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  • 1. EVALUACION DE LOS REGULADORES DE CRECIMIENTO ANA/BAP/KIN EN EL ESTABLECIMIENTO IN VITRO DE LA PLANTA Ortiga (Urtica urens L.) MEDIANTE ORGANOGENESIS DIRECTA A PARTIR DE SEGMENTOS NODALES. Resumen En la presente investigación se va a describir el proceso de estandarización de la técnica del cultivo in vitro de la planta ortiga (Urtica urens L.) Se utilizará la técnica de organogénesis directa, es decir, los órganos se originan directamente desde el explante. La técnica del cultivo in vitro en la ortiga hasta hoy no se ha realizado. Se llevará la planta al sistema in vitro, para ello se tendrán en cuenta cuatro fases. La primera fase consistió en establecer las plantas madres, dichas plantas de obtuvieron en fincas y en viveros; una vez establecida la planta madre, se extrajeron los segmentos nodales y se les realizó un proceso desinfección en donde se probaron diferentes concentraciones de NaClO para determinar cuál es la cantidad a la que el explante responde mejor en porcentajes de contaminación y necrosis. En esta fase se hicieron seis repeticiones por cada tratamiento. Una vez desinfectado el material se continuará con la inducción, en esta fase se realizará la composición del medio de cultivo MS, en el cual se evaluarán las concentraciones necesarias de reguladores de crecimiento BAP y KIN, aquí también se deben hacer al menos tres pruebas por cada concentración. Luego se procederá a la fase siguiente: La multiplicación. En esta fase se probaran distintas concentraciones del regulador de crecimiento ANA (Ácido Naftilacético) con el que mejor tenga resultado en la fase de inducción, por último se tomara le mejor resultado obtenido de la fase de inducción para determinar que concentraciones son más aptas para la multiplicación de la Ortiga. Por último se procederá a la fase de aclimatización, en esta etapa las plántulas obtenidas se adaptaran a vivir en condiciones naturales. Planteamiento del problema: La ortiga (Urtica Urens L.) es una planta que posee diversas propiedades medicinales y que hoy en día están siendo utilizadas en diversos productos de la industria farmacológica y cosmetológica de Colombia, para hacer estos productos se importa un principio activo desde Europa donde se cultiva esta planta comercialmente, mientras que en Colombia no se hace y más bien es tratada a la ortiga como maleza. El proceso de cultivo in vitro de esta planta va a permitir que en un futuro probablemente se cultive comercialmente en Colombia, ya que tiene algunas ventajas sobre la siembra normal, como la obtención de semillas en cualquier época del año, muchas plántulas en poco espacio y plantas libres de algunas bacterias y hongos,, entre otros patógenos.
  • 2. Pregunta de investigación: ¿Cuál es la relación entre las diferentes concentraciones de los reguladores de crecimiento ANA, BAP Y KIN en el establecimiento in vitro de la planta Ortiga (Urtica urens L.) mediante organogénesis directa a partir de segmentos nodales? Descripción del problema La ortiga es una planta poco aceptada, es portadora de propiedades medicinales y nutritivas y hasta efectos secundarios para la salud de las personas, gracias a que tiene unos pequeños pelos urticantes en sus hojas y esto la lleva a provocar la urticaria. No se ha llevado a cabo un cultivo in vitro de ortiga, por ende no se han definido las cantidades adecuadas de reguladores de crecimiento adecuadas para hacerlo. Podría ser de gran ayuda para una amplia variedad de investigaciones futuras en campos medicinales y vegetales que se definiera ahora estandarización de la técnica del cultivo in vitro de la planta, ya, que entre otros beneficios, el cultivo in vitro permite que las plantas crezcan con menos cantidad de patógenos y se puede mantener gran cantidad de material vegetal en un pequeño espacio. Para iniciar el método de siembra de la Ortiga menor (Urtica urens L.) esta necesita suelos muy fertilizados sobre todo en nitrógeno y fosfatos, y una temperatura entre los 15 y los 25°C. Aunque se puede producir muy fácilmente casi en cualquier lugar. Por otra parte el cultivo in vitro en la ortiga mediante segmentos nodales nunca se ha registrado en el sistema, este es uno de los aspectos que lleva a realizar este proyecto, Por eso gracias al cultivo in vitro se dejaría estandarizado el método de cultivo para esta planta. Antecedentes ATECEDENTES: DIVISION BOTANICA DE LA ORTIGA (Urtica urens L.) Reino División Clase Orden Familia Genero Plantae Magnoliophyta Magnoliopsida Rosales Urticaceae Urtica La ortiga menor (Urtica urens L.) se puede identificar por sus hojas opuestas y grandes, con pelos urticantes los cuales pueden causar gran irritación en la piel; con flores color lila, esta planta florece de otoño a primavera y fructifica en primavera. La ortiga también conocida como ortiga menor o yerba del ciego, es una planta de la familia urticácea. Esta planta crece al lado de la ortiga mayor, por eso se
