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Cotinus coggygria          Anacardiaceae,         chiamato          anche Sommacco selvatico,          Scotano, Albero del...
DistribuzioneAmpia distribuzione nelle zone piùmeridionali   del     Mediterraneo,penisola balcanica e nelle regioni delCe...
Importanza e utilizzo Foglie, inforescenze, frutti e tronco rientrano per secoli nelle preparazioni della medicina tradizi...
Proflo FitochimicoClassi fcazione     deimetaboliti    secondaripresenti nel legno delCotinus c. fno ad oraconosciuti:Flav...
Proflo Fitochimico    Flavonoidi e derivati                                                     •   Eriodictiolo•   7,3,4-...
Attività antinfammatoria    Legno del fusto di Cotinus coggygria
Attività antinfammatoria    Legno del fusto di Cotinus coggygria                     ↓            Estratto metanolico
Attività antinfammatoria    Legno del fusto di Cotinus coggygria                     ↓            Estratto metanolico     ...
Attività antinfammatoria        Legno del fusto di Cotinus coggygria                         ↓                Estratto met...
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Attività antinfammatoria   Sulfuretina e Fustina (sostanze pure)
Attività antinfammatoria      Sulfuretina e Fustina (sostanze pure)                       ↓Saggio per via orale delledema ...
Attività antinfammatoria         Sulfuretina e Fustina (sostanze pure)                                                    ...
Scopo dello studioSviluppare lindagine ftochimica sulla frazione dietilacetato per identifcare i composti responsabili    ...
Scopo dello studio   Sviluppare lindagine ftochimica sulla frazione di   etilacetato per identifcare i composti responsabi...
Scopo dello studio   Sviluppare lindagine ftochimica sulla frazione di   etilacetato per identifcare i composti responsabi...
Isolamento
Composti isolati               D4 – D9 – D11           (Sephadex con MeOH puro → HSCCC)Fustina           Sulfuretina-6-O-β...
Composti isolati    D4 – D9 – D11
Composti isolati                                 F5 - S9             (F5: Sephadex MeOH puro → Sephadex MeOH/H₂O → HSCCC; ...
Composti isolati                                    I2   (Sephadex con MeOH puro → HSCCC → Sephadex con MeOH puro)Fraction...
Composti isolati                             N4   (Sephadex con MeOH puro → HSCCC → Sephadex con MeOH puro)Fraction       ...
Composti isolati                                      P2     (Sephadex con MeOH puro → HSCCC → 2 Sephadex simultanee con M...
Composti isolati                      Q11    (Sephadex con MeOH puro → HSCCC → LOBAR)Pentagalloil-O-β-D-glucosio
Confronto con composti di                                   riferimento              O             OH                     ...
Confronto con composti di                              riferimento                                            (+/-) catech...
Confronto con composti di                                riferimento                O              O              Metilest...
Confronto con composti di                   riferimento                         Fisetinidol-(4α→8)-(+)-catechina          ...
Confronto con composti di                 riferimento                        Epifsetinidol-(4β→8)-(+)-catechina           ...
Confronto con composti di                 riferimento                                      Sulfuretina                    ...
Overview1- acido gallico; 2- (+/-)catechina; 3- metilestere dellacido gallico; 4- fisetinidol-(4α→8)-(+)-catechina; 5- epi...
MetodiVacuum-liquid ChromatographyThin Layer Chromatography (TLC)Sephadex column chromatographyHigh Pressure Liquid Chroma...
HSCCCSpirale elicoidale in materiale inerteRotazione planetaria ed eccentricaZone di miscelazione e zone di depositoche av...
Discussione             Attività plausibile dei composti isolatiFisetinidol-(4α→8)-(+)-catechina                 Procianid...
Discussione                                   Esteri dellacido gallico                                            O       ...
Discussione                      Eriodictiol-7-O-β-D-glucosideInibitore della produzione di ossido nitrico (NO) e prostagl...
Discussione          Sulfuretina-6-O-β-D-glucoside (sulfureina)Attività anti-allergica tramite inibizione della produzione...
ConclusioneIsolamento, purifcazione e identifcazione della maggior parte dei costituenti              della frazione di et...
