽ xảy ra (thời điểm t1). Đồng thời sự phân bố giữa dung môi mới và pha tĩnh cũng diễn ra tại vị trí của mẫu lúc đầu. Việc thêm tiếp dung môi sẽ mang các phân tử hòa tan chạy xuống cột trong một loạt liên tiếp các chuyển biến giữa hai pha. Bởi vì sự di chuyển của chất tan chỉ xảy ra trong pha động, nên tốc độ trung bình của sự di chuyển chất tan phụ thuộc vào phần thời gian chất tan ấy nằm trong pha đó. Phần thời gian này là nhỏ đối với chất tan bị lưu giữ mạnh bởi pha tĩnh (cấu tử B trong ví dụ trên) và lớn đối với chất tan (cấu tử A) có sự lưu giữ trong pha động mạnh hơn. Sau một thời gian các phân tử chất A và B dần dần được tách khỏi nhau. Nếu đặt một detectơ có khả năng phát hiện được các chất tan (cấu tử A và B) tại cuối cột tách và tín hiệu của nó được vẽ lại như một hàm của thời gian (hoặc thể tích được thêm vào) thì một loạt pic đối xứng sẽ được ghi lại và được gọi là sắc kí đồ. Vị trí của các pic theo thời gian được dùng để nhận diện định tính và diện tích của píc được dùng cho phép phân tích định lượng của cấu tử đang xét.
  4. 4. 4 Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký Hình 1.2: Quá trình tách sắc kí trên cột của hai chất A và B 1.2.2. Các phương pháp tiến hành tách sắc kí Để thực hiện tách sắc kí người ta có thể sử dụng một trong ba phương pháp sau: 1.2.2.1. Phương pháp rửa giải Kỹ thuật này được sử dụng rộng rãi nhất trong các phương pháp sắc kí hiện nay. Một lượng nhỏ hỗn hợp mẫu được giới thiệu vào cột với pha động có ái lực với pha tĩnh bé hơn so với bất kì cấu tử cần tách có trong mẫu. Vì thế các cấu tử cần tách di chuyển Mẫu Cột nhồi Pha động Detector Sắc kí đồ Thời gian
  5. 5. 5 Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký với tốc độ chậm hơn so với chất rửa giải. Tốc độ này được xác định bởi ái lực tương đối của mỗi cấu tử lên pha tĩnh so với pha động, đó chính là hệ số phân bố K = Csp/Cmp. Ở đây Csp, Cmp là nồng độ của cấu tử đang xét trên pha tĩnh và trong pha động. Các cấu tử được rửa giải theo trật tự ái lực của chúng nhưng tốc độ di chuyển tương đối của chúng phụ thuộc vào tương tác 3 thành phần giữa chúng với pha động, với pha tĩnh và giữa pha động với pha tĩnh. Bởi vì các cấu tử được tách khỏi nhau với một vùng pha động ở giữa chúng nên phương pháp này được sử dụng trong các phép tách với mục đích phân tích. Pha động có thể không thay đổi thành phần dung môi trong suốt quá trình rửa giải; có thể thay đổi dung môi rửa giải sau một thời gian định trước (rửa giải theo từng giai đoạn); cũng có thể không thay đổi các dung môi tạo nên pha động nhưng thay đổi nồng độ của các thành phần có trong pha động sau một thời gian định trước (rửa giải gradient). 1.2.2.2. Phương pháp tiền lưu Hỗn hợp cần tách gồm các chất A, B và C được cho chảy liên tục vào phần trên của cột, trong đó A là cấu tử có ái lực yếu nhất với pha tĩnh. Do các cấu tử A, B và C bị lưu giữ trên cột, nên trước hết từ cột chảy ra chỉ có dung môi. A do có lực tương tác trên cột yếu nhất sẽ di chuyển xuống dưới còn các cấu tử có ái lực mạnh hơn A bị pha tĩnh giữ ở phần trên của cột. Do dung dượng có hạn của pha tĩnh nên khi vượt dung lượng này thì cấu tử A sẽ di chuyển dọc theo cột và ra khỏi cột ở dạng nguyên chất sau đó là hỗn hợp của các thành phần tiếp theo A+B rồi A+B+C. Phương pháp tiền lưu ít được dùng do không thực hiện được việc tách hoàn toàn các cấu tử, đặc biệt khi sử dụng sự tách sắc kí vào mục đích phân tích. 1.2.2.3. Phương pháp thế đẩy: Mẫu được cho vào cột, dùng dung môi rửa giải có ái lực với pha tĩnh mạnh hơn bất kì một cấu tử nào của hỗn hợp tách để đẩy các cấu tử cần tách thoát ra khỏi cột. Cấu tử thoát ra khỏi cột đầu tiên là cấu tử tương tác yếu nhất với pha tĩnh, sau đó đến các cấu tử khác có ái lực với pha tĩnh tăng dần. Phương pháp này tạo nên các dải rửa giải không hoàn toàn được tách khỏi nhau: có dải thu được chất nguyên chất nhưng có dải giữa các dải nguyên chất thì gồm hỗn hợp của chúng. Trong thực hành phòng thí nghiệm để tách các hỗn hợp phức tạp người ta thường hay dùng hơn cả là phương pháp rửa giải.
  6. 6. 6 Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký Hình 1.3: Các phương pháp rửa giải, tiền lưu, thế đẩy 1.2.3. Đặc tính sắc kí của chất tan 1.2.3.1. Tính chất lưu giữ Tính chất lưu giữ phản ánh sự phân bố của chất tan giữa pha tĩnh và pha động và được biểu thị bằng các đại lượng thể tích lưu hay thời gian lưu. Thể tích lưu VR là thể tích pha động cần thiết để vận chuyển chất tan i từ thời điểm đưa mẫu vào, đi qua cột và đến detectơ (trên sắc kí đồ là điểm cực đại của pic). Thời gian lưu tRi là thời gian từ lúc chất tan i được nạp vào cột tách ở bộ phận tiêm mẫu cho đến lúc chất ra khỏi cột ở thời điểm có nồng độ cực đại. Dung môi rửa giải (E) Pha tĩnh Rửa giải Tiền lưu Thế đẩy Đến Detector Tín hiệu Detector Thể tích dung môi rửa giải
  7. 7. 7 Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký Thể tích lưu có thể nhận được trực tiếp từ thời gian lưu tR trên sắc kí đồ bằng cách nhân với tốc độ thể tích dòng Fc (thể tích của pha động trên một đơn vị thời gian): VR = tR. Fc Tốc độ dòng được tính theo các thông số của cột như sau: M t c c t Ld F 4 2 Ở đây:  dc là đường kính của cột,  L là chiều dài cột,  εt là độ rỗng toàn phần của chất nhồi cột (độ rỗng của chất nhồi cột biểu thị tỉ số thể tích kẽ hở của chất nhồi và thể tích khối toàn phần của nó: đối với chất nhồi rắn = 0.35 - 0.45, chất nhồi xốp = 0.70 - 0.90, cột mao quản = 1.0),  Vc là thể tích bên trong cột. Tốc độ tuyến tính trung bình u của sự dịch chuyển chất tan là: Rt L u Tốc độ tuyến tính trung bình u của pha động là: Mt L u Ở đây tM hay to là thời gian không bị lưu giữ của chất tan (thời gian chất tan lưu trong pha động). Trong sắc kí khí, tM được lấy bằng thời gian cần thiết cho CH4 di chuyển đi qua cột. Tương ứng tM hay to có thể tích VM (hoặc Vo) biểu thị thể tích trống của cột (bao gồm cả thể tích của bộ phận tiêm mẫu (injector), thể tích các đoạn ống nối, thể tích rỗng của chính cột và thể tích detectơ). Thể tích lưu hiệu chỉnh V’R hoặc thời gian lưu hiệu chỉnh t’R được cho bởi: V’R = VR –VM hoặc t’R = tR – tM (thời gian không bị lưu giữ của chất tan gần đúng được xem như là thời gian lưu của pha động).
  8. 8. 8 Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký Hình 1.4: Sắc kí đồ minh họa các thời gian lưu t (hoặc thể tích lưu) và độ rộng của đáy pic W của chất tan không bị lưu giữ M và của 2 chất bị lưu giữ 1 và 2 1.2.3.2. Hệ số phân bố K (Partition coefficient) Mỗi cấu tử hoặc chất tan được phân bố giữa 2 pha với một cân bằng được thiết lập và tất cả các quá trình tách sắc kí được dựa trên sự khác nhau về khả năng phân bố của chất tan giữa pha động và pha tĩnh. Khi chất tan đi vào hệ thống sắc kí, nó ngay lập tức phân bố giữa các pha động và pha tĩnh. Giả thiết nếu pha động dừng lại vào bất kì một thời gian nào, chất tan có một sự phân bố cân bằng giữa hai pha, và nồng độ của chất tan ở trong mỗi pha được cho bởi hệ số phân bố nhiệt động: M s C C K Ở đây Cs và CM là nồng độ chất tan trong pha tĩnh và pha động tương ứng. Trường hợp khi K = 1 thì chất tan được phân bố bằng nhau giữa hai pha. Hệ số phân bố xác định tốc độ trung bình của mỗi vùng chất tan (chính xác là tâm vùng) do pha động vận chuyển khi nó đi qua cột. Đối với pic đối xứng, khi cực đại pic xuất hiện ở lối ra của cột, một nửa lượng chất tan đã được rửa khỏi cột trong thể tích lưu VR và một nửa còn lại được phân bố giữa thể tích pha động VM và thể tích pha tĩnh Vs: VRCM = VMCM + VsCs hay VR = VM + KVs hay VR – VM = KVs Tiêm mẫu Cường độ tín hiệu Detector Thời gian (thể tích)
  9. 9. 9 Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký Phương trình này đúng với cột phân bố lỏng, còn đối với cột hấp phụ, Vs phải thay bằng Ss là diện tích bề mặt của chất hấp thụ. 1.2.3.3. Hệ số dung lượng k’ (The capacity factor) Hệ số dung lượng k’ là thông số thực nghiệm quan trọng trong sắc kí cột được sử dụng rộng rải để mô tả các tốc độ dịch chuyển của các chất tan trên cột. Cho một chất tan, hệ số dung lượng k’ được định nghĩa như là tỉ số mol chất tan trong pha tĩnh và số mol chất tan trong pha động: k’ = M s MM ss V V K VC VC Tỉ số VM/Vs được gọi là tỉ số thể tích pha Hệ số dung lượng còn được định nghĩa là tỉ số giữa thời gian của chất tan lưu lại trên pha tĩnh và thời gian cần để chất tan đó di chuyển trong pha động suốt chiều dài của cột nếu không bị lưu giữ tM. M MR M MR M R V VV t tt t t k ' ' Khi k’ cho một chất tan nhỏ hơn 1 nhiều, sự rửa giải xảy ra rất nhanh nên việc xác định thời gian lưu là rất khó. Còn khi k’ khoảng 20 đến 30 thì thời gian rửa giải sẽ bị kéo dài. Vì vậy các phép tách nên được thực hiện ở những điều kiện mà các k’ của các chất tan nằm trong khoảng giá trị từ 1 đến 5. Giá trị k’ trong sắc kí khí có thể được thay đổi bởi việc thay đổi nhiệt độ và cách nhồi cột. Còn trong sắc kí lỏng, k’ thường được điều khiển để cho phép tách tốt hơn bởi thay đổi thành phần pha động và pha tĩnh. 1.2.3.4. Hệ số chọn lọc (The selectivity factor) Khả năng của một pha tĩnh tách 2 cấu tử A và B (B là cấu tử bị lưu giữ mạnh hơn) được xác định bởi tỉ số phân bố tương đối của chúng và cũng là những hệ số lưu giữ của chúng đối với một pha tĩnh đã cho. Hệ số chọn lọc α là một hàm của sự lưu giữ tương đối của mỗi cấu tử trên pha tĩnh: A B A B R R K K k k t t ' ' ' 1 ' 2
  10. 10. 10 Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký Hệ số chọn lọc của một cặp dải (pic) gần nhau là một hàm phụ thuộc vào loại pha tĩnh được sử dụng, pha động và nhiệt độ của cột. Để cho một sự tách được tốt thì α nên có gía trị lớn hơn 1. Hai chất cần tách càng tách ra xa khỏi nhau khi α càng lớn nhưng nếu quá lớn thì thời gian phân tích càng kéo dài, α nên trong khoảng từ 1,05 đến 2,0. 1.2.3.5. Những yếu tố ảnh hưởng đến sự lưu giữ Tốc độ di chuyển của một dải chất tan qua một cột hay một đĩa sắc kí lớp mỏng phụ thuộc vào sự phân bố của các phân tử chất tan giữa pha tĩnh và pha động. Những nhân tố ảnh hưởng đến sự phân bố hay sự lưu giữ là: Thành phần và tính chất của pha động Kiểu và tính chất của pha tĩnh Các lực tương tác các phân tử giữa các cấu tử của pha động và pha tĩnh Nhiệt độ Hai yếu tố góp phần để tách tốt các hợp chất bởi sắc kí là: Sự khác nhau về thời gian phân bố của chúng trong 2 pha: nếu sự khác nhau càng lớn thì sự tách chúng càng tốt. Độ doãng rộng của các pic nếu càng rộng thì sự tách chúng càng kém. 1. 3. Sự doãng rộng của pic và hiệu lực tách 1.3.1. Mở đầu Hiệu lực của một cột tách chịu tác động bởi độ lớn của sự doãng rộng pic xảy ra khi một chất chuyển động dọc theo cột. Chất tan khi chạy dọc theo cột có khuynh hướng phân bố như một hình phân bố chuẩn Gaussian với độ lệch chuẩn σ (hình 5). Nếu chất tan tiêu tốn nhiều thời gian khi dịch chuyển dọc xuống cột thì pic càng bị doãng rộng. Độ doãng rộng của một pic thường được biểu diễn thông qua các giá trị:  W1/2 là độ rộng của của pic được đo ở ½ chiều cao của pic,  W là độ rộng của đáy pic được xác định tại hai điểm cắt của hai đường tiếp tuyến của hai bên thân pic với đường nền.