  • 3. puede encontrar en climas templados y tropicales, Crece en zonas rurales nitrificadas y arcillosas. Esta planta a diferencia de la ortiga mayor sus propiedades medicinales son más pocas, pero produce una mayor irritación en las personas y animales y sus efectos son más duraderos. (Plantas vasculares. Medellín, 4 de octubre de 2012 inbuy.fcien.edu.uy/fichas_de.../Urtica_urens_i.pdf) La ortiga contiene abundante clorofila, y también taninos, ácidos orgánicos, vitamina C, provitamina A y sales minerales. Los pelillos urticantes contienen ácido fórmico, resina, acetilcolina, histamina y otras sustancias. (Plantas medicinales. Medellin 6 octubre de 2012 http://www.natureduca.com/med_espec_ortigamayor.php) Tiene numerosas aplicaciones medicinales e industriales. Es un excelente hemostático, y por tanto un buen remedio contra las hemorragias. Es un buen diurético, especialmente útil en la eliminación del ácido úrico; por este motivo es igualmente hipotensor y antirreumático. Se emplea en catarros gastrointestinales, bronquiales y renales; adecuado como antidiarreico y contra el estreñimiento. Por su acción hipoglucemiante es un anti anémico coadyuvante en el tratamiento de la diabetes, https://www.google.com.co/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&source=images&c d=&cad=rja&docid=SuVdXflq63AEoM&tbnid=pH7wSMt410dJCM:&ved= 0CAUQjRw&url=http%3A%2F%2Fwww.fotolog.com%2Fclaroenelbosque %2F21368893%2F&ei=Bd9Ur6dA8XJkAfHm4DwAw&psig=AFQjCNGBHLActrpczGfyrOaYKWr yRypXLA&ust=1384016242294977 estimulante de la actividad de las glándulas endocrinas y la producción de glóbulos rojos, así como un favorecedor de los intercambios metabólicos. Ejerce un buen drenaje hepático. Actúa también como depurativa y fortificante. En aplicaciones externas es cicatrizante, útil en heridas, úlceras, etc., y también como revitalizador del cuero Cabelludo. Las hojas tiernas se pueden consumir como verdura en primavera. Las sumidades también se utilizan en procesos industriales para obtener la clorofila, que es la sustancia más abundante de esta planta. Ésta es empleada como aditivo en productos cosméticos, jabones, etc. ¿Hay evidencia científica en el campo de la medicina con la ortiga? La evidencia es mucho mejor para la raíz de ortiga y el agrandamiento de próstata que para la hoja de ortiga y las alergias.
  • 4. Raíz de Ortiga El uso de la raíz de ortiga para tratar la hiperplasia prostática benigna no se ha estudiado tan bien como la serenoa, pero la evidencia es al menos moderadamente convincente. La raíz de ortiga contiene numerosos químicos biológicamente activos que podrían influir en la próstata indirectamente interactuando con las hormonas sexuales o directamente alterando las propiedades de las células de la próstata. Un estudio doble ciego controlado por placebo de 50 hombres con seguimiento de 9 semanas encontró un incremento significativo en el volumen de orina y en la tasa de flujo de orina en el grupo de ortiga en comparación al grupo de placebo. 7 En otro estudio doble ciego y controlado por placebo, el tratamiento de 67 hombres con ortiga produjo un 14% de mejoría en el flujo de orina y un 53% de disminución en la orina residual. 8 Finalmente, un estudio doble ciego y controlado por placebo de 40 hombres encontró una disminución significativa en la frecuencia de orinar después de 6 meses. Hoja de Ortiga Un estudio preliminar doble ciego y controlado por placebo que siguió a 69 individuos sugiere que la hoja de ortiga seca congelada podría al menos mejorar ligeramente los síntomas de alergia Un pequeño estudio doble ciego sugiere que la aplicación directa de la hoja de ortiga a una articulación dolorosa podría mejorar los síntomas. (Beth Israel Deaconess Medical Center. Ortiga. Recuperado el 4 de octubre de 2012, de http://www.bidmc.org/YourHealth/ConditionsAZ.aspx?ChunkID=125088) La ortiga también se abre en el campo de la gastronomía, a pesar de ser una “hierba mala”. Es mejor recolectar los brotes tiernos y las hojas, y desechar los tallos más duros. Las propiedades urticantes desaparecen con la cocción o 12 horas después de recolectada. La forma más sencilla de prepararlas en el campo es, después de lavarlas con unos guantes, hervirlas entre 10 y 15 minutos. Luego aliñarlas con aceite y sal si se dispone de ello. También se puede prepararlas en tortilla, sopas, puré o cualquier otro plato que salga de vuestra imaginación. M. Pahlow recomienda las hojas de ortiga junto con diente de León y celidonea menor como una buena ensalada de primavera. Las virtudes de la ortiga como alimento superan probablemente a las de las espinacas, ya que, al contrario que estas, la ortiga no contiene oxalato sódico. Sin embargo sí aporta otros beneficiosos elementos como el hierro o el silicio.