Grazie per lattenzione
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Cotinus coggygria

  1. 1. ALMA MATER STUDIORUM – UNIVERSITA DI BOLOGNA LEOPOLD-FRANZENS UNIVERSITÄT INNSBRUCK Facoltà di Farmacia Corso di Laurea in Chimica e Tecnologia Farmaceutiche Phytochemical characterization of the ethyl acetate soluble fraction of wood extract of Cotinus coggygria Relatore: Dr.ssa Ester Speroni Co-Relatore: Univ. Prof. Dr. Hermann Stuppner Presentata da: Valentina Masi Matricola: 0000254734
  2. 2. Cotinus coggygria Anacardiaceae, chiamato anche Sommacco selvatico, Scotano, Albero della nebbia Morfologia: Arbusto caducifoglio, globoso, alto 0,3-4 m, con odore resinoso; radici molto robuste e capaci di insinuarsi profondamente tra rocce; rami prostrato-ascendenti, sottili; rametti dellanno dapprima verdi-lucidi, poi rossastri- bruni; corteccia scabra, sottilmente screpolata, color terra con macchie chiare; legno verde chiaro con midollo scuro e con odore di trementina al taglio; gemme subsessili, piccole, appuntite, scure. Foglie semplici alterne, ovali-ellittiche o subrotonde, ottuse, glabre, a margine intero, con picciolo, glauche ed opache su ambedue le pagine, colore virante al giallo-arancio fno al rosso-carminio. Fiori giallo-verdastri in pannocchie lasse ed irregolari terminali (10-20 cm), molto piccoli, su peduncoli gracili e piumosi (ad antesi conclusa) per peli rosei, in gran parte sterili. Frutti drupacei secchi, a forma di cuore (o di pera), rugosi, radi, di 3-4 mm.
  3. 3. DistribuzioneAmpia distribuzione nelle zone piùmeridionali del Mediterraneo,penisola balcanica e nelle regioni delCentro e del Sud-Ovest asiatico.In Italia cresce spontaneamente nelcentro-nord (eccetto Val dAosta), conesclusione di tutto il meridione e leisole.Preferenza per zone asciutte ecalcaree, fno ad unaltitudine di 900m.Spesso coltivato nei giardini perle fetto decorativo di foglie einfruttescenze.
  4. 4. Importanza e utilizzo Foglie, inforescenze, frutti e tronco rientrano per secoli nelle preparazioni della medicina tradizionale (in particolare bulgara e cinese) per la cura di: Ferite dalla guarigione difcile Lesioni dei tessuti delle mucose Alterazioni del sistema epatobiliare Ulcera gastrica e duodenale Diarrea Infammazioni Paradontite Emorroidi Estratto attivo contro: Infezioni da E. coli, Staphylococcus aureus and S. cerevisiae Cancro
  5. 5. Proflo FitochimicoClassi fcazione deimetaboliti secondaripresenti nel legno delCotinus c. fno ad oraconosciuti:Flavonoidi e derivati Flavoni Isofavoni Auroni CalconiAcido gallico ederivati
  6. 6. Proflo Fitochimico Flavonoidi e derivati • Eriodictiolo• 7,3,4-triidrossi-diidrofavone • Fisetina• 5,7,4-triidrossi-diidrofavone • Quercetina• 3,7,3,4-tetraidrossi-diidrofavone • Buteina• 3,5,7,3,4-pentaidrossi-diidrofavone • Disulfuretina {2,2-[1,2-bis(3,4-• Isoliquiritigenina (4,2,4-triidrossicalcone) diidrossifenil)-1, 2-etanedilidene]bis-[6-• Fisetina (3,7,3,4-tetraidrossifavone) idrossi-3(2H)-benzofuranone]}• C-3/C-3 dimero della butina (3,4,7- • Sulfuretina (6,3,4-triidrossiaurone) triidrossifavanone) • Sulfureina• Catechina• Fisetinidol-(4α→8)-(+)-catechina Acido gallico e derivati• Epifsetinidol-(4β→8)-(+)-catechina• Fustina • Acido gallico• Diidroquercetagetina • Metil gallato• Butina • Penta- galloil glucosio
  7. 7. Attività antinfammatoria Legno del fusto di Cotinus coggygria
  8. 8. Attività antinfammatoria Legno del fusto di Cotinus coggygria ↓ Estratto metanolico
  9. 9. Attività antinfammatoria Legno del fusto di Cotinus coggygria ↓ Estratto metanolico ↓ Frazione di etilacetato
  10. 10. Attività antinfammatoria Legno del fusto di Cotinus coggygria ↓ Estratto metanolico ↓ Frazione di etilacetato ↓ Saggio per via orale delledema di zampa di ratto
  11. 11. Attività antinfammatoria Legno del fusto di Cotinus coggygria ↓ Estratto metanolico ↓ Frazione di etilacetato ↓ Saggio per via orale delledema di zampa di ratto ↓ Inibizione delledema del 34 - 57 %