  11. 11. 11 Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký Hình 1.5: Sơ đồ của một dải chất tan và sự đánh giá của dải sắc kí đồ cho hiệu lực cột. 1.3.2. Sự khuếch tán Nguyên nhân chính dẫn đến sự doãng rộng của pic là sự khuếch tán. Hệ số khuếch tán D đo tốc độ J tại đó một chất di chuyển một cách ngẫu nhiên từ một vùng có nồng độ cao đến vùng có nồng độ thấp. dx dc D sm mol J ) . ( 2  D là hệ số khuếch tán  c là nồng độ  x là độ dài di chuyển Sự khuếch tán trong chất lỏng thấp hơn trong chất khí khoảng 104 lần, còn các phân tử lớn thì khuếch tán chậm hơn các phân tử nhỏ từ 10 đến 100 lần. Độ rộng của dải sắc kí do khuếch tán được biểu diễn qua phương trình sau: )4/(2 4 Dtx e Dt m c ở đây: Độ lệch chuẩn của dải Tiêm mẫu Chiều cao pic Chiều cao ½ pic Trục thời gian
  12. 12. 12 Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký  c là nồng độ (mol/cm3 ),  t là thời gian,  x là khoảng cách di chuyển được dọc theo cột,  D là hệ số khuếch tán,  m là số mol chất tan dịch chuyển qua một đơn vị diện tích tiết diện ngang của cột. Phương trình trên cho biết độ lệch chuẩn của dải sắc kí: Dt2 1.3.3. Chiều cao đĩa lý thuyết H Chiều cao đĩa lý thuyết H là một hằng số giữa phương sai σ2 của dải chất tan và khoảng cách x mà nó di chuyển. Tên gọi này là từ lý thuyết chưng cất trong đó sự tách được thực hiện trong những giai đoạn rời rạc được gọi là đĩa tách. H = σ2 /L Với L là chiều dài của cột nhồi Có thể giả định cột sắc kí được chia thành N phần mỏng hay N lớp hay N đĩa tách. Ở mỗi đĩa sự phân bố chất tan vào hai pha lại đạt đến một trạng thái cân bằng mới (sắc kí là một quá trình động, thực ra pha động chảy liên tục và thời gian không đủ để thiết lập trạng thái cân bằng). Chiều cao của đĩa tách cũng được gọi là chiều cao đĩa lý thuyết. Mặc dù trong cột sắc kí không có các đĩa thực nhưng người ta vẫn sử dụng khái niệm này để chỉ mối quan hệ giữa độ rộng của dải sắc kí và khoảng cách dịch chuyển dọc theo cột sắc kí. Nếu chiều cao đĩa lý thuyết càng nhỏ (tức số đĩa lý thuyết càng nhiều) thì độ rộng hay sự doãng rộng của pic càng nhỏ. Khả năng tách các cấu tử của một hỗn hợp của một cột được cải thiện nếu giảm chiều cao một đĩa lý thuyết. Các chất tan khi dịch chuyển qua cùng một cột tách có chiều cao đĩa lý thuyết khác nhau bởi vì chúng có hệ số khuếch tán khác nhau. Chiều cao một đĩa lý thuyết khoảng từ 0.1 đến 1 mm trong sắc kí khí và khoảng 10 µm trong săc kí lỏng hiệu năng cao và nhỏ hơn 1µm trong sắc kí điện di mao quản. 1.3.4. Số đĩa lý thuyết N N = 2 2 L H L Ở đây L là chiều dài cột, với Rt WL 4 nên:
  13. 13. 13 Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký N = 2 2 16 W tR Hay N = 2 2/1 2 54.5 W tR Với:  tR là thời gian lưu của pic,  W là độ rộng của pic ở đáy,  W1/2 là chiều rộng của pic đo ở nửa chiều cao từ đỉnh đến đáy pic. Công thức này được sử dụng để xác định thực nghiệm số đĩa lí thuyết của một cột tách. Hiệu lực của cột tách sẽ tăng lên khi số đĩa lí thuyết càng lớn và khi chiều cao đĩa càng nhỏ. 1.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu lực tách của cột 1.4.1. Ảnh hưởng của tốc độ của pha động Mức độ ảnh hưởng động học lên hiệu lực của một cột rõ ràng phụ thuộc vào độ dài thời gian của pha động tiếp xúc với pha tĩnh tức phụ thuộc vào tốc độ pha động. Nghiên cứu về hiệu lực cột nói chung được thực hiện bởi việc xác định chiều cao H như là một hàm phụ thuộc vào tốc độ pha động. Kết quả cho thấy cả sắc kí khí lẫn sắc kí lỏng đều có chiều cao đĩa lí thuyết đạt cực tiểu ở trong vùng tốc độ dòng thấp của pha động và nói chung tốc độ đó của sắc kí lỏng thấp hơn so với sắc kí khí. 1.4.2. Lí thuyết về sự doãng rộng pic Hơn 40 năm qua, rất nhiều công trình nghiên cứu về thực nghiệm lẫn lý thuyết về mối quan hệ định lượng để giải thích ảnh hưởng của các thông số như: vận tốc tuyến tính của pha động, hệ số khuếch tán trong pha động và trong pha tĩnh, tỉ số phân bố, đường kính của hạt nhồi, bề dày của lớp chất lỏng phủ trên hạt… đến chiều cao đĩa lý thuyết cho các loại cột khác nhau. Những yếu tố ảnh hưởng này được phản ánh qua phương trình của Van Deemter như sau: uCuC u B AH Ms Ở đây:  H là chiều cao đĩa lý thuyết (cm);  u là vận tốc tuyến tính của pha động (cm/s);
  14. 14. 14 Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký  A là hệ số mô tả ảnh hưởng đến H của sự khuếch tán xoáy;  B là hệ số khuếch tán dài;  Cs và CM là các hệ số chuyển khối của pha tĩnh và pha động. Hình 1.6: Đường cong H-u (Van Deemter) cho một cột sắc kí khí 1.4.2.1 Sự khuếch tán xoáy: Thành phần A mô tả sự khuếch tán xoáy của các cấu tử và các đường đi khác nhau của pha động chạy xuyên qua pha tĩnh được nhồi trong cột. Vì thế các cấu tử phải di chuyển với những khoảng cách đường đi khác nhau qua một đơn vị chiều dài của cột. Số hạng A độc lập với tốc độ của pha động nhưng phụ thuộc vào:  Đường kính hạt nhồi trong pha tĩnh dp,  Cách chúng được nhồi trong cột hoặc được phủ trên bản mỏng được biểu diễn qua λ là hàm số phụ thuộc vào độ đồng thể của chất nhồi, dạng hình học và kích thước của cột: A = λ.dp Một số phân tử chất tan có đường đi gần với thành cột sẽ di chuyển nhanh hơn so với những phân tử khác do ở đó mật độ nhồi tương đối thấp, tốc độ nhanh hơn. Các phân tử đi theo đường ngắn hơn được rửa giải ra trước những phân tử đi theo những đường quanh co dài hơn dẫn đến doãng rộng pic của mỗi chất tan. Một sự tách và độ rộng của pic tối thiểu sẽ đạt được nếu dùng các hạt nhồi có đường kính trung bình đủ nhỏ và được nhồi đồng thể vào trong cột. Tuy nhiên, hạt càng nhỏ thì áp suất cần để pha động dịch chuyển qua cột càng cao, đặc biệt sẽ gặp khó khăn để nhồi cột đồng thể. Trong sắc kí khí cột nhồi người ta nhồi cột với các hạt có kích thước tối ưu Đường H = f(u) Số hạng B Số hạng Cs Số hạng CM Số hạng A Vận tốc tuyến tính trung bình u
  15. 15. 15 Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký khoảng 0.15 µm. Trong sắc kí khí – lỏng khi sử dụng màng mỏng trên thành cột mao quản thì số hạng A = 0. Hình 1.7: Ảnh hưởng của khuếch tán xoáy (a), khuếch tán dọc (b) sự truyền khối (c) đến phương trình Van Deemter. 1.4.2.2. Sự khuếch tán dọc Khuếch tán là quá trình chất di chuyển từ nơi có nồng độ cao đến nơi có nồng độ thấp hơn với tốc độ tỉ lệ với sự chênh lệch nồng độ và hệ số khuếch tán của chất đang xét. Trong sắc kí, khuếch tán dọc được dùng để mô tả sự khuếch tán diễn ra dọc theo trục của cột và song song với đường đi của pha động. Nó dẫn đến sự dịch chuyển của chất tan từ trung tâm nồng độ của một dải chất tan đến những vùng loãng hơn về hướng phía trước hoặc sau của dòng chảy. Khuếch tán dọc là một nguồn của sự doãng rộng của pic trong sắc kí khí do tốc độ khuếch tán cao trong pha khí. Hiện tượng này ít hơn trong sắc kí lỏng. Độ lớn của B Pha động Hạt pha tĩnh Tương tác chất tan với hạt pha tĩnh Nồng độ của dải Sự khuếch tán ra trước và sau của dải Pha động Dải chất tan Pha động Pha tĩnh Di chuyển khỏi pha tĩnh Di chuyển vào pha tĩnh Chất tan bị giữ trong pha tĩnh
  16. 16. 16 Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký trong phương trình Van Deemter được xác định phần lớn bởi hệ số khuếch tán DM của chất phân tích trong pha động và tỉ lệ thuận với hằng số này: B = 2γ. DM ở đây:  γ là hệ số trở kháng của chất nhồi cột đến khuếch tán dọc,  DM là hệ số khuếch tán của chất tan trong pha động. Trong các cột mao quản thì γ có giá trị bằng 1 còn trong cột nhồi thì khoảng 0.7. B ảnh hưởng lớn trong phương trình V-D khi tốc độ pha động thấp nên trong sắc kí lỏng ảnh hưởng này ít hơn nhiều bởi vì pha động có tốc độ thấp hơn nhiều so với của sắc kí khí. 1.4.2.3. Sự truyền khối trong pha tĩnh Khi pha tĩnh là chất lỏng: hệ số truyền khối Cs tỉ lệ thuận với bình phương chiều dày của lớp phim trên bề mặt chất mang và tỉ lệ nghịch với hệ số khuếch tán Ds của chất tan trong lớp phim. Giải thích: với lớp phim dày các phân tử chất tan phải di chuyển trung bình xa hơn để tiến đến bề mặt, và với hệ số khuếch tán nhỏ hơn, chúng sẽ di chuyển đến chậm hơn. Hậu quả là tốc độ truyền khối chậm hơn và chiều cao đĩa lý thuyết tăng lên. Khi pha tĩnh là một bề mặt rắn: hệ số truyền khối pha tĩnh Cs tỉ lệ thuận với thời gian được đòi hỏi cho những cấu tử bị hấp phụ hoặc giải hấp, hay tỉ lệ nghịch hằng số tốc độ bậc nhất của các quá trình này. Sự chuyển động của phân tử trong pha tĩnh tiêu tốn một thời gian dài hơn, trong khi những phân tử khác chuyển động về phía trước cùng với pha động, sẽ dẫn đến pic sẽ doãng rộng. Pha động đi qua cột càng nhanh và tốc độ truyền khối trong pha tĩnh càng nhỏ thì pic càng doãng rộng hơn. Khắc phục: những chất lỏng ít nhớt hơn có thể được chọn làm pha tĩnh để tăng hệ số khuếch tán. Có thể giảm chiều dày của pha tĩnh nhưng dung lượng của cột sẽ bị giảm xuống. 1.4.2.4. Sự truyền khối trong pha động Các quá trình truyền khối trong pha động rất phức tạp. Sự hiểu biết tốt về mặt định tính của những yếu tố từ nguyên nhân này tác động đến sự doãng rộng của pic dẫn đến sự cải thiện lớn lao trong tất cả các loại cột sắc kí. Hệ số truyền khối trong pha động CM:  tỉ lệ nghịch với hệ số khuếch tán của chất tan trong pha động DM  tỉ lệ thuận với bình phương đường kính của hạt nhồi,  tỉ lệ thuận với bình phương của đường kính cột và tốc độ chảy của pha động.