  • 5. Además, contiene una importante cantidad de proteínas: de 6 a 8gr por cada 100gr de planta fresca y de 30 a 35gr si está seca; y vitaminas A, C y K. En la obra "Secretos y Virtudes de las Plantas Medicinales" de Selecciones del Reader's Digest se nos dice que no consumamos las semillas. También Alan Sauri, en su libro "La Vida Autosuficiente" de Ed. Blume, advierte "Desconfiad de las semillas: 10gr por día suprimen totalmente la orina". Es un dato curioso, sobre todo teniendo en cuenta que una de las principales propiedades reconocidas de la ortiga es su efecto diurético, para que nos entendamos, las plantas diuréticas eliminan las toxinas de la sangre y a menudo aumentan temporalmente la secreción de orina. Para evitar riesgos, se desechan las semillas al realizar cualquier plato o infusión con ortiga. (Naturaleza educativa. Plantas medicinales. Recuperado el 4 de octubre de 2012, de http://www.natureduca.com/med_espec_ortigamayor.php) Justificación: Este proyecto se realizará porque hasta el momento no se ha estandarizado la técnica de cultivo in vitro en la Ortiga (Urtica urens L), también porque La planta ortiga es una planta conocida poco a pesar de sus grandes propiedades medicinales (estimulante de aparato digestivo y antidiarreica, hemostática, antiarteriosclerótica, antidiabética, anti anémica, galactogena, anti-prostática, Alzheimer, Diurético, Impotencia sexual, cosméticos, tratamiento capilar, ciática) En Colombia la aplicación del medio de cultivo in vitro es nulo para esta planta, pero por medio de cultivo en campo si se da, pero es muy costoso su mantenimiento a una gran escala por sus condiciones de cultivo, La aplicación en este país de a la ortiga es para materia prima de cosméticos, y productos medicinales sin embargo la producción es muy escasa por sus condiciones climáticas ya mencionadas. Esto principalmente fue lo que dio pie a la planeación de un proceso de propagación in vitro, mediante organogénesis directa, con los que se propagará la planta. Objetivos Objetivo general: Evaluar los reguladores de crecimiento ANA/BAP/KIN en el establecimiento in vitro de la planta ortiga (Urtica Urens L.) mediante organogénesis directa a partir de segmentos nodales Objetivos específicos: - Determinar la concentración de NaClO (hipoclorito de sodio) óptima para la desinfección de los segmentos nodales. Definir la concentración adecuada de los reguladores de crecimiento BAP y KIN en la fase de inducción en el medio de cultivo MS Estimar la concentración necesaria de los reguladores KIN Y BAP/ANA en la fase multiplicación.
  • 6. Marco teórico: La Urtica Urens L, más conocida como ortiga menor o picamoscas, es muy conocida por ser una hierba que nace mucho entre los escombros y el desorden, incluso se ha llegado a considerar como una plaga. Puede llegar a crecer entre 40- 60 cm también posee múltiples beneficios medicinales que la gente desconoce y además ha sido usada en varias investigaciones científicas de las cuales se habla en los antecedentes de este proyecto. Sus principales beneficios medicinales son         Analgésica Antialergica Antianémica Antigotosa Antiinflamatoria Antirreumática Astringente Diurética Esta planta es muy conocida por poseer unos pelos urticantes tanto en sus hojas como en su tallo, que tiene un efecto sobre la piel de los humano, estos pelos al mínimo roce inyecta un líquido el cual causa ronchas urticantes. La composición de esta planta no se conoce parcialmente, pero se conocen algunos, por ejemplo, en la raíz está compuesta por escopetrol, alcohol homovainillico, lignanos y en las partes aéreas está compuesta principalmente por hierro y silicio, ácidos fenoles y numerosos flavonoiles, los pelos urticantes contienen aminas (acetilcolina, histamina, serotonina). MICROPROPAGACION La micro propagación "in vitro" de plantas es una técnica que utiliza pequeños trozos de tejido o de órganos en condiciones asépticas, con el fin de conseguir nuevas plantas idénticas a la planta madre. Esto se consigue gracias a que las células de las plantas son "totipotentes", es decir, tienen una capacidad latente para regenerar una planta nueva a partir de una única célula, de manera que la nueva planta será genéticamente idéntica a la planta madre.