  12. 12. Attività antinfammatoria Legno del fusto di Cotinus coggygria ↓ Estratto metanolico ↓ Frazione di etilacetato ↓ Saggio per via orale delledema di zampa di ratto ↓ Inibizione delledema del 34 - 57 % Ethyl acetate fraction 0.75 CTRL; n=18 difference volume [mL] 100 mg/kg; n=3 0.50 200 mg/kg; n=3 0.25 0.00 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 time [h]
  13. 13. Attività antinfammatoria Sulfuretina e Fustina (sostanze pure)
  14. 14. Attività antinfammatoria Sulfuretina e Fustina (sostanze pure) ↓Saggio per via orale delledema di zampa di ratto
  15. 15. Attività antinfammatoria Sulfuretina e Fustina (sostanze pure) ↓ Saggio per via orale delledema di zampa di ratto ↓Inibizione delledema non signifcativa (16 – 23 %) Pure substances 0.75 CTRL; n=18 Sulfuretin 200 mg/kg; n=3 difference volume [mL] 0.50 Fustin 100 mg/kg; n=3 0.25 0.00 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 time [h]
  16. 16. Scopo dello studioSviluppare lindagine ftochimica sulla frazione dietilacetato per identifcare i composti responsabili dellattività farmacologica
  17. 17. Scopo dello studio Sviluppare lindagine ftochimica sulla frazione di etilacetato per identifcare i composti responsabili dellattività farmacologica Identifcazione Isolamento edelucidazione strutturale
  18. 18. Scopo dello studio Sviluppare lindagine ftochimica sulla frazione di etilacetato per identifcare i composti responsabili dellattività farmacologica Identifcazione Isolamento e Confronto condelucidazione strutturale composti di riferimento
  19. 19. Isolamento
  20. 20. Composti isolati D4 – D9 – D11 (Sephadex con MeOH puro → HSCCC)Fustina Sulfuretina-6-O-β-D-glucoside (Sulfureina) Eriodictiol-7-O-β-D-glucoside
  21. 21. Composti isolati D4 – D9 – D11
  22. 22. Composti isolati F5 - S9 (F5: Sephadex MeOH puro → Sephadex MeOH/H₂O → HSCCC; S9: Sephadex MeOH puro → Sephadex MeOH puro → LOBAR)1,2,3,6-tetragalloil-O-β-D-glucosio
  23. 23. Composti isolati I2 (Sephadex con MeOH puro → HSCCC → Sephadex con MeOH puro)Fraction Combined tubes Yield (mg) I1 1-20 28.20 I2 21-27 11.09 I3 Washing 24.30 Basso rendimento Campione contentente troppe impurità ↓ Struttura assegnata tramite confronto di spettri UV e MS ↓ Trigalloil-O-β-D-glucosio
  24. 24. Composti isolati N4 (Sephadex con MeOH puro → HSCCC → Sephadex con MeOH puro)Fraction Combined tubes Yield (mg) N1 1-13 3.42 N2 14-18 7.16 N3 19-20 7.41 N4 21-28 78.88 N5 29-44 36.95 N6 Washing 4.59 Basso rendimento Campione contenente troppe impurità ↓ Analisi NMR non praticabile
  25. 25. Composti isolati P2 (Sephadex con MeOH puro → HSCCC → 2 Sephadex simultanee con MeOH puro → 2 Sephadex consecutive con MeOH puro)Sulfuretina-6-O-β-D-glucoside-6’’-gallato (= sulfureina-6’’-gallato)
  26. 26. Composti isolati Q11 (Sephadex con MeOH puro → HSCCC → LOBAR)Pentagalloil-O-β-D-glucosio
  27. 27. Confronto con composti di riferimento O OH Acido gallico -MS, -Spectral Bkgrnd, 3.7min #124 8000 168.8 6000 4000 2000 296.9 1416.7 437.8 246.8 499.7 542.9 610.9 793.9 HO OH 1031.5 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z OHmAU500400 Norm.300 1200 3.795200 1000100 0 800 5 10 15 20 25 30 35 40 45 minmAU 3.718 600500400 400300 200200100 0 0 200 250 300 350 400 450 500 550 nm 5 10 15 20 25 30 35 40 45 min
  28. 28. Confronto con composti di riferimento (+/-) catechina x10 4 -MS, -Spectral Bkgrnd, 6.1min #202 2 288.9 1 182.8 136.8 356.9 402.9442.5 504.8 579.8 649.1 792.8 1475.4 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z x10 4 +MS, -Spectral Bkgrnd, 6.0min #201 6 291.1 4 2 475.3 139.2 233.6 407.3 541.9 619.1 665.9 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 m/zmAU500400300 Norm.200 1000 6.548100 800 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 minmAU 600 6.480 60 50 400 40 30 200 20 10 0 0 200 250 300 350 400 450 500 550 nm 5 10 15 20 25 30 35 40 45 min