  17. 17. 17 Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký Sự doãng rộng của dải trong pha động là do một phần vào số đông các đường đi nhờ đó một phân tử hoặc ion có thể tìm được cách của nó để đi qua cột nhồi. Trên bề mặt của pha tĩnh có thể chứa các lỗ khích thước khác nhau nên một số các phân tử chất tan có thể chuyển động vào ra các lỗ này dẫn đến sẽ bị chậm so với những phân tử khác. Các dòng chất lỏng của pha động ở gần các hạt chuyển động chậm hơn dòng chất lỏng ở giữa khoảng cách các hạt. Như vậy thời gian lưu trong cột cho các phân tử của cùng một chất cũng khác nhau. Các phân tử này đi đến cột qua những khoảng thời gian khác nhau dẫn đến sự doãng rộng pic. Ảnh hưởng này thỉnh thoảng được gọi là khuếch tán xoáy, độc lập với tốc độ của dung môi. 1.4.2.5. Các phương pháp giảm sự doãng rộng pic Hai yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu quả của cột là đường kính của các hạt nhồi và đường kính của cột:  Nếu sử dụng các hạt nhồi có đường kính càng nhỏ thì càng giảm chiều cao đĩa lý thuyết.  Trong khi đó lợi dụng ảnh hưởng của đường kính cột, các cột ngày càng hẹp hơn được sử dụng trong những năm gần đây. Với pha động khí, tốc độ của khuếch tán dọc có thể được giảm một cách đáng kể bởi hạ thấp nhiệt độ và như vậy làm giảm hệ số khuếch tán DM. Điều này dẫn đến chiều cao đĩa lý thuyết sẽ nhỏ hơn tại nhiệt độ thấp. Ảnh hưởng này không đáng kể trong trường hợp sắc kí lỏng bởi vì sự khuếch tán là đủ chậm nên sự khuếch tán dọc có ảnh hưởng rất nhỏ đến chiều cao đĩa lý thuyết. Đối với pha tĩnh lỏng, chiều dày của lớp chất lỏng hấp thụ nên càng mỏng càng tốt bởi vì Cs trong phương trình Van-Deemter tỉ lệ thuận với bình phương của đại lượng này. 1.5. Độ phân giải của cột (Column resolution) 1.5.1. Định nghĩa Trong sắc kí, độ phân giải Rs của hai pic được xác định như sau (hình 8): Rs = 2 12 12 WW tt W V W t RR av R av R ở đây : o ΔtR và ΔVR là hiệu của thời gian hoặc thể tích lưu giữ của hai pic, o Wav là độ rộng trung bình của hai pic.
  18. 18. 18 Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký Hình 1.8: Sự phân giải pic. Tiêm mẫu Thời gian Độ phân giải kém, độ chọn lọc tồi Độ phân giải kém, độ chọn lọc tốt nhưng thời gian phân tích dài Độ phân giải kém, độ chọn lọc tốt và thời gian phân tích hợp lí Độ phân giải kém, độ chọn lọc tốt nhưng thời gian phân tích quá dài, pic bị doãng rộng
  19. 19. 19 Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký Độ phân giải của một cột tách cho biết khả năng tách hai chất phân tích bởi cột. Nếu cột tách có độ phân giải khoảng 1.5 thì phép tách A và B gần như hoàn toàn (sự xen phủ chỉ còn khoảng 0.3%), trong khi nếu độ phân giải 0.75 thì không tách được còn độ phân giải bằng 1 thì sự xen phủ của hai pic còn khoảng 4%. Độ phân giải cho một pha tĩnh đã chọn có thể được cải thiện bởi tăng chiều dài của cột tách (tức tăng số đĩa lí thuyết N của cột tách) nhưng như vậy sẽ làm kéo dài thời gian phân tích. 1.5.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến độ phân giải Mối quan hệ giữa số đĩa lý thuyết và độ phân giải là: Từ M MR t tt k' ' 1 ' 2 k k 2 2 16 W t N R Rs = 2 12 12 WW tt RR Rút ra: Độ phân giải Rs = ) 1 )( 1 ( 4 ' 2 ' 2 k kN ở đây:  N là số đĩa lý thuyết,  k’2 là hệ số dung lượng của cấu tử thứ hai, α = ' 1 ' 2 k k Nếu số đĩa lý thuyết của 2 pic không giống nhau thì thay thế N bằng 21NN và thay k’2 bằng k’av. Cải thiện Rs nhờ chiều cao đĩa lý thuyết
  20. 20. 20 Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký Một chi tiết quan trọng trong phương trình trên là độ phân giải tỉ lệ thuận với N . Vì vậy nếu tăng gấp đôi chiều dài cột thì tăng độ phân giải lên 2 lần. Tuy nhiên khi tăng số đĩa lý thuyết lên do tăng chiều dài cột thì quá trình sắc kí phải tiêu tốn nhiều thời gian hơn trừ khi sự tăng số đĩa là do giảm chiều cao mỗi đĩa và không tăng chiều dài của cột, nhiệt độ của cột (cho trường hợp sắc kí khí) và chiều dày của lớp phim (cho sắc kí lỏng). Việc tối ưu hóa tốc độ pha động cũng có ích. Cải thiện Rs nhờ hệ số chọn lọc α Khi tăng α hay khi tăng tỉ số phân bố thì độ phân giải cũng tăng theo. Cách để thay đổi α là thay đổi pha tĩnh hoặc thay đổi cả pha tĩnh lẫn pha động trong sắc kí lỏng bởi vì thay đổi bản chất của các pha sẽ dẫn đến thay đổi α. Khi tỉ số phân bố =2 thì đảm bảo cho sự phân giải tốt. Tuy nhiên sự tối ưu này là cho một cặp cấu tử. Trong trường hợp hỗn hợp chứa nhiều cấu tử thì cần phải thay đổi k’ để có sự phân tách giữa các cấu tử. Trong sắc kí khí, giá trị tối ưu hóa của k’ có thể đạt được bằng chương trình hóa nhiệt độ còn trong sắc kí lỏng thì bằng chương trình hóa thành phần pha động tức thay đổi tỉ lệ giữa các dung môi của pha động. Cải thiện Rs nhờ hệ số dung lượng Thường sự tách có thể được cải thiện một cách đáng kể bằng việc thay đổi hệ số dung lượng k’. Nói chung, sự tăng giá trị k’ làm tăng độ phân giải. Để xác định khoảng tối ưu của giá trị k’, phương trình được viết dưới dạng: '1 ' k k QRs Ở đây Q chứa phần còn lại của phương trình. Thường giá trị của k’ > 10 nên tránh vì dù tăng lên chút ít độ phân giải nhưng thời gian đòi hỏi cho sự tách tăng lên rất đáng kể. Giá trị tối ưu của k’ trong khoảng từ 1 đến 5. Cách dễ nhất để cải thiện độ phân giải là tối ưu hóa k’:  Đối với pha động là khí, k’ thường có thể được cải thiện bởi sự thay đổi nhiệt độ.  Các phương pháp để giảm chiều cao của đĩa lý thuyết như được đề cập trong mục 4, bao gồm giảm kích thước hạt nhồi, đường kính của cột
  21. 21. 21 Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký Bài tập Câu 1.1: Trình bày định nghĩa của các khái niệm sau: (2 điểm) a) Sự rửa giải b) Pha động c) Pha tĩnh d) Hệ số phân bố e) Thời gian lưu f) Hệ số dung lượng g) Độ chọn lọc h) Chiều cao đĩa lí thuyết Câu 1.2: Trình bày các yếu tố làm doãng rộng các pic (1.5đ) Câu 1.3: Mô tả phương pháp để xác định số đĩa lí thuyết của một cột sắc kí. Câu 1.4: Trình bày sự khác nhau giữa a) Sắc kí khí-lỏng và sắc kí khí-rắn b) Sắc kí lỏng-lỏng và sắc kí lỏng-rắn Câu 1.5: Trình bày các phương pháp để cải thiện độ phân giải của hai chất trên một cột sắc kí. Câu 1.6: Trong một phép phân tích sắc kí tinh dầu chanh, pic của limonene có thời gian lưu là 8.36 min với độ rộng đáy pic bằng 0.96 phút. Terpinene rửa giải ở 9.54 phút, với độ rộng đáy pic là 0.64 phút. Tính độ phân giải của 2 pic trên? (Ans: 1.48) Câu 1.7: a) Trong một phép phân tích sắc kí các axit có trọng lượng phân tử thấp, butyric acid rửa gải ở thời gian lưu là 7.63 phút. Thời gian không lưu giữ TM của cột là 0.31 phút. Tính hệ số dung lượng của butyric acid. (Ans: 23.6) b) Thời gian lưu của isobutyric acid là 5.98 phút. Hỏi độ chọn lọc của isobutyric acid và butyric acid? (Ans: 1.29) Câu 1.8: Trong một phép phân tích sắc kí thuốc trừ sâu cơ clo Dieldrin cho một pic với thời gian lưu là 8.68 phút và độ rộng đáy pic là 0.29 phút. Hỏi có bao nhiêu đĩa lí thuyết liên quan đến phép tách này ? Cho chiều dài cột là 2.0 met, Tính chiều cao một đĩa lí thuyết? (Ans:0.14 mm) Câu 1.9: Một hỗn hợp benzene, toluene, và methane được tiêm vào một máy sắc kí khí. Methane cho một pic sắc nhọn ở 42s, trong khi benzene và toluene có thời gian lưu 251 s và 333s. Tính thời gian lưu hiệu chỉnh và hệ số dung lượng cho mỗi chất tan. Tính độ chọn lọc giữa benzene và toluene. (Ans: α = 1.39)
  22. 22. 22 Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký Câu 1.10: Các số liệu sau đây thu được từ phép tách 4 cấu tử trong cột mao quản dài 20-m. Compound tr (min) w (min) A 8.04 0.15 B 8.26 0.15 C 8.43 0.16 (a) Tính số đĩa lí thuyết của mỗi hợp chất và số đĩa lí thuyết trung bình của cột. (b) Tính chiều cao trung bình của một đĩa lí thuyết. (c) Giải thích tại sao mỗi hợp chất có thể có số đĩa lí thuyết khác nhau. Câu 1.11: Moody đã nghiên cứu hiệu lực tách của phép tách sắc kí khí 2-butanone trên cột dinonyl phthalate . Đánh giá chiều cao đĩa lí thuyết như một hàm của tốc độ dòng pha động theo phương trình van Deemter với A là 1.65 mm, B là 25.8 mm x mLx min–1 , and C là 0.0236 mm x min x mL–1 . (a) Vẽ đồ thị biễu diễn H theo u (tốc độ dòng) trong khoảng 5–120 mL/min. (b) Khoảng giá trị nào của tốc độ dòng pha động cho mỗi giá trị của A, B và C có ảnh hưởng lớn nhất. (c) Giá trị tối ưu của tốc độ dòng và chiều cao của đĩa lí thuyết ở tại giá trị đó (d) Đối với cột mao quản mở thì giá trị A bằng 0. Nếu B và C vẫn không thay đổi thì tốc độ dòng tối ưu là bao nhiêu và chiều cao đĩa lí thuyết ở giá trị này?