  • 7. El cultivo in vitro permite entre otras muchas cosas una rápida propagación vegetativa de las plantas, y una mejora del estado sanitario de las mismas. ORGANOGENESIS DIRECTA Cuando los órganos se originan directamente del ex planto (yema axilar) en ausencia de proliferación del callo, aunque normalmente es indirecta. La organogénesis directa (es decir sin la formación previa de callo) es altamente deseable en los trabajos de micro propagación y de conservación de germoplasma. La organogénesis directa consta de 6 procesos, cuatro de ellos en el laboratorio, estos son: - Establecimiento de plantas madres - Desinfección - Inducción - Multiplicación - Enraizamiento - Climatización Establecimiento del cultivo: El cultivo de tejidos comienza a partir de trozos extraídos de la planta madre. Estos pequeños órganos o trozos de tejido se llaman explantos. Las plantas que crecen en el medio natural están contaminadas por microorganismos (bacterias y hongos). Los explantos antes de ser introducidos en el medio de cultivo han de ser esterilizados. Posteriormente se introducirán en el medio a su vez estéril y se mantendrán allí en condiciones asépticas. Multiplicación: Una vez que la primera fase se ha completado con éxito, comienza la multiplicación de los explantos. El explanto encuentra en el medio de cultivo todo aquello que necesita para su crecimiento y desarrollo (agua, elementos minerales, azúcares, hormonas, etc). Tras un período de crecimiento (4-8 semanas) es necesario el subcultivo y paso a un nuevo medio. Es en este paso donde se produce la multiplicación de las plantas. AGAR Es una mezcla de polisacáridos extraídos de un alga marina. Tiene una elevada masa molecular, tiene la capacidad de hidratarse y formar una red. La planta no puede digerirlo ni adsorberlo, además no interactúa con los componentes nutritivos del medio.
  • 8. Enraizamiento: Antes de llevar las nuevas plantas al exterior es necesario proporcionarles una raíz con la que sean capaces de realizar sus actividades vitales una vez que se encuentren de nuevo en el medio natural. La inducción de estas raíces se produce modificando ligeramente las características del medio de cultivo adecuándolas para la generación de raíces. · Aclimatación: Esta fase consiste en el paso de las plantas del cultivo al medio natural. Este es un paso extremadamente importante, ya que si no se realiza cuidadosamente se pueden perder gran número de plantas. Las plantas en condiciones de cultivo están en una atmósfera con alta humedad y baja intensidad luminosa, por tanto el tejido epitelial se caracterizará por tener menos ceras que protejan a las plantas contra la deshidratación. El acondicionamiento de nuevo al medio exterior se efectuará por tanto cuidadosamente, utilizando para ello invernaderos. Aclimatación: Esta fase consiste en el paso de las plantas del cultivo al medio natural. Este es un paso extremadamente importante, ya que si no se realiza cuidadosamente se pueden perder gran número de plantas. Las plantas en condiciones de cultivo están en una atmósfera con alta humedad y baja intensidad luminosa, por tanto el tejido epitelial se caracterizará por tener menos ceras que protejan a las plantas contra la deshidratación. El acondicionamiento de nuevo al medio exterior se efectuará por tanto cuidadosamente, utilizando para ello invernaderos. Divididas en cinco fases: FASE 0: PREPARACIÓN DE LA PLANTA MADRE Para poder establecer el cultivo en condiciones de asepsia, se deben obtener explantos con un nivel nutricional y un grado de desarrollo adecuado. Para obtener estos explantos es recomendable mantener a las plantas madre un período de tiempo que puede oscilar entre unas semanas o varios meses, en un invernadero, en que se va a intentar cultivar la planta en condiciones sanitarias óptimas y con un control de la nutrición, del fotoperiodo y de la irradiancia recibida. FASE I: ESTABLECIMIENTO DEL CULTIVO EN CONDICIONES DE ASEPSIA Una vez escogida la planta madre, se extraerán los fragmentos a partir de los cuales se obtendrán los explantos. Antes de extraer los explantos se hará una desinfección de los fragmentos de planta madre para eliminar los contaminantes externos. Una vez desinfectado el material vegetal, se debe mantener en condiciones de asepsia. Ya en condiciones de asepsia (se trabajará en cabinas de flujo laminar) se extraerán los explantos del material vegetal y se pondrán en cultivo en un medio de iniciación dentro de un tubo de cultivo, para poder controlar la sanidad y la viabilidad de los explantos.