  29. 29. Confronto con composti di riferimento O O Metilestere dellacido gallico CH3 x10 5 -MS, -Spectral Bkgrnd, 6.5min #216 2 182.8 1 296.8 366.8 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z HO OH x10 5 +MS, -Spectral Bkgrnd, 6.5min #217 185.1 1.5 OH 1.0 0.5 153.1 475.3 534.6 0.0 200 400 600 800 1000 1200 1400 m/zmAU500 mAU400 1200300 1000200 6.824100 800 0mAU 5 10 15 20 25 30 35 40 45 min 600 6.659 500400 400300 200200 0100 200 250 300 350 400 450 500 550 nm 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 min
  30. 30. Confronto con composti di riferimento Fisetinidol-(4α→8)-(+)-catechina x105 -MS, -Spectral Bkgrnd, 9.2min #308 0.75 561.1 0.50 0.25 302.9 0.00 200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z x10 5 +MS, -Spectral Bkgrnd, 9.3min #309 2 563.1 1 411.1 273.0 633.0 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 m/zmA U500400300 mAU 1400 10.035200100 1200 0 1000 5 10 15 20 25 30 35 40 45 min 9.973mA U 50 800 40 600 30 400 20 200 10 0 0 200 250 300 350 400 450 500 550 nm 5 10 15 20 25 30 35 40 45 min
  31. 31. Confronto con composti di riferimento Epifsetinidol-(4β→8)-(+)-catechina x10 5 -MS, -Spectral Bkgrnd, 10.9min #362 1.5 561.1 1.0 0.5 634.9 0.0 200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z x105 +MS, -Spectral Bkgrnd, 10.8min #361 4 563.2 3 2 1 411.1 273.2 467.0 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 m/zmAU500400 mA U300 11.561200 800100 0 600 5 10 15 20 25 30 35 40 45 min 11.465mAU 80 400 70 60 200 50 40 30 0 20 200 250 300 350 400 450 500 550 nm 10 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 min
  32. 32. Confronto con composti di riferimento Sulfuretina x10 5 -MS, -Spectral Bkgrnd, 32.2min #1072 0.75 268.9 0.50 0.25 336.7 382.8 538.8 0.00 200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z x10 5 +MS, -Spectral Bkgrnd, 32.2min #1071 271.0 2 1 562.9 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 m/zmAU500400300 mAU200 32.274 700100 600 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 min 500 32.251mAU175 400150 300125 200100 100 75 50 0 25 200 250 300 350 400 450 500 550 nm 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 min
  33. 33. Overview1- acido gallico; 2- (+/-)catechina; 3- metilestere dellacido gallico; 4- fisetinidol-(4α→8)-(+)-catechina; 5- epifisetinidol-(4β→8)-(+)-catechina; 6-fustina; 7- eriodictiol-7-O-β-D-glucoside; 8-1,2,3,6-tetragalloil-O-β-D-glucosio; 9- sulfuretina-6-O-β-D-glucoside (sulfureina); 10- pentagalloil-O-β-D-glucosio; 11-sulfuretina-6-O-β-D-glucoside-6’’-gallato (sulfureina-6’’-gallato);12- sulfuretina
  34. 34. MetodiVacuum-liquid ChromatographyThin Layer Chromatography (TLC)Sephadex column chromatographyHigh Pressure Liquid Chromatography (HPLC)Preparative LOBAR® systemMass spectrometryNuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR)High Speed Counter Current Chromatography (HSCCC)
  35. 35. HSCCCSpirale elicoidale in materiale inerteRotazione planetaria ed eccentricaZone di miscelazione e zone di depositoche avanzano ad altissima velocità ↓Eliminazione supporti solidi ↓Recupero di campione vicino al 100%
  36. 36. Discussione Attività plausibile dei composti isolatiFisetinidol-(4α→8)-(+)-catechina Procianidine dimeriche Inibitori del legame NF-kB al DNAEpifsetinidol-(4β→8)-(+)-catechina
  37. 37. Discussione Esteri dellacido gallico O OH HO OH OH Inibitori dellattivazione di NF-kB indotta da citochineRiduttori dellespressione delle molecole di adesione endotelio-leucociti nelle cellule in coltura
  38. 38. Discussione Eriodictiol-7-O-β-D-glucosideInibitore della produzione di ossido nitrico (NO) e prostaglandina E 2 (COX-2) Inibitore della crescita di promastigoti di Leishmania Braziliensis e di epimastigoti di Tripanosoma Cruzi
  39. 39. Discussione Sulfuretina-6-O-β-D-glucoside (sulfureina)Attività anti-allergica tramite inibizione della produzione di istamina
  40. 40. ConclusioneIsolamento, purifcazione e identifcazione della maggior parte dei costituenti della frazione di etilacetato di Cotinus coggygria Primo passo nella razionalizzazione del potenziale antinfammatorio delle preparazioni di Cotinus coggygria
  41. 41. Grazie per lattenzione

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