  23. 23. 23 Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký Chương 2: SẮC KÍ KHÍ 2.1. Mở đầu 2.1.1 Khái niệm Cơ sở để tách bằng sắc kí khí là sự phân bố của mẫu thử giữa hai pha: pha tĩnh có bề mặt tiếp xúc lớn, pha động là khí thấm qua toàn bề mặt tĩnh đó. Nếu pha tĩnh là rắn thì gọi là sắc kí khí-rắn. Chất rắn nhồi cột thường là silicagel, rây phân tử hoặc than hoạt tính. Quá trình này chủ yếu là hấp phụ. Nếu pha tĩnh là lỏng, ta có sắc kí khí-lỏng. Chất lỏng bao bọc quanh bề mặt một chất rắn trơ, gọi là chất mang, tạo nên một lớp phim mỏng. Cơ sở cho sự tách ở đây chính là sự phân bố của mẫu trong và ngoài lớp phim mỏng này. 2.1.2 Vài nét lịch sử 1905 Ramsey tách hỗn hợp khí và hơi dựa trên cơ sở hấp phụ của than hoạt. 1906 Tswett tách các sắc tố thực vật trên cột và gọi quá trình tách là ‘sắc kí’ 1941 Martin và Synge (giải thưởng Nobel) trình bày lý thuyết đĩa trong chưng cất và chiết suất ngược dòng. Trên cơ sở đó James và Martin đề xuất ra sắc kí khí-lỏng (1952) Từ đó đến nay GC ngày càng hoàn thiện. Đến năm 1968 đã có khoảng 18000 công trình về GC. Những năm gần đây được sự hỗ trợ của công nghệ điện tử và tin học, GC đạt được nhiều thành tựu hơn nũa. 2.2.Thiết bị 2.2.1. Giới thiệu Hiện nay, hơn 30 nhà sản xuất cung cấp ra thị trường khoảng 150 mẫu khác nhau của thiết bị sắc kí khí. Trong thập niên 70, các bộ tích phân kế điện tử và xử lý số liệu dựa trên máy tính trở nên thông dụng. Thập niên 80 đã xuất hiện các thiết bị sắc kí khí với các thông số như nhiệt độ của cột, tốc độ dòng, tiêm mẫu, được điều khiển bằng máy tính với giá cả vừa phải; và có lẽ quan trọng nhất là sự phát triển của các cột có khả năng tách những mẫu phức tạp có chứa nhiều cấu tử trong một khoảng thời gian ngắn. Những thành phần chính của thiết bị sắc kí khí được mô tả trong hình 2.1.
  24. 24. 24 Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký Hình 2.1: Sơ đồ khối của một máy sắc kí khí Hình 2.2: Một sắc kí đồ tiêu biểu tách các este bão hòa bởi sắc kí khi-lỏng 1. methyl formate 2. methyl acetate 3. ethyl formate 4. ethyl acetate 5. n-propyl formate 6. iso-propyl acetate 7. n-butyl formate 8. sec-butyl acetate 9. iso-butyl acetate 10. n-butyl acetate 2.2.2 Hệ thống cung cấp khí mang Các khí mang phải trơ về mặt hóa học như He, Ar, N2, CO2 và H2 và việc chọn lựa khí mang thường được quyết định bởi loại detector sử dụng. Hệ thống cung cấp khí mang bao gồm các bộ điều chỉnh áp suất (pressure regulators), các thiết bị đo áp suất (gauges), và thiết bị đo tốc độ dòng. Hệ thống khí mang còn chứa một hệ thống lọc phân tử để tách nước và các chất nhiễm bẩn khác. Tốc độ dòng được kiểm soát bởi các bộ điều chỉnh áp suất hai giai đoạn được lắp vào các bình chứa khí mang. Bộ điều dòng Bộ điều áp Bộ tiêm mẫu Bình khí pa động Lò Cột tách Tiêm mẫu Thời gian Thiết bị đo tốc độ dòng Lớp đệm cao su silicon
  25. 25. 25 Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký Áp suất của khí vào thiết bị nằm trong khoảng từ 10 đến 50 psi để có tốc độ dòng từ khoảng 30 đến 150 ml/ph đối với cột nhồi và khoảng từ 1 đến 25 ml/ph đối với cột mao quản. Nói chung, nếu áp suất đi vào thiết bị không đổi thì tốc độ dòng sẽ không đổi. Để đo tốc độ dòng khí người ta dùng thiết bị đo tốc độ dòng (flowmeter) với bọt xà phòng và đồng hồ bấm giây. Khí mang Độ giảm áp suất tỉ lệ với độ nhớt khí mang nên cần chọn khí mang có độ nhớt thấp cho cột mao quản và cột nhồi chặt. Bảng sau dẫn ra một số đặc tính cơ bản của một số khí mang Khí Độ dẫn điện χ, 10-4 cal/cm.o K Độ nhớt η ở 1 atm 50o C 100o C 200o C 300o C Argon Heli Nito Hydro 0.52 4.08 0.37 5.47 242 208 188 94 271 229 208 103 321 270 246 121 367 307 - 139 Khi lựa chọn cần chú đến detector đang sử dụng như sau: Detector đo độ dẫn cần phải sử dụng khí mang có độ dẫn cao như H2, He. Khí He có ưu điểm không nguy hiểm. Detector ion hóa ngọn lửa thường sử dụng khí mang N2 do rẻ và không nhuy hiểm nhưng trong trường hợp ghép nối với các thiết bị khác, ví dụ ghép nối với khối phổ phải dùng khí mang là heli. Detector cộng kết ngọn lửa thường dùng khí mang là N2. Sau đây là đặc điểm của một số khí mang thông dụng: Khí H2 khi sử dụng làm khí mang cần dùng khí nitơ làm khí bảo vệ thổi qua cột trước. Trong các phòng thí nghiệm người ta đã dùng phổ biến máy sản xuất khí hydro với công suất từ 125 ml/ph đến 225 ml/ph. Khi dùng H2 trong phòng thí nghiệm phải có mày dò chỗ hở H2 và cấm lửa. Khí He, argon là khí trơ hóa học rất thích hợp cho sắc kí ở nhiệt độ cao. Khí nitơ do không nguy hiểm, giá rẻ và dễ dàng làm tinh khiết nên N2 được dùng nhiều cho sắc kí khí. Cần chú y là độ dẫn nhiệt của N2 rất gần với độ dẫn của nhiều khí và hơi nhiều chất hữu cơ nên có trường hợp pic sắc kí có thể bị ngược. 2.2.3 Hệ thống tiêm mẫu
  26. 26. 26 Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký Cách thông dụng nhất để đưa mẫu vào cột là sử dụng một bơm tiêm mẫu vi lượng (microsyringe) để tiêm một mẫu lỏng hoặc khí qua một đệm cao su silicon (septum) chịu nhiệt vào một buồng hóa hơi (injector). Buồng này được đốt nóng với nhiệt độ thích hợp và được nối với cột tách (hình 3). Đối với các cột tách thông thường, cỡ mẫu thường thay đổi từ một vài đến 20µl. Cột mao quản đòi hỏi lượng mẫu đưa vào nhỏ hơn nên trong trường hợp này hệ thống chia dòng mẫu được thiết kế trong bộ injector được sử dụng để chỉ giao một phần nhỏ lượng mẫu được tiêm đi vào cột, phần còn lại được thải ra ngoài. Kỹ thuật sử dụng bơm tiêm Hút dung dịch mẫu vào bơm tiêm và điều chỉnh dung dịch đến vạch rồi kéo ngược pit tông ra sau để lượng mẫu đó chuyển hết vào thân bơm tiêm (đầu kim rỗng). Sau khi xuyên kim qua lớp đệm cao su silic của injector để yên khoảng 3 đến 5 giây để kim được cân bằng nhiệt độ trong injector rồi mới đẩy pittong. Cách này giúp tránh một số cấu tử khó bay hơi còn đọng lại ở đầu kim gây sai số khi định lượng những cấu tử này. Tiêm mẫu có chia dòng (Split injection) Thích hợp cho mẫu có các cấu tử phân tích có nồng độ lớn hơn 0.1% mẫu. Với các phân tích có độ phân giải cao, các kết quả tốt nhất thu được cho lượng nhỏ nhất của mẫu (≤ 1µl) tiêm vào có thể được dò tìm khoảng ≤ 1ng cho mỗi cấu tử. Việc tiêm toàn bộ mẫu sẽ làm quá tải cột có đường kính 0.32 mm hoặc nhỏ hơn. Trong khi đó tiêm mẫu có chia dòng chỉ giới thiệu vào cột khoảng 0.2 đến 2% lượng mẫu. Mẫu được tiêm nhanh (< 1s) qua lớp đệm cao su silic (septum) vào vùng hóa hơi của hệ thống tiêm mẫu (injector) được giữ ở nhiệt độ cao (ví dụ ở 350o C) để quá trình bay hơi mẫu được diễn ra nhanh (hình 4). Một dòng chảy mạnh của khí mang lôi kéo mẫu qua buồng trộn, ở đó có sự hóa hơi hoàn toàn và hòa trộn tốt. Tại điểm chia dòng, một phần nhỏ của hơi đi vào trong cột sắc kí còn phần lớn đi qua van chia dòng đến lỗ thông khí thải. Tỉ lệ của mẫu không được giới thiệu vào cột được gọi là tỉ số chia dòng (split ratio) có giá trị từ 50:1 đến 600:1. Sau khi mẫu bị sục ra khỏi buồng tiêm mẫu (khoảng 30 s), van chia dòng đóng lại và khí mang được giảm tương ứng. Một µl chất lỏng được tiêm vào sẽ tạo khoảng 0.5 ml thể tích khí và nhanh chóng làm đầy buồng tiêm mẫu. Vài khí có thể thoát ra trở lại theo đường của đệm cao su silicon. Các cấu tử có nhiệt độ sôi thấp sẽ thoát ra đầu tiên rồi đến các cấu tử có nhiệt độ sôi cao hơn. Nhiệt độ của buồng tiêm mẫu nên đủ lớn để giảm thiểu phần mất này của mẫu. Tuy nhiên nếu nhiệt độ quá cao, sự phân hủy mẫu có thể xảy ra. Trong suốt quá trình tiêm mẫu và sắc kí, có dòng khí 1ml/ph làm sạch lớp đệm cao su silicon để tách hơi mẫu dư và các khí thoát ra từ lớp đệm cao su này (septum purge).