  • 9. FASE II: MULTIPLICACIÓN DE LOS BROTES Durante esta fase se espera que los explantos que sobrevivieron de la FASE I originen brotes (de procedencia axilar o adventicia) con varios entrenudos. Periódicamente estos nuevos brotes se deben subcultivar en un nuevo medio mediante divisiones y resiembras en tubos de cultivo u otros recipientes adecuados. Estas operaciones se realizan en la cámara de flujo laminar. FASE III: ELECCIÓN DE UN MEDIO DE ENRAIZAMIENTO DE LOS EXPLANTOS Para enraizar los explantos se utilizan principalmente dos métodos: ENRAIZAMIENTO IN VITRO Se transfieren los brotes obtenidos durante la fase de multiplicación a un medio libre de reguladores de crecimiento o que solo contenga auxinas. Esta operación se realiza en la cámara de flujo laminar. Este método permite ser mas flexible a la hora de escoger los brotes, ya que éstos obtienen del medio la fuente de energía para enraizar, y por tanto no es necesario que tengan las hojas muy bien desarrolladas para realizar la fotosíntesis. ENRAIZAMIENTO EX VITRO Los explantos se deben transferir a un sustrato limpio, aunque no necesariamente estéril, que puede ser una mezcla de turba con perlita o vermiculita. Con este método es necesario que el medio de enraizamiento esté libre de organismos patógenos y que los brotes tengan las hojas bien desarrolladas, ya que deben realizar fotosíntesis para que la planta tenga una fuente de energía para enraizar y desarrollarse. Los explantos deben de plantarse en contenedores cubiertos por un plástico, para mantener la humedad relativa elevada, y hacerlos enraizar en el laboratorio, o ponerlos en 'multipots' dentro de un invernadero en un área sombreada con "fog-system" o "mist-system". YEMAS AXILARES Las yemas auxiliares están situadas en los nudos de los tallos. De ellas salen las hojas y las flores. CONDICIONES ASEPTICAS Una de las características básica de este tipo de cultivos in vitro es la rigurosidad fitosanitaria necesaria para que los plantines lleguen a campo sin ser portadores de hongos, bacterias u otros agentes patógenos. Para lograr esto, se debe controla distintos aspectos relacionados a la micro
  • 10. propagación: condiciones del ambiente del laboratorio; esterilización del medio de cultivo, tubos de ensayo, recipientes y las herramientas de trabajo; desinfección de los explantes; respetar y cumplir con las normas de higiene y asepsia, etc. El proceso se realiza en condiciones extremas de desinfección, endógenas y exógenas, por tal razón las instalaciones fueron especialmente diseñadas y construidas para una mejor climatización. MEDIO DE CULTIVO El medio de cultivo es la combinación sólida o líquida de nutrientes y agua. Usualmente incluye sales inorgánicas, carbohidratos y vitaminas y aminoácidos. A menudo se denomina Medio Basal y puede ser suplementado con algún regulador de crecimiento y ocasionalmente con otras sustancias varias. Los nutrientes son esenciales para el crecimiento y desarrollo de la planta: sin agua y nutrientes minerales una planta no puede vivir ni in vitro ni in vivo. También se debe añadir azúcares al medio de cultivo, ya que las plantas (o sus fragmentos) no son completamente autotróficas cuando se desarrollan en estas condiciones. El medio de cultivo debe ser rico en elementos minerales, en particular el potasio debe estar en un nivel alto para una mejor multiplicación vegetativa; desde este punto de vista, el medio Murashige y Skoog es conveniente. EL MEDIO MS, O DE MURASHIGE Y SKOOG Es muy usado, particularmente si el objetivo es regenerar plantas; existen numerosas variaciones comerciales de este medio. El medio B5 o de Gamborg et al. (1968), o sus varios derivados, ha sido de un gran valor en el cultivo de células y protoplastos, y también es utilizado eficazmente en regeneración de plantas. La diferencia principal entre los medios MS y B5 es la menor concentración de nitratos en B5. El medio WPM (1980) de baja concentración de sales está especialmente indicado para especies leñosas. Esto nos lleva a ver de que está compuesto un medio de cultivo Carbohidratos Normalmente para el cultivo in vitro de células, tejidos u órganos es necesario adicionar una fuente de carbono en el medio, debido a que el crecimiento in vitro tiene lugar en condiciones poco apropiadas para la fotosíntesis o incluso en oscuridad. La sacarosa es la más utilizada para propósitos de micro propagación. Generalmente se usan concentraciones de 1 -6% de sacarosa en el medio, aquí es convertida rápidamente en glucosa y fructosa; la glucosa es la que primero se utiliza seguida de la fructosa. El azúcar blanco refinado que se vende en los supermercados puede resultar adecuado para la micro propagación en muchos casos. Se trata de un producto purificado y de acuerdo con los análisis se compone de 99,94% de sacarosa, 0,02% de agua y 0,04% de otras sustancias (no hay indicaciones de que estos últimos constituyentes puedan causar toxicidad in vitro).