  27. 27. 27 Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký Tiêm mẫu không chia dòng (splitless injection) Thích hợp cho phân tích lượng vết những cấu tử có nồng độ nhỏ hơn 0.01% mẫu và cách tiêm này có khoảng 80 % mẫu được giới thiệu vào cột. .Hệ thống tiêm mẫu tương tự như trường hợp tiêm mẫu chia dòng (hình 2), nhưng ống thủy tinh trong buồng tiêm mẫu là thẳng, trống và không có buồng trộn mẫu. Một thể tích lớn (khoảng 2 µl) của dung dịch được pha loãng trong dung môi có nhiệt độ sôi thấp được tiêm chậm (khoảng 2s) vào trong ống thủy tinh của buồng tiêm mẫu với lỗ thoát chia dòng bị đóng. Nhiệt độ của buồng tiêm mẫu cho chế độ không chia dòng giữ thấp hơn (khoảng 220o C) so với chế độ chia dòng vì mẫu bị lưu giữ lâu hơn trong buồng tiêm mẫu và tránh mẫu bị phân hủy nhiệt. Hình 2.3: Hệ thống tiêm mẫu có chia dòng, không chia dòng và tiêm mẫu vào cột 2.3. Cột sắc ký 2.3.1. Giới thiệu Trong thực tế có nhiều dạng cột tách khác nhau nhằm thỏa mãn các mục đích nghiên cứu. Nói chung, cột tách sắc kí cần thỏa mãn các yêu cầu sau: Đảm bảo trao đổi chất tôt giữa pha động và pha tĩnh nhờ việc tối ưu hóa các thông số của phương trình Van Deemter. Độ thấm cao tức có độ giảm áp suất nhỏ với một tốc độ khí mang nhất định. Khả năng tải trọng cao của cột. Có khoảng nhiệt độ sử dụng rộng và chịu được nhiệt độ cao. 2.3.2. Cột nhồi 2 mL/min 1 mL/min Dòng làm sạch septum Van chia dòng Cột tách Nhiệt độ bằng nhiệt độ ban đầu của lò Tiêm mẫu chia dòng Tiêm mẫu không chia dòng Tiêm mẫu vào côtj
  28. 28. 28 Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký Cột thường được làm bằng thép không rỉ, nicken, thủy tinh với đường kính khoảng từ 3 đến 6 mm và chiều dài khoảng từ 1 đến 5 m. Cột nhồi chứa các hạt chất mang rắn được phủ một lớp pha tĩnh lỏng hoặc bản thân hạt rắn là pha tĩnh. Chất mang rắn thường là diatomite đã được silan hóa để giảm liên kết hydro với các chất phân cực: - Si - O - Si - + (CH ) SiNHSi(CH ) - Si - O - Si - + NH OH OH ( CH ) SiO OSi(CH ) 3 3 3 3 3 3 3 33 Kích thước hạt đồng nhất sẽ làm giảm chiều cao cột và tăng độ phân giải. Cở hạt nhỏ sẽ làm giảm thời gian cân bằng hòa tan nhờ vậy làm cải thiện hiệu quả của cột. Tuy nhiên, nếu kích thước hạt càng nhỏ thì càng ít không gian trống giữa các hạt và áp suất để ép pha động qua cột phải càng cao. Kích thước hạt được biểu diễn theo micromet hoặc cở mesh, tức là cở lưới mà hạt có thể đi qua hoặc bị giữ lại trên sàng. Ví dụ các hạt cở 80/100 mesh đi qua được cở sàng 80 mesh (170µm) nhưng không đi qua được cở 100 mesh (150 µm). Yêu cầu của chất mang rắn là không tham gia vào sự tách và có khả năng giữ được pha tĩnh (không ít hơn 10 %). Một số loại chất mang rắn: Có hai điều quan trọng cần chú ý khi chọn một chất mang là: cấu trúc và đặc tính bề mặt. Cấu trúc góp phần vào hiệu quả của chất mang, trong khi các đặc trưng bề mặt chi phối sự tham gia của chất mang vào kết quả của việc tách. Các chất mang phải là các chất trơ về mặt hóa học với tất cả các loại mẫu. Nó nên có diện tích bề mặt lớn để pha lỏng có thể trải thành một lớp phim mỏng và cấu trúc bề mặt phải thích hợp để lưu giữ lớp phim mỏng đó. Tuy nhiên, diện tích bề mặt lớn không là điều đảm bảo cột hiệu quả. Hầu hết các chất mang trong sắc ký cột nhồi được tạo từ diatomite. Loại chất mang đầu tiên dùng trong sắc ký khí do hãng Johns Manville chế tạo có tên thương mại là Chromosorb. Sau đây là một số loại chất mang thông dụng. Chromosorb A dùng ở qui mô điều chế, có khả năng giữ tốt pha lỏng (tối đa đến 25%), có cấu trúc khó bị phá vở và có bề mặt khá trơ. Thường được sản xuất ở kích thước 10/20, 20/30 và 30/40 mesh. Sử dụng cho những cột dài, chênh lệch áp suất thấp. Chromosorb G dùng để tách các hợp chất phân cực. Nhờ có diện tích bề mặt thấp, độ cứng, tỉ trọng cao nên nó được sử dụng cho các trường hợp tẩm pha lỏng hàm lượng thấp. Tẩm 5% trên Chromosorb G tương ứng với tẩm 12 % trên Chromosorb W.
  29. 29. 29 Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký Chromosorb P được chế tạo từ gạch chịu lửa C-22 có màu hồng (nên có kí hiệu P-pink) và tương đối cứng. Bề mặt ít hấp thụ hơn so với các loại Chromosorb khác, được dùng cho những việc tách hydrocacbon. Chromosorb W được chế tạo từ Celite 545, màu trắng và dễ vỡ hơn so với loại G. Bề mặt tương đối không hấp thụ và được dùng để tách các hợp chất hữu cơ phân cực. Có hai vấn đề chung của các chất mang: Thứ nhất, tương tác bề mặt chất mang (hấp phụ hoặc xúc tác) chính là nguyên nhân gây ra những pic có đuôi hoặc biến dạng. Chính những nhóm -OH hay oxit trên bề mặt chất mang là nguyên nhân của những tương tác đó. Có thể che các nhóm này bằng một lượng nhỏ pha lỏng phân cực. Nhưng cách tốt nhất hiện nay là silan hóa với các thuốc thử DMCS (dimethyl dichorosilan) hoặc HMDS (hexamethyl disilazane). Thứ hai, kích thước hạt càng nhỏ thì số hạng A trong phương trình Van Deemter càng nhỏ, nhưng sự chệnh lệch áp suất trong cột sẽ tăng vượt khỏi giới hạn làm việc thực tế. Hiệu suất cột chỉ có thể cải thiện nếu dùng các hạt có kích thước như nhau. Tỉ lệ phần trăm pha lỏng Lượng chất lỏng cần phải đủ để bao bọc các hạt bằng một lớp mỏng đồng nhất. Pha lỏng quá nhiều sẽ đọng lại ở những chỗ trống giữa các hạt làm giảm hiệu suất cột. Trên chất mang Chromosrb khi tỉ lệ pha lỏng lớn hơn 30% hiệu quả của cột giảm đi rất nhiều. Trước đây người ta hay tẩm 15-30% chất lỏng, nhưng hiện nay có khuynh hướng chỉ tẩm 2-10%. Vì thời gian lưu tỉ lệ với lượng pha lỏng trong cột nên phép phân tích càng nhanh khi cột có lượng pha lỏng phủ lên càng nhỏ. Khi tải chất lỏng quá thấp sẽ xuất hiện những tâm hấp phụ trên chất mang. Muốn tránh điều này cần phải dùng những chất mang trơ. Độ bay hơi của mẫu thử cũng phải tính đến khi chọn lượng pha lỏng. Các chất khó bay hơi như steroit cần phải được phân tích trong những cột có tải thấp (khoảng 3% hay thấp hơn). Các chất rất dễ bay hơi như các hydrocacbon nhẹ thì cần có cột tải cao (20-30%) vì lượng chất lỏng càng nhiều thời gian các chất có trong pha lỏng càng lâu, sự phân bố càng tốt. Mật độ nhồi Mật độ nhồi có một sự ảnh hưởng rõ rệt đến sự lưu giữ trên pha tĩnh. Pha tĩnh được phủ trên một chất mang trên cơ sở phần trăm trọng lượng, trong khi vật liệu nhồi được đặt trong cột trên cơ sở thể tích. Nếu mật độ nhồi của chất mang tăng lên, khối lượng tổng của pha tĩnh trong cột tăng lên. Chuẩn bị pha tĩnh và nhồi cột:
  30. 30. 30 Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký Tẩm pha tĩnh lên chất mang có nhiều cách, một trong số đó là dùng máy cất quay chân không. Lấy một lượng pha tĩnh tính toán sẵn hòa tan vào trong một dung môi thích hợp trong một bình đáy tròn, cho tiếp chất mang rắn với lượng tính toán thích hợp vào. Lắp bình vào máy cất quay. Quay bình cho đến khi dung môi bay hết. Đun nóng bình bằng cách thủy hoặc bằng đèn hồng ngoại. Lấy đoạn ống thẳng có chiều dài và đường kính mong muốn, nút một đầu bằng bông thủy tinh, đầu kia lắp một cái phểu, đổ đầy chất mang đã tẩm pha lỏng vào phểu. Lắc cột bằng máy lắc hoặc đập nhẹ vào cột đến khi không thấy giảm thể tích chất mang trên phểu nữa thì cột đã nạp đầy. Nút đầu còn lại bằng bông thủy tinh và cuộn ống lại cho thích hợp với lò ổn nhiệt của máy GC. Luyện cột: Cột cần phải đặt ít nhất 2 giờ ở 25 o C trên nhiệt độ tối đa mà cột sẽ sử dụng nhưng không được quá giới hạn trên của nhiệt độ bay hơi của pha lỏng. Một luồng khí mang nhỏ (5-10 ml/ph) được cho qua cột. Đầu ra của cột hở không nối với detector để tránh làm bẩn nó. 2.3.3. Cột mao quản Đa số các phép phân tích trong sắc kí khí sử dụng các cột mao quản dài từ 15 đến 100 m và đường kính trong rất nhỏ từ 0.10 đến 0.53 mm. Các cột này được chế tạo từ thủy tinh oxit tinh khiết nấu chảy có mức độ liên kết ngang cao hơn nhiều so với thủy tinh thường nên bền và chịu được nhiệt độ cao đến 350o C. Lực căng cao của ống thủy tinh cho phép chế tạo các cột có thành mỏng và dễ uốn. Các cột mao quản mở có lớp phim mỏng tráng trên thành ống cung cấp độ phân giải cao hơn, thời gian phân tích ngắn hơn và độ nhạy cao hơn cột nhồi nhưng chúng có dung lượng thấp hơn cho các mẫu. Cột mao quản mở hẹp cung cấp độ phân giải cao hơn cột mao quản mở rộng hơn nhưng chúng đòi hỏi áp suất cao hơn để hoạt động và có dung lượng cho mẫu nhỏ hơn. Lớp phim mỏng lỏng pha tĩnh dày khoảng từ 0.1 đến 5 µm trên bề mặt bên trong như được minh họa trong hình 2.5. Nếu giảm độ dày của lớp phim này sẽ làm tăng độ phân giải, giảm thời gian lưu và giảm dung lượng cho mẫu. Một loại khác là các cột mao quản có các hạt rắn chất mang phủ một lớp pha tĩnh lỏng được gắn trên bề mặt bên trong của cột. Bởi vì diện tích bề mặt của loại này tăng lên, cột này có thể xử lý những mẫu lớn hơn cột phủ lớp phim mỏng trên thành cột. Loại cột này là trung gian giữa cột mao quản phủ phim mỏng trên thành và cột nhồi.
  31. 31. 31 Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký Hình 2.4: Cột mao quản được làm bằng polyamide và fused silica Hình 2.5: Minh họa cấu trúc bên trong của các cột nhồi và cột mao quản 2.3.4. Những yêu cầu về pha tĩnh lỏng Một pha tĩnh lỏng lý tưởng cho sắc ký khí lỏng cần thể hiện độ chọn lọc và khả năng hòa tan của các cấu tử được tách và có khoảng nhiệt độ làm việc rộng. Nó cũng phải bền hóa học và có áp suất hơi bão hòa thấp ở tại các nhiệt độ cao. Chất mang Pha lỏng Cột nhồi Cột mao quản
  32. 32. 32 Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký Nhiệt độ làm việc nhỏ nhất nên gần nhiệt độ phòng, ở đây chất lỏng pha tĩnh phải tồn tại ở dạng lỏng chứ không phải rắn. Khi chọn lựa pha tĩnh, một sự thỏa hiệp giữa lý thuyết và thực nghiệm phải được xem xét. Ví dụ theo phương trình Van Deemter thì hiệu quả tách của cột cao hơn nếu cột chứa pha tĩnh lỏng ít hơn so với cột như vậy chứa pha tĩnh lỏng nhiều hơn. Nhưng trong thực tế pha tĩnh lỏng phủ trên chất mang mỏng quá có thể tạo nên một sự che phủ không đầy đủ các vị trí hoạt động trên bề mặt chất mang dẫn đến sự kéo đuôi của pic, khi đó cần tăng phần trăm của pha tĩnh lỏng trên chất mang. Các phép tách trong sắc ký khí lỏng là kết quả của những tương tác pha tĩnh hòa tan chọn lọc và sự khác nhau của hơi bão hòa của các chất tan. Lực tương tác chính chịu trách nhiệm trong tương tác của chất hòa tan với pha tĩnh là phân bố, cảm ứng, định hướng và tương tác cho nhận. Tổng của chúng được đo lường bởi “độ phân cực” của pha tĩnh đối với chất tan. Trong sắc ký khí lỏng, khả năng chọn lọc của một cột chi phối khoảng trống giữa các pic và độ lớn cực đại của pic được tách. Sự khác nhau về độ chọn lọc là có ý nghĩa vì chúng cho phép việc tách các chất tan có cấu trúc gần giống nhau bởi một pha tĩnh chọn lọc. Các thông số sau đây ảnh hưởng đến độ chọn lọc: Bản chất của pha tĩnh Nồng độ của pha tĩnh Nhiệt độ cột Việc chọn lựa và xử lý sơ bộ chất mang rắn hoặc chất hấp phụ. Một vài loại pha tĩnh lỏng thông dụng được liệt kê trong bảng và việc chọn pha tĩnh lỏng cho một đối tượng mẫu được dựa trên qui tắc “các chất càng giống nhau thì càng tan tốt vào nhau”. Cột không phân cực là tốt nhất cho mẫu phân tích không phân cực. Các cột có độ phân cực trung bình thì tốt cho mẫu phân cực trung bình và phân cực mạnh thì tốt cho mẫu phân cực mạnh. Ví dụ để tách ancol ta phải chọn pha lỏng phân cực như cacbowax-20, ngược lại để tách hidrocacbon no mạch thẳng phải sử dụng các pha lỏng không phân cực. Khi cột dùng nhiều bị lão hóa thì pha tĩnh bị đốt bay mất nên các nhóm silan (Si-OH) bị lộ ra và các pic bị kéo dài đuôi tăng lên. Nếu trong cột có oxi ở nhiệt độ cao cũng dẫn đến sự thoái hóa cột và pic bị kéo đuôi. Để giảm khuynh hướng pha tĩnh bị mất ở nhiệt độ cao, người ta gắn chúng vào bề mặt pha tĩnh silica bằng các liên kết cộng hóa trị. Người ta chia các pha lỏng và các đối tượng cần tách ra nhiều nhóm theo tính phân cực của phân tử như sau:
  33. 33. 33 Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký Nhóm rất phân cực: H2O, glycol, glyxerin, poliphenol, axit dicacboxylic. Nhóm phân cực: ancol mạch thẳng, axit béo hữu cơ, phenol, amin bậc 1,2, hợp chất nitro và nitril có chứa hydro α. Nhóm phân cực trung bình: ete, ankanal, ankanon, este, amin bậc 3, hợp chất nitro và nitril không chứa hidro α. Nhóm ít phân cực: hidrocacbon thơm, anken, hidrocacbon đã bị halogen hóa một phần. Nhóm không phân cực: ankan, thioankanol, sunfua, ankan đã bị halogen hóa. Các loại pha tĩnh phổ biến nhất là Squalane, polysioxanes và polyethylene glycol. -Squalane CH3 CH3 CH3 CH3 HC-(CH2)3-CH-(CH2)3-CH-(CH2)4-CH-(CH2)3-CH-(CH2)3-CH CH3 CH3 CH3 CH3 -Polysioxanes: là các pha tĩnh được sử dụng rộng rải nhất cho các cột sắc ký khí mao quản cũng như cột nhồi. Bởi vì cấu trúc của chúng có thể được gắn thêm một số loại nhóm chức đa dạng nên chúng thể hiện tính phân cực trong một dải rộng. Các loại silicon này là dạng gôm nhớt nên có thể phủ tốt trên silica và cũng thích hợp lý tưởng cho cột sắc ký mao quản.
  34. 34. 34 Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký Polyethylene glycol Các pha tĩnh không chứa silicon được sử dụng rộng rải nhất là các polyethylene glycol. Chúng có sẵn trên thị trường với một khoảng rộng của trọng lượng phân tử như Carbowax 20M và Superox-4. Cấu trúc chung của một polyethylene glycol có thể được mô tả như sau: HO-CH2-CH2-(-O-CH2-CH2-)n-O-CH2-CH2-OH Loại pha tĩnh lỏng này có độ phân cực cao, nhưng cũng có một vài hạn chế. Ví dụ Carbowax 20M có nhiệt độ làm việc cực đại khá thấp 225o C và nhiệt độ làm việc tối thiểu là 60o C. Hơn nữa, những lượng vết của oxi và nước có những ảnh hưởng không tốt trên các pha tĩnh lỏng nhưng đặc biệt không tốt cho carbowax 20M, làm tăng nhanh quá trình lão hóa của cột.
  35. 35. 35 Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký 2.3.5. Chỉ số lưu Kovats Việc báo cáo các số liệu như thời gian lưu tuyệt đối tR là vô nghĩa bởi vì hầu như mỗi thông số sắc ký và bất kỳ dao động thực nghiệm liên quan đều tác động đến phép đo thời gian lưu giữ. Với việc sử dụng số liệu thời gian lưu giữ tương đối (α = t’R2/t’R1) đã có một vài cải thiện, nhưng việc thiếu một tiêu chuẩn thống nhất thích hợp cho một khoảng nhiệt độ rộng trên các pha tĩnh có độ phân cực khác nhau đã làm giảm những sự tiện ích của nó. Thể tích lưu tương đối cũng ít được sử dụng vì chúng phụ thuộc vào rất nhiều thông số như chiều dài cột tách, lượng pha tĩnh, lưu lượng dòng… Kovats và Ettre đã thống nhất đề nghị chọn dãy đồng đẳng n-ankan là chất chuẩn nhằm xác định thể tích lưu tương đối vì: Các n-ankan không có dị tố về nhóm chức nhằm tránh các hiệu ứng lưỡng cực-lưỡng cực, hiệu ứng cảm ứng giữa phân tử lưỡng cực –trung hòa. Giữa chúng và pha tĩnh tương tác với nhau chỉ theo lực khuếch tán Van Der Waals nên thể tích lưu của chúng đối với bất cứ pha tĩnh nào cũng không khác nhau nhiều hay có thể xem là không đổi. Trong sự tiếp cận của Kovat, chỉ số lưu I của một n-ankan được công nhận một giá trị bằng 100 lần số cacbon của nó. Ví dụ, các giá trị I của n-octan, n-decan, và n-dodecan lần lượt bằng 800, 1000 và 1200. Theo định nghĩa đó I có thể áp dụng trên bất kỳ cột nào, mao quản hở hoặc nhồi, với bất kỳ pha lỏng và độc lập với mỗi điều kiện sắc ký, bao gồm cả nhiệt độ cột. Đối với tất cả các hợp chất khác, các điều kiện sắc ký như pha tĩnh, nồng độ của nó, chất mang và nhiệt độ cột nhồi phải được chỉ rõ. Bởi vì các chỉ số lưu cũng là phương pháp thích hợp cho việc báo cáo các số liệu lưu giữ với các cột mao quản nên pha tĩnh, độ dày lớp phim và nhiệt độ cột cũng phải được chỉ định rõ cho những hợp chất khác n-ankan; ngược lại các giá trị I là vô nghĩa. Chỉ số lưu I của cấu tử khác được xác định bằng cách so sánh thời gian lưu của nó với với thời gian lưu của hai n-ankan, trong đó một cấu tử được rửa giải ra trước còn cấu tử kia được rửa giải ra sau chất nghiên cứu trong những điều kiện sắc kí cụ thể. Nói cách khác, chỉ số lưu của một chất phân tích ở tại nhiệt độ cột đẳng nhiệt có thể được tính toán từ phương trình sau: ' , ' 1, ' , ' , loglog )log(log 100100 ZRZR ZRxR x tt tt ZI Ở đây:
  36. 36. 36 Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký t’R,x là thời gian lưu được hiệu chỉnh của cấu tử đang xét. t’R,Z là thời gian lưu được hiệu chỉnh của n-ankan rửa giải trước chất nghiên cứu, t’R,Z +1 là thời gian lưu hiệu chỉnh của n-ankan rưả giải sau nó, Z là số cacbon của n-ankan có thời gian lưu giữ t’R,Z . Với những lần chạy sắc ký theo chương trình hóa nhiệt độ, các thời gian lưu hiệu chỉnh trong phương trình trên được thay thế bởi các nhiệt độ rửa giải thích hợp (K). Nếu sự khác biệt về số cacbon giữa hai n-ankan trên không phải là 1 mà là 2 hoặc lớn hơn thì phân số trong phương trình trên sẽ được nhân với 200 hoặc một bội số tương ứng của 100. Ví dụ: hãy tính chỉ số lưu Kovats của hợp chất X có thời gian lưu tR,x =15.7 phút Biết tR(n-octan) = 14.3 và tR,(n-nonan) = 18.5 phút và tR(metan) = 0.5 phút thu được trong cùng điều kiện sắc kí xác định. Ta có thời gian lưu hiệu chỉnh của các cấu tử: t’R,x =15.7 – 0.5 = 15.2 phút t’R(n-octan) = 14.3 – 0.5 = 13.8 phút t’R,(n-nonan) = 18.5 – 0.5 = 18.0 phút Áp dụng phương trình trên ta có: Ix = lg15.2 lg13.8 800 100( ) lg18.0 lg12.8 = 836 Trong trường hợp này ta nói cấu tử X có số nguyên tử cacbon biểu kiến là 8,36. Vì vậy ta có thể định nghĩa chỉ số Kovats như sau: chỉ số lưu Kovats bằng tích số của 100 với số nguyên tử cacbon biểu kiến. Chỉ số lưu làm chuẩn hóa các biến thiết bị trong sắc ký khí cho phép các số liệu lưu giữ được tạo trong những hệ thống sắc ký khác nhau có thể so sánh được. Ví dụ, isoamyl acetat với chỉ số lưu 1128 sẽ bị rửa giải giữa n-C11 và n-C12 dưới cùng điều kiện sắc ký. Những chỉ số lưu giữ cũng rất hữu ích trong việc so sánh trật tự rửa giải của một loạt các chất tan trên một cột cụ thể tại một nhiệt độ đã cho và trong việc so sánh hai hoặc nhiều cột. Mối liên hệ giữa chỉ số lưu và cấu trúc của các hợp chất: Giữa cấu tử cần xác định và pha tĩnh có các lực tương tác khác nhau: Tương tác lưỡng cực-lưỡng cực Lực liên kết hydro, khả năng tạo phức cho nhận
  37. 37. 37 Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký Lực Van Der Waals Thông thường các loại lực tương tác trên đều xuất hiện đồng thời, tùy theo cấu trúc mà loại lực nào sẽ trội hơn các loại lực khác. Dựa vào chỉ số lưu Kovats có thể nghiên cứu mối quan hệ giữa sự lưu giữ và cấu trúc hóa học của các cấu tử nghiên cứu cũng như pha tĩnh.  So sánh chỉ số lưu của hai hợp chất trong cùng một pha tĩnh Theo dõi chỉ số lưu của một loạt hợp chất có cùng số C nhưng khác nhóm chức để rút ra những gia số ứng với thành phần cấu trúc khác nhau. Ví dụ hai hợp chất hexylxiclopropan và 1-octan. Các chỉ số lưu của chúng ở 80o C trên pha tĩnh squalan là 913.0 và 782.7. Các hydrocacbon no mạch thẳng tương ứng là n-nonan (I80 = 900) và n-octan (I80 = 800). Như vậy các gia số ứng với các nhóm chức trên là +13 và -17.3. Dự đoán chỉ số lưu của hợp chất 5-hexenylxiclopropan là = 900 + 13 – 17.3 = 895.7 Giá trị thực nghiệm đo được của hợp chất này I80 của hợp chất này đúng bằng 895.7. Lí do của sự trùng hợp này là hai nhóm chức ở xa nhau nên không có sự tương tác qua lại.  So sánh chỉ số lưu của một hợp chất trên hai pha tĩnh khác nhau Để minh họa ta xét một loạt giá trị chỉ số lưu của các hợp chất có 6C như trong bảng sau: Cấu trúc Tên chất IS IDC200 IPPG ∆I CH2=CH-(CH2)3CH3 CH3-(CH2)4-CH2-Cl CH3-(CH2)4-CHO CH3-(CH2)3CH2-CO-CH3 O CH3-(CH2)CH2-OH Hexen-1 Xiclohexan 1-clohexan Benzene Hexanal Hexanon-2 Xiclohexanon Hexanol-2 584.5 674.8 829.1 651.0 741.5 726.0 831.1 798.5 591.2 672.3 851.6 692.3 790.2 781.2 893.9 891.3 610.5 699.2 922.6 767.9 899.0 891.0 1038.2 1103.8 26.0 24.4 93.5 116.9 157.5 165.0 207.1 305.3 IS = chỉ số lưu với cột Squalan (100m x 0.25 mm), T = 100o C