  • 11. Vitaminas La mayor parte de las plantas sintetizan casi todas las vitaminas esenciales, pero aparentemente lo hacen en cantidades infraóptimas. Para lograr un buen crecimiento es necesario a menudo suplementar al medio con una o más vitaminas. La tiamina (B1) es la que más se utiliza y se la considera un ingrediente esencial. Otras vitaminas también han demostrado tener un efecto positivo en el crecimiento in vitro, como son: pidiroxina (B6), ácido nicotínico (B3), pantotenato cálcico (B5). Aminoácidos Aunque las células cultivadas son capaces de sintetizar todos los aminoácidos necesarios, la adición de L-glutamina (2 - 8 mM) o una mezcla de aminoácidos es a menudo beneficiosa. Esto es particularmente importante en cultivo de células y protoplastos. REGULADORES DE CRECIMIENTO Sustancia orgánica que favorece o inhibe los procesos celulares de división, alargamiento, proliferación de los vegetales. Sustancias químicas, naturales o sintéticas, que controlan el crecimiento de plantas, activándolo como las fitohormonas (auxina, giberelinas) o inhibiéndolo (inhibinas).  Fitohormonas: AUXINAS Se relacionan con la elongación, tropismo, dominancia apical, abscisión, enraizamiento y otros. En cultivo in vitro las auxinas son utilizadas principalmente para la diferenciación de raíces y la inducción de callo. Las auxinas más utilizadas son: IBA (ácido indol-3-butírico), NAA (ácido naftalenacético), IAA (ácido indolacético) y 2,4-D (ácido diclorofenoxiacético). El IBA y el NAA son usados frecuentemente para enraizamiento. El 2,4-D es muy efectivo para la inducción de callos. Las auxinas se disuelven usualmente en etanol diluido o en una solución de hidróxido de sodio. CITOQUININAS Están implicadas en la división celular, modificación de la dominancia apical, diferenciación de tallos y otros. En los medios para cultivo in vitro se incorporan citoquininas para promover la división celular y la inducción de yemas adventicias en callos y órganos. Además se usan estos compuestos para la proliferación de tallos axilares por la ruptura de la dominancia apical. Las citoquininas más usadas son: BAP (bencilamino purina), quinetina y 2-ip (isopentenil-adenina). Generalmente son diluidas con ácido clorhídrico o hidróxido de sodio.
  • 12. GIBERELINAS Existen multitud de giberelinas conocidas. La de mayor uso es el GA3, pero debe tenerse en cuenta que es muy sensible al calor (pierde el 90% de su actividad después del auto clavado). Comparado con las auxinas y citoquininas, las giberelinas se utilizan raramente. La mayoría de los explantos sintetizan cantidades suficientes de este grupo de hormonas. Cuando se aportan giberelinas al medio de cultivo, su función principal es el alargamiento de las regiones subapicales. El GA3 es soluble en agua fría hasta 1000 mg l-1. ANA Estas hormonas favorecen el enraizamiento, ya que estimulan la aparición de nuevas raíces, aunque inhiben su alargamiento. Algunos estudios han demostrado que la estimulación del crecimiento vegetativo, que es la principal característica de las auxinas, puede derivar en inhibición si se eleva la frecuencia de aplicación o se supera el nivel adecuado para cada caso (sobredosis). Se producen en zonas meristematicas, embriones de nuevas plántulas, hojas verdaderas, semillas inmaduras. ¿Cómo actúan? Dominancia apical Desarrollo en elongación de ramas Produce división celular Activa el desarrollo de yemas Favorece la floración Retrasa la caída de hojas y frutos KINETININA (KIN) furfurilaminopurina (kinetina) es un regulador del crecimiento vegetal tipo citoquinina. Aplicación Utilizado en la agricultura. 