  38. 38. 38 Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký IDC200 = chỉ số lưu cột DC 200 (100m x 0.25 mm) , T = 100o C IPPG = chỉ số lưu với cột Polypropylenglycol (100mx0.25 mm), T = 100o C ∆I = IPPG - IS Trong ba pha tĩnh sử dụng ở đây squalan có tính không phân cực; popropylen có tính phân cực mạnh; còn dầu silicon có tính phân cực trung bình. Theo định nghĩa của Kovats thì n-hexan có chỉ số lưu là 600. Các giá trị trong bảng có thể được giải thích như sau: n-hexanol có I là lớn nhất vì chúng có tương tác lưỡng cực-lưỡng cực đặc biệt mạnh với sự tham gia cầu nối hydro giữa các nhóm hydroxyl với nguyên tử oxi của ete của polypropylenglycol. Các amin bậc một và bậc hai tương ứng còn có tương tác mạnh hơn nữa. Hexen-1 và xiclohexan có các giá trị ∆I nhỏ nhất. Các olefin có tương tác mạnh hơn do có chứa các điên tử pi cho tương tác lưỡng cực cảm ứng. Giá trị ∆I của benzene lớn hơn hẳn so với của 1- hexen do có cấu trúc hệ pi liên hợp. Phân tử 1-clohexan có chứa lưỡng cực C-Cl nên phân tử này có độ phân cực mạnh tương đương với độ phân cực của 3 liên kết đôi gộp lại. Cả ba hợp chất chứa nhóm cacbonyl đều cho các giá trị ∆I tương đương nhau. Tuy nhiên xiclohexan lớn hơn rõ rệt so với hexanon-2 do cấu trúc mạch vòng đóng một vai trò đáng kể. Qua ví dụ trên ta thấy có một mối tương quan chặt chẽ giữa cấu trúc hóa học của các chất với các chỉ số lưu của chúng. 2.3.5. Sự phân loại các pha tĩnh của Mc Reynolds. 2.3.5.1 Cách tiếp cận của Mc Reynolds Hệ thống được sử dụng rộng rải nhất trong phân loại các pha tĩnh là hệ thống Mc Reynolds. Mc Reynolds đã chọn 10 chất hòa tan thăm dò có những chức khác nhau, mỗi chức được định rõ để đo một tương tác cụ thể với một pha lỏng. Ông đo các giá trị I của chúng trên khoảng 200 pha khác nhau, bao gồm Squalane, được phục vụ như một pha lỏng tham khảo dưới cùng một điều kiện sắc ký. Mc Renolds đã tính toán cho mỗi chất giá trị ΔI: ΔI = I liquiphase- I squalane Khi sự khác nhau trong chỉ số lưu cho một chất dò trên một pha lỏng đã cho và squalane tăng lên, mức độ tương tác cụ thể liên quan đến chất dò tăng lên. 2.3.5.2. Bảng các chất dò được sử dụng trong sự phân loại các pha tĩnh lỏng
  39. 39. 39 Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký Trong bảng này, 5 hằng số đầu tiên của McRenolds thường được xuất hiện và được biểu diễn bởi các ký hiệu X’, Y’, Z’, U’ và S’. Một sự tiếp cận tương tự được thực hiện trước đó bởi Rohrscheiner với 5 chất hòa tan. Mỗi chất dò được ấn định giá trị zero với squalane như là pha lỏng tham khảo. Ký hiệu Chất dò của McReynolds Chất dò của Rohrschneider Tương tác được đo X’ Y’ Z’ U’ S’ H’ J’ K’ L’ M’ Benzen n-Butanol 2-Pentanone Nitropropane Pyridine 2-methyl 2-metanol Iodobutan 2-octyne 1,4 dioxane Cis-hydrindane Benzen Etanol 2-butanone Nitrometan Pyridine - - - - - Mật độ electron cho các hydrocacbon thơm và olefin. Năng lực cho nhận proton (ancohol,axit, nitrils). Tương tác nhận electron (ketone, ete, andehit, este). Các tương tác lưỡng cực Tương tác nhận electron mạnh Tương tác ancol được thế tương tự như n-butanol. Các tương tác ankan phân cực Tương tác hydrocacbon không bão hòa giống như benzene Tương tác nhận proton Tương tác phân tán Ứng dụng: Một trong những ứng dụng quan trọng nhất của các hằng số McRenolds là để nhận biết được những pha tĩnh giống nhau hoặc tương tự nhau nhằm tránh được việc sử dụng trùng lắp. Một ứng dụng khác là sử dụng để lựa chọn các cột tách thích hợp. Nói chung giá trị hằng số McRenolds càng lớn thì pha tĩnh có khả năng giữ được cấu tử cần tách lâu hơn. Ví dụ pha tĩnh cabowax 20M tách ancol thích hợp hơn OV-17 hoặc OV-101 (giá trị tương ứng của các pha là 536, 158, 57). Để tách các hợp chất mang nhóm chức khác nhau thí dụ ancol khỏi xeton, este… thì giá trị X’, Y’, Z’ … cần phải khác nhau xa. Dựa vào hằng số McRenolds ta có thể dự đoán được thứ tự rủa giải của các cấu tử. Các hằng số McRenolds của các pha tĩnh phổ biến cho cột nhồi GC được liệt trong bảng sau:
  40. 40. 40 Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký Bảng các hằng số McRenolds và các pha tĩnh được sử dụng thông thường Pha T(oC) min/max Bản chất hóa học X’ Y’ Z’ U’ Z’ Các pha có cấu trúc tương tự Squalane DC200 DC700 SE-30 SE-54 OV-1 OV-3 OV-7 OV-11 OV-17 OV-22 OV-25 OV-61 OV-73 OV-101 OV-105 OV-202 OV-210 OV-215 OV-225 OV-275 OV-330 OV-351 OV-1701 SP 2100 SP2250 SP2300 SP2310 SP2330 SP2340 SP2401 20/100 0/200 5/250 50/300 50/300 100/350 0/350 0/350 0/350 0/375 0/350 0/350 0/350 0/325 0/350 0/275 0/275 0/275 0/275 0/265 25/275 0/250 50/270 0/250 0/350 0/375 20/275 25/275 25/275 25/275 0/275 Paraphin Dimetyl silicon Phenylmetyl silicon Dimetyl 5%phenyl 1% vinyl Dimetyl 10%phenyl-phenyl metyl dimetyl 20%phenyl-phenyl metyl dimetyl 35%phenyl-phenyl metyl dimetyl 50% phenyl 50% metyl 65%phenyl-phenyl metyl dimetyl 75%phenyl-phenyl metyl dimetyl 33%phenyl-diphenyl dimetyl 5.5%phenyl-diphenyl dimetyl Dimetyl (lỏng) Cyanopropylmetyl-dimetyl Trifluoropropyl-metyl(lỏng) Trifluoropropyl-metyl(lỏng) Trifluoropropyl-metyl(gôm) Cyanopropylmetyl- phenylmetyl Dicyanoallyl Phenylsilicon-cabowax copolimer Cabowax nitroterephtalic acid polimer 14%cyanopropylphenyl Metyl 50%phenyl 50%cyanopropyl 55%cyanopropyl 90%cyanopropyl 100%cyanopropyl trìluoropropyl 0 16 107 15 33 16 44 69 102 119 160 178 101 40 17 36 146 146 149 225 629 222 335 67 17 119 316 440 490 529 146 0 57 149 53 72 55 86 113 142 158 188 204 143 86 57 108 238 238 240 369 872 391 552 170 57 156 495 637 725 757 238 0 45 153 44 66 44 81 111 145 162 191 208 142 76 45 95 358 358 363 338 763 273 382 153 45 162 446 605 630 659 358 0 66 228 64 99 65 124 171 219 243 283 305 213 114 67 139 468 468 478 492 1106 417 583 228 67 243 637 840 913 942 468 0 43 190 41 67 42 88 128 178 202 253 280 174 85 43 86 310 310 315 386 849 368 540 171 43 202 530 670 778 800 310 SP-2100,SE- 30,OV-101,OV-1 SP-2100, OV-101, OV-1 SP-2100 DC-710 SP2250 SP-2100,SE- 30,OV-1 SP-2401 SP2300 SP2340 SP-1000 SE-30,OV- 101,OV-1 OV-17 OV-225 OV210 2.4. Detector
  41. 41. 41 Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký 2.4.1. Detector đo độ dẫn nhiệt (Thermal conductivity detector) 2.4.1.1. Giới thiệu Trước đây, detector đo độ dẫn nhiệt là loại thông dụng nhất trong sắc kí khí bởi vì nó đơn giản và đáp ứng hầu hết các chất phân tích. Không may, độ dẫn nhiệt không đủ nhạy để dò tìm những lượng nhỏ của chất phân tích tách từ cột mao quản mở có đường kính cột nhỏ hơn 0.53 mm. Các detector đo độ dẫn nhiệt vẫn còn sử dụng cho cột mao quản đường kính 0.53 mm và cho các cột nhồi. Bảng Độ dẫn nhiệt tại 273 K và 1 atm Khí Độ dẫn nhiệt J/(K.m.s) Phân tử lượng H2 He NH3 N2 C2H4 O2 Ar C3H8 CO2 Cl2 0.170 0.141 0.0215 0.0243 0.0170 0.0246 0.0162 0.0151 0.0144 0.0076 2 4 17 28 28 32 40 44 44 71 2.4.1.2. Nguyên tắc Độ dẫn nhiệt đo khả năng của một chất vận chuyển nhiệt từ một vùng nóng sang vùng lạnh (bảng). Nhiệt mất đi khi các phân tử khí đập vào sợi dây đốt nóng rồi bật ra với một động năng lớn hơn. Số va chạm phân tử với sợi đốt trong một đơn vị thời gian càng lớn thì tốc độ mất nhiệt càng lớn. Sự khác nhau về tính dẫn nhiệt của các khí là do tính linh động, nghĩa là tốc độ khí khuếch tán tới và đi khỏi sợi đốt. Tốc độ của phân tử lại là hàm của trọng lượng phân tử, do đó phân tử càng nhỏ tốc độ chuyển động càng cao, dẫn nhiệt càng tốt. Heli là khí mang thông dụng được sử dụng cho detector đo độ dẫn nhiệt. Nó cũng là khí có độ dẫn nhiệt cao thứ hai (sau H2), nên bất ký chất phân tích nào trộn với dòng khí He cũng làm giảm độ dẫn nhiệt của dòng khí. Trong detector (hình 5), chất rửa giải từ cột sắc kí chảy qua sợi dây tóc nung nóng Tungsten-Rhenium. Khi chất phân tích xuất hiện từ cột, độ dẫn nhiệt của dòng khí bị giảm xuống, sợi dây tóc trở nên nóng hơn nên điện trở của nó tăng lên và thế áp vào sợi dây này thay đổi. Detector sẽ đo sự thay đổi thế này theo cầu Wheatstone như sau
  42. 42. 42 Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký Hình 2.6: Detector đo độ dẫn nhiệt - Cầu nối Wheatstone Một dòng nhỏ khí mang để làm khí so sánh đi qua R1 và R2. Khí mang và mẫu sau khi qua cột được dẫn qua S1 và S2. Khi cả 4 sợi đốt S1, S2, R1, R2 ở cùng một nhiệt độ, chúng sẽ có cùng giá trị điện trở thì cầu cân bằng, tín hiệu ra bằng không. Nếu điện trở S1 và S2 thay đổi do khí mang cuốn theo cùng với các cấu tử chất phân tích thì cầu mất cân bằng, tín hiệu ra xuất hiện. Độ nhạy của detector đo độ dẫn nhiệt tỉ lệ nghịch với tốc độ dòng khí. Nó nhạy hơn với tốc độ dòng thấp hơn. Độ nhạy tăng theo khi sự khác nhau về nhiệt độ giữa sợi dây đốt với vùng khối xung quanh tăng lên. Độ nhạy cũng tăng theo bình phương của cường độ dòng của dây đốt. 2.4.2. Detector ion hóa ngọn lửa 2.4.2.1 Nguyên tắc hoạt động Dựa trên sự biến đổi độ dẫn điện của ngọn lửa được tạo bởi hỗn hợp khí H2 và O2 trong không khí (nguồn ion hóa) và được đặt trong một điện trường (buồng điện cực). Khí mang sau khi rời khỏi cột đi qua nguồn ion hóa vào buồng điện cực. Ở đó chúng bị bắn phá bởi các chùm hạt electron tạo thành các hạt tích điện (ion dương, ion âm, electron). Kết quả tạo thành dòng điện giữa hai điện cực. Dòng điện này đi qua điện trở đo R. Sự rơi thế Eo qua điện trở R này sẽ được khuếch đại rồi đưa ra máy ghi. Nếu chỉ có khí mang đi qua 2 bản của điện cực, dòng điện sinh ra gọi là “dòng nền”, để giảm thiểu dòng này người ta dùng một dòng điện bổ chính. Khi khí mang đem theo các phân tử mẫu, các phân tử này bị ion hóa và dòng điện qua điện cực tăng lên. Các tín hiệu được ghi lại dưới dạng các pic.
  43. 43. 43 Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký 2.4.2.2. Úng dụng: Độ nhạy của detector FID cao hơn rất nhiều so với độ nhạy của detector TCD khoảng 100 - 1000 lần. Tuy nhiên nó chỉ sử dụng thích hợp nhất với các hợp chất hữu cơ chứa cacbon. Có một số hợp chất không thể phát hiện bằng detector này như: CO, CO2, axit formic, formaldehit, NOx, NH3, hợp chất halogen, CS2, H2S, H2O và bản thân các khí cần thiết dùng để hoạt động detector này như H2, N2, He. 2.4.3. Detector cộng kết điện tử (ECD) 2.4.3.1. Nguyên tắc hoạt động Bộ phận chính của detector ECD là buồng ion hóa, nơi diễn ra các quá trình ion hóa, bắt giữ electron và tái liên hợp. Quá trình ion hóa: từ một nguồn tia phóng xạ 63 Ni được lắp sẵn trong detector, phát ra một chùm tia β với tốc độ khoảng 108 , 109 hạt /giây. Các hạt này sẽ ion hóa phân tử khí mang (N2 hoặc 5% metan trong Ar) tạo ra các ion dương của phân tử khí mang và điện tử tự do sơ cấp. So với các điện tử của chùm tia β, các điện tử tự do này chậm hơn. Chúng được gia tốc nhờ một điện trường và chuyển dịch về phía anot. Tại đây chúng bị lấy mất điện tích và qua đó tạo ra dòng nền của detector. Quá trình cộng kết điện tử diễn ra khi các phân tử các chất phân tích với ái lực electron cao đi vào detector. Chúng bắt một số electron dẫn đến detector thay đổi hiệu thế giữa anot và catot để duy trì dòng nền không đổi. Sự thay đổi này được ghi nhận dưới dạng pic sắc kí trên giấy ghi hoặc bằng computer. 2.4.3.2. Ứng dụng Detector loại này đặc biệt rất nhạy với những phân tử hợp chất có khả năng cộng kết với các điện tử tự do trong pha khí như các phân tử chứa halogen, cacbonyl liên hợp, nitril, hợp chất nitro, và hợp chất cơ kim. Nó tương đối kém nhạy với các phân tử hợp chất hydrocacbon, các rượu và xeton. Như vậy độ nhạy của ECD phụ thuộc vào: Độ lớn của dòng nền. Khả năng ái điện tử của chất cần phân tích. Bản chất của khí mang và hiệu thế đặt vào 2 bản điện cực. 2.4.4. Detector khối phổ 2.4.4.1. Giới thiệu
  44. 44. 44 Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký Máy khối phổ là một detector vạn năng cho phân tích định tính và định lượng các chất hữu cơ cả sắc ký khí lẫn sắc ký lỏng. Trong phương pháp khối phổ, các phân tử khí bị ion hóa (thường tạo cation) được tăng tốc trong một trường điện từ và sau đó được tách theo khối lượng của nó. Quá trình ion hóa thường cung cấp đủ năng lượng đến phân tử để phá vở nó thành những mảnh khác nhau. Một phổ khối là một biểu đồ cho thấy lượng tương đối của mỗi mảnh vở tạo ra từ detector khối phổ. Trong sắc ký khí mỗi pic của sắc kí đồ tương ứng với một chất phân tích đã được tách ra được nhận diện bởi một phổ khối. Hình là một phổ khối của hợp chất được nhận diện khi so sánh với thư viện phổ của những hợp chất đã biết. Trục hoành của phổ khối là m/z, khối lượng của ion chia cho điện tích của ion. Phần lớn các ion đều mang điện tích +1 nên m/z thường chính là khối lượng của ion (đ.v.C). Trục tung chỉ thành phần % tương đối của các ion so với ion có lượng lớn nhất được qui ước 100%. Trong phổ khối có một pic quan trọng của ion phân tử không bị phá vở thành các mảnh. Dựa vào tỉ lệ của các đồng vị của một nguyên tố trong tự nhiên, ta có thể nhận thấy tỉ lệ này xuất hiện trong phổ khối qua tỉ lệ của các ion phân tử của các đồng vị. Ví dụ ta có thể hiểu điều này trong phổ khối của 1-brombutan. Vì tỉ lệ của nguyên tố brom trong tự nhiên là 50.52% 79 Br và 49.48% 81 Br, pic tại m/z=136 của ion phân tử C4H9 79 Br có cường độ lớn hơn một chút so với pic của ion phân tử tại m/z=138 của phân tử C4H9 81 Br. Hình 2.7: Sắc kí đồ và phổ MS tương ứng của 1-Butanol và 1-Bromobutane. 2.4.4.2.Máy khối phổ nam châm hình quạt Nguyên tắc hoạt động với nguồn ion hóa bằng chùm electron
  45. 45. 45 Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký Các phân tử khí đi vào nguồn ion hóa bằng va chạm electron và bị bắn phá bởi các electron có năng lượng động học khoảng 70 eV. Năng lượng này đủ lớn để ion hóa các phân tử (M + e →M+ + 2e) và phá vỡ chúng thành những mảnh vỡ nhỏ hơn. Một thế hiệu dương nhỏ ở đĩa đẩy (repeller plate) đẩy những ion hướng về ống phân tích và một thế nhỏ ở các đĩa hội tụ ion (ion focus plates) gia tốc ion giúp các ion có vận tốc cao bị tống khỏi phần đáy của bộ phận này và đi vào ống phân tích. Ống phân tích (Analyser tube) được duy trì ở áp suất chân không cao (khoảng 10-5 Pa) để các ion chuyển động qua ống không bị lệch hướng bởi những va chạm với các phân tử khí pha động. Các cation di chuyển qua ống phân tích chịu tác động của từ trường đặt vuông góc với hướng di chuyển của chúng. Trường này sẽ hướng các cation về detector đặt ở cuối ống phân tích. Một khe ở detector chỉ cho những ion trong một khoảng giá trị khối lượng nhỏ xác định tiếp cận detector. Các phân tử có khối lượng không phù hợp va phải các thành ống hoặc bị loại bỏ bởi khe thoát ion nên không vươn tới được detector. Tại bộ phận thu ion (ion collector), mỗi cation đến bị trung hòa bởi một electron. Dòng điện đòi hỏi để trung hòa chùm ion tỉ lệ với số lượng các ion đến bộ phận thu ion này. Phổ khối là một đồ thị cho thấy dòng điện như là một hàm của số khối được chọn bởi từ trường. Phương pháp ion hóa bởi tương tác electron (electron impact ionization) cho phổ khối có nhiều mảnh vở. Ion phân tử có thể có hàm lượng thấp thậm chí bị biến mất. Nếu phân tử lớn thì việc có quá nhiều mảnh vở sẽ làm cho việc giải thích phổ khối của nó gặp nhiều khó khăn. Trong trường hợp này các chương trình máy tính có thể được sử dụng để làm khớp phổ của chất chưa biết này với một phổ khối đã biết trong thư viện phổ lưu trong máy tính. Nguyên tắc hoạt động với nguồn ion hóa hóa học: Một kỹ thuật tinh tế sản sinh ra ít mảnh vở hơn là sự ion hóa hóa học (chemical ionization). Trong trường hợp này, nguồn ion hóa được đổ đầy metan ở áp suất khoảng 100 Pa. Các electron được cung cấp đủ năng lượng để chuyển CH4 đến những sản phẩm hoạt động khác: CH4 + e → CH4 + + 2e CH4 + +CH4 → CH5 + + CH3 CH5 + là chất nhường photon khi tương tác với chất phân tích cho MH+ , thường là ion có hàm lượng lớn nhất trong phổ khối ion hóa hóa học metan (methane chemical ionization mass spectrum).
  46. 46. 46 Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký CH5 + + M → CH4 + MH+ 2.4.4.3.Máy khối phổ tứ cực Máy khối phổ nam châm hình quạt thường ít được chọn để ghép nối với sắc kí bởi vì từ trường không thể thay đổi đủ nhanh để ghi phổ của những dải sắc kí hẹp. Loại được sử dụng phổ biến hiện nay để kết nối với sắc kí là máy khối phổ tứ cực (quadrupole mass spectrometer). Khi đó mỗi chất hòa tan trong cột sắc kí được tách được thể hiện dưới dạng pic. Chất đó được dẫn đến buồng ion hóa tương tác electron có áp suất chân không, tại đây các phân tử chất phân tích bị các electron được gia tốc bắn phá tạo các ion mảnh vở. Các ion này lại tiếp tục được gia tốc bởi một thế khoảng 5-15 V trước khi đi vào bộ tách theo khối lượng tứ cực (quadupole mass seperator). Bộ tách gồm 4 thanh kim loại song song với nhau, trong đó một cặp sẽ được áp vào một thế không đổi và cặp kia một thế hiệu dao động tần số radio. Từ trường được tạo ra làm lệch các hành trình phức tạp khi chúng di chuyển từ buồng ion hóa hướng đến detector và chỉ các ion nào có tỉ số khối lượng với điện tích (m/z) đã chọn trước mới tiếp cận với detector. Các ion khác va đập vào các thanh kim loại và bị mất trước khi vươn đến detector. Bằng việc thay đổi nhanh chóng thế áp vào, các ion có khối lượng khác nhau được chọn lọc để được tiếp cận với detector. Các bộ tách khối phổ tứ cực được quét đủ nhanh để ghi hai đến tám phổ trong một giây với khoảng 800 đơn vị khối. 2.5. Phát triển một phương pháp phân tích bằng sắc ký khí Do có nhiều thông số ảnh hưởng đến quá trình sắc ký nên có thể làm bối rối cho những người mới bắt đầu làm quen với việc chọn một thủ tục cho việc phân tích sắc ký một đối tượng cụ thể nào đó. Nói chung, có nhiều giải pháp khác nhau có thể thỏa mãn. Trong phần này sẽ thảo luận cách để chọn một phương pháp để sử dụng. Trật tự cần xem xét theo thứ tự sau: mục tiêu phân tích, chuẩn bị mẫu, detector, cột và bơm mẫu. 2.5.1. Mục tiêu của phép phân tích Mục tiêu của phép phân tích là phân tích định tính hay định lượng? Có cần phải thực hiện một phép tách phân giải cao một cấu tử hoặc chỉ cần một phép tách có độ phân giải đủ tốt cho một phần nào đó thôi trong sắc ký đồ? Có cần hy sinh độ phân giải để rút ngắn thời gian phân tích? Cần phân tích định lượng chỉ một cấu tử hoặc nhiều cấu tử trong mẫu và có cần độ chính xác cao không? Chất phân tích hiện diện trong mẫu ở nồng độ thích hợp hoặc cần có những kỹ thuật đặc biệt (cô mẫu và một detector rất nhạy) cho phân tích siêu vết.

×