6-furfurilaminopurina (kinetina) puede promover la división celular, diferenciación y el crecimiento, y Además mejorar la germinación y el conjunto de frutas, induciendo la iniciación de los callos, reduciendo la dominancia apical, rompiendo la dormancia de las yemas laterales, y retrasando el envejecimiento. Especificaciones Apariencia: Blanco cristalino Ensayo: 99% Pérdida por desecación: 0.5% Residuo en la ignición: 0.05% FNF es el fabricante y proveedor de 6-furfurilaminopurina (kinetina) en China. Ofrecemos 6-furfurilaminopurina (kinetina), y Fosfato Diamónico, Sulfato ferroso monohidratado. Nuestros productos de alta calidad se ofrecen a precios
  • 13. competitivos. FNF está ubicado en China, y la cadena completa de fabricación del Cloruro de calcio anhidro, Ácido cítrico monohidrato, puede ser completado en China, inclusive en una misma ciudad. Menor es el costo de fabricación mayor será el ahorro de su compra. Más detalles sobre cada producto se indican en la página con su descripción. (9) Diseño metodológico Establecimiento de las plantas madres: 16 plántulas de ortiga, las cuales se llevaron a un lugar adecuado para su sostenimiento, ahí se multiplicaron por medio de esquejes, para poder establecer una gran cantidad de plantas madre. Las plantas fuer controladas en cuanto, plagas, humedad, temperatura. Desinfección: Primero se cortaron los segmentos nodales para luego lavarlos con agua corriente, para retirar restos de tierra u otras partículas. Luego se introdujeron los segmentos nodales en etanol al 70% por no más de 5 segundos para luego dejarse evaporar. Después de este proceso se sumergieron los segmentos nodales en una solución de hipoclorito de sodio en distintas concentraciones (Ver tabla 1.1) donde se dejaron 1, 2 y 3 minutos en distintas pruebas. Seguido se enjuagaron los segmentos nodales con agua esterilizada 4 veces. PRUEBAS DE DESINFECCION EN LA ORTIGA (URTICA URENS L.) Tratamientos NaClO (hipoclorito Repeticiones HONGOS BACTERIAS QUEMADURAS de sodio) mg/l 1 0,00 3 2 0,5 3 3 1 3 4 1,5 3 5 2 3 Tabla 1.1 Inducción: En esta fase se empezará por preparar la composición del medio de cultivo (MS) en el cual se probarán distintas concentraciones de reguladores de crecimiento los cuales van a ser Furfurilaminopurina (Kinetina) y Benzil Aminopurina (BAP) (ver tabla 1.2.1 y tabla 1.2.2). Las concentraciones de vitaminas, sales y carbohidratos no serán modificados, se usaran las concentraciones del medio de cultivo (MS). Se utilizará el gelificante agar en una concentración de 0,6 - 1%. PRUEBAS DE INDUCCIÓN EN LA ORTIGA (URTICA URENS L.) Tratamienos KIN (KINETINA) Repeticiones NÚMERO mg/L DE BROTES 1 0,00 3 2 0,5 3
  • 14. 3 4 5 1 1,5 2 3 3 3 Tabla 1.2.1 PRUEBAS DE INDUCCIÓN EN LA ORTIGA (URTICA URENS L.) Tratamientos BAP mg/L Repeticiones NÚMERO DE BROTES 1 0,00 3 2 0,5 3 3 1 3 4 1,5 3 5 2 3 Tabla 1.2.2 Multiplicación: En esta fase se probarán distintas concentraciones del regulador de crecimiento ANA (Ácido Naftilacético) con el que estadísticamente obtenga un mejor tenga resultado en la fase de inducción (X1) (ver tabla 1.3) PRUEBAS DE MULTIPLICACIÓN EN LA ORTIGA (URTICA URENS L.) Tratamientos Unidades de Repeticiones NÚMERO concentración DE ANA/X1 mg/L BROTES 1 2 3 4 5 Tabla 1.3 0,00 0,5 1 1,5 2 3 3 3 3 3 Enraizamiento Para esta fase del proceso para poder enraizar los explantes después de haber pasado por cada una de las anteriores fases. Se utilizan principalmente vitro plantas individuales de un tamaño aproximado de 2 cm. Los brotes obtenidos durante la fase de multiplicación se pasaran a un medio libre de reguladores de crecimiento o que solo contenga hormonas del tipo de las auxinas (BAP) en diferentes concentraciones Donde se evaluará la longitud y el número de raíces que broten de dicho explante.
  • 15. PRUEBAS DE ENRAIZAMIENTO EN LA PLANTA ORTIGA (urtica urens L.) Tratamientos Unidades de Repeticiones NÚMERO LONGITUD concentración DE RAICES DE ANA BROTADAS RAICES 1 2 3 4 5 0,00 0,5 1 1,5 2 3 3 3 3 3 RESULTADOS Y CONCLUSIONES: Resultados esperados: Debido al comportamiento del material biológico las fases de inducción está en experimentación, esperamos poder obtener diferencias significativas entre los tratamientos planteados al igual que en la etapa de multiplicación, enraizamiento y aclimatización. Estas fases serán realizadas por nuestros compañeros del grado noveno que pertenecen al proyecto. Esperamos estandarizar la técnica del cultivo in vitro para ortiga menor y así poder trabajar en otras fases posteriores en la obtención directa de metabolitos secundarios y proponer el cultivo de ortiga como una alternativa para los agricultores del país, así como también otra alternativa para los campesinos que pertenecen a los programas estatales de sustitución de cultivos ilícitos. Resultados obtenidos: Este año (2013) Se comenzó con la primera fase del proyecto, de acuerdo con los ensayos que se hicieron de desinfección se obtuvieron los siguientes resultados: Ensayo # 1: Con respecto a la contaminación, el mayor porcentaje se observó en el tratamiento control (T0) con un 100 % de contaminación, seguido de tratamiento T2 (1,0% NaOCl) 75%, los mejores resultados se obtuvieron en los tratamientos T1 (0,5% NaOCl) con 12,5 %, T3 (1,5% NaOCl) con 25%, y T4 (2,0% NaOCl) 25%. En la necrosis de los tejidos se presentaron datos similares con valores que superan el 65%. Ensayo # 2: El tratamiento T2 (1,0% NaOCl) presento el menor porcentaje de contaminación (25%), mientras que los demás presentaron valores superiores al 50%. Con respecto a la necrosis de los explantes T1 presento el mejor resultado con 37%, seguido de T3 y T4 con 50% y los tejidos donde más se observó este fenómeno fueron los tratamiento T0,T2 con valores de 66,6% y 75 % respectivamente. Ensayo # 3: Todos los tratamientos muestran porcentajes de contaminación superiores al 50%. Los tratamiento T0,T2 y T4 obtuvieron un 33% de necrosis y T1 y T3 un 50%.
  • 16. El promedio de los porcentajes de contaminación de todos los ensayos mostro que los mejores resultados para los tratamientos T3 y T4 los cuales presentan las concentraciones más elevadas de NaOCl , mientras que la necrosis presento resultados muy similares para todos los tratamientos. Por la semejanza de los resultados se consideró no aplicar la prueba de análisis de varianza, que es la más adecuada para establecer si hay diferencias significativas en los tratamientos, estadísticamente hablando. Conclusiones: El promedio de los porcentajes de contaminación de todos los ensayos mostro que los mejores resultados para los tratamientos T3 y T4, los cuales presentan las concentraciones más elevadas de NaOCl, mientras que la necrosis presento resultados similares para todos los tratamientos. Los resultados que se obtuvieron con respecto a la desinfección y a la necrosis fueron muy similares, ya que el NaOCl en cada una de las concentraciones que se establecieron necroso los explantes, esto pudo deberse a que el NaOCl actúo como un agente toxico, penetra los tejidos del explante elimina algunos patógenos como gonfos y bacterias, pero a la vez llega hasta las células y esto produce necrosis.
  • 17. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS: 1. (Naturaleza educativa. Plantas medicinales. Recuperado el 4 de octubre de 2012, de http://www.natureduca.com/med_espec_ortigamayor.php) 2. (Plantas vasculares. Medellín, 4 de octubre de 2012 inbuy.fcien.edu.uy/fichas_de.../Urtica_urens_i.pdf) 3. (Naturaleza educativa. Plantas medicinales. Recuperado el 4 de octubre de 2012, de http://www.natureduca.com/med_espec_ortigamayor.php) 4. (Beth Israel Deaconess Medical Center. Ortiga. Recuperado el 4 de octubre de 2012, de http://www.bidmc.org/YourHealth/ConditionsAZ.aspx?ChunkID=125088) 5. (Vive la naturaleza. ortiga (Urtica urens) Plantas medicinales, comestibles y útiles para aventureros y excursionistas. Recuperado el 4 de octubre de 2012, de http://www.vivelanaturaleza.com/botanica/ortiga.php) 6. (Raul Navalmanzo, clasificación taxonómica, tomado el 27/09/12 de la pagina (“http://navalmanzano.blogspot.com/2009/05/urtica-urens-ortigamenor.html”) 7. (HiperNatural, Ortiga recuperado el 27 de septiembre de 2012 de http://www.hipernatural.com/es/pltortiga.html) 8. (Morfología de las plantas vasculares, yemas. Recuperado el día 27 de septiembre de 2012 de http://www.biologia.edu.ar/botanica/tema1/13yemas.htm) 9. Furfurilaminopurina (kinetina), productos. Recuperado el día 03 de abril de 2013 de http://www.fertilizer.es/8-10-6-furfurylaminopurine.html AGRADECIMIENTOS: Gracias a la I. E. Colegio Loyola para la ciencia y la innovación por su acompañamiento, y por inculcarnos la investigación como estilo de vida. A los docentes acompañantes, al programa Ondas por su ayuda en el año 2012, a la fundación Loyola, el Sena y a la Secretaria de